Mesures FLIM-FRET des interactions protéines-protéines chez les bactéries vivantes.

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour caractériser les interactions protéine-protéine entre deux protéines fortement exprimées différemment dans pseudomonas aeruginosa vivants utilisant des mesures de FLIM-FRET. Le protocole comprend les constructions de souches bactériennes, l’immobilisation des bactéries, l’imagerie et les routines d’analyse des données post-imagerie.

Résumé

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules. La microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) combinée au transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) fournissent des informations précises sur les IPP dans les cellules vivantes. FLIM-FRET s’appuie sur la mesure de la désintégration à vie par fluorescence d’un donneur fret à chaque pixel de l’image FLIM, fournissant des informations quantitatives et précises sur les IPP et leurs organisations cellulaires spatiales. Nous proposons ici un protocole détaillé pour les mesures FLIM-FRET que nous avons appliqué pour surveiller les IPP en direct Pseudomonas aeruginosa dans le cas particulier de deux protéines en interaction exprimées avec des numéros de copie très différents pour démontrer la qualité et la robustesse de la technique à révéler les caractéristiques critiques des IPP. Ce protocole décrit en détail toutes les étapes nécessaires à la caractérisation ppi - à partir de constructions mutantes bactériennes jusqu’à l’analyse finale à l’aide d’outils récemment développés offrant des possibilités avancées de visualisation pour une interprétation simple des données complexes FLIM-FRET.

Introduction

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules¹. Les rôles des IPP diffèrent en fonction de la composition protéique, des fonctions d’affinités et des emplacements dans les^{cellules 2}. Les IPP peuvent être étudiés au moyen de différentes techniques³. Par exemple, la co-immunoprécipitation est un outil relativement simple, robuste et peu coûteux couramment utilisé pour identifier ou confirmer les IPP. Toutefois, l’étude des IPP peut s’avérer difficile lorsque les protéines en interaction ont de faibles niveaux d’expression ou lorsque les interactions sont....

Protocole

1. Construction plasmide

1. Amplifier par deux PCR (PCR1 et 3) les séquences d’ADN (utiliser l’ADN génomique de P. aeruginosa PAO1) des 700 paires de base en amont et en aval des régions correspondant au site d’insertion dans le génome de P. aeruginosa avec polymése d’ADN haute fidélité. Ajouter des sites de restriction aux amorces en bleu et vert et ajouter une séquence qui se chevauche avec mCherry aux amorces en rouge( Figure 2).
   1. Pour le PvdA étiqueté au C-terminus avec eGFP, amplifiez la région de 700 bp en amont par rapport au codon d’arrêt par les amorces en bleu, et amplifiez la région aval de 700 b....

Résultats

Les fonctions cumulatives empiriques de distribution (ecdf) des durées de vie de fluorescence mesurées pour les différentes souches bactériennes sont indiquées à la figure 8. Si fret se produit, les ecdfs sont déplacés vers les durées de vie plus courtes(figure 8A,8B). Notez que lorsque l’interaction des deux protéines entraîne une longue distance entre les deux fluorophores, aucun FRET ne peut se produire (Figure 8C

Discussion

FLIM-FRET offre certains avantages clés par rapport à l’imagerie FRET basée sur l’intensité. La durée de vie de fluorescence est un paramètre intrinsèque du fluorophore. Par conséquent, elle ne dépend pas des concentrations locales de fluorophores ni de l’intensité de l’excitation lumineuse. La durée de vie de fluorescence est en outre également mal affectée par le photo-blanchiment. Il est particulièrement intéressant de mettre en évidence les IPP dans les cellules où les concentrations de protéines locales peuvent être.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre passe-bande 525/50 nm	F37-516, AHF, Allemagne
Filtre passe-court 680 nm	F75-680, AHF, Allemagne
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418
DreamTaq ADN polymérase 5U/&mu ; L	ThermoFisher Scientific	EP0714
E. coli TOP10	Invitrogen	C404010
Photodiode d’avalanche couplée à la fibre	SPCM-AQR-14- FC, lamelles en verre Perkin Elmer
(Epaisseur n° 1,5, 20&fois ; 20mm	Knitel verre	MS0011
ADN polymérase haute fidélité Phusion 2U/&mu ; L	ThermoFisher Scientific	F530S
Bouillon de lysogénie (LB)	Millipore	1.10285
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4 . 7H2O)	Sigma-Aldrich	10034-99-8
Lames de microscope (25&fois ; 75mm)	Verre Knitel	MS0057
NucleoSpin Gel et nettoyage PCR	Macherey-Nagel	740609.50
NucleoSpin Plasmide	Macherey-Nagel	740588.10
Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	RES20765
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Succinate (disodique)	Sigma-Aldrich	14160
SPCImage, logiciel SPCM	Becker & Hickl
Boucle d’inoculation stérile	Nunc	7648-1PAK
T4 ADN ligase 1U/&mu ; L	ThermoFisher Scientific	15224017
module TCSPC	SPC830, Becker & Hickl, Allemagne
Ti :Sapphire laser	Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL	Falcon	352070

Sulfate d’ammonium