Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Résumé

La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.

Résumé

Bien que les petits ARN régulateurs (ARNs) soient répandus dans le domaine bactérien de la vie, les fonctions de beaucoup d’entre eux restent mal caractérisées notamment en raison de la difficulté d’identifier leurs cibles d’ARNm. Ici, nous avons décrit un protocole modifié de la purification par affinité MS2 couplé à la technologie de séquençage de l’ARN (MAPS), visant à révéler tous les partenaires ARN d’un ARN spécifique in vivo. En gros, l’aptamère MS2 est fusionné à l’extrémité 5' de l’ARNr d’intérêt. Cette construction est ensuite exprimée in vivo, permettant à l’ARNsM2 d’interagir avec ses partenaires cellulaires. Après la récolte bactérienne, les cellules sont lysées mécaniquement. L’extrait brut est chargé dans une colonne de chromatographie à base d’amylose préalablement recouverte de la protéine MS2 fusionnée à la protéine de liaison au maltose. Cela permet la capture spécifique de l’ARNs MS2 et des ARN en interaction. Après l’élution, les ARN co-purifiés sont identifiés par séquençage de l’ARN à haut débit et analyse bioinformatique ultérieure. Le protocole suivant a été mis en œuvre dans l’agent pathogène humain à Gram positif Staphylococcus aureus et est, en principe, transposable à toute bactérie à Gram positif. En résumé, la technologie MAPS constitue une méthode efficace pour explorer en profondeur le réseau de régulation d’un ARNr particulier, offrant un instantané de l’ensemble de son targetome. Cependant, il est important de garder à l’esprit que les cibles putatives identifiées par MAPS doivent encore être validées par des approches expérimentales complémentaires.

Introduction

Des centaines, voire des milliers de petits ARN régulateurs (ARNs) ont été identifiés dans la plupart des génomes bactériens, mais les fonctions de la grande majorité d’entre eux restent inhabituelles. Dans l’ensemble, les ARNs sont de courtes molécules non codantes, jouant un rôle majeur dans la physiologie bactérienne et l’adaptation aux environnements fluctuants^1,2,3. En effet, ces macromolécules sont au centre de nombreux réseaux de régulation complexes, impactant les voies métaboliques, les réponses au stress mais aussi la virulence et la résistance aux antibiotiques. Logiquement, leur synthèse est déclenchée par des stimuli environnementaux spécifiques (p. ex. privation de nutriments, stress oxydatif ou membranaire). La plupart des ARNm régulent plusieurs ARNm cibles au niveau post-transcriptionnel par le biais d’appariements de bases courts et non contigus. Ils empêchent généralement l’initiation de la traduction en concurrençant les ribosomes pour les régions d’initiation de la traduction^4. La formation de duplex ARNm:ARNm entraîne aussi souvent la dégradation active de l’ARNm cible par le recrutement de RNases spécifiques.

La caractérisation d’un targetome d’ARNs (c’est-à-dire l’ensemble de ses ARN cibles) permet d’identifier les voies métaboliques dans lesquelles il intervient et le signal potentiel auquel il répond. Par conséquent, les fonctions d’un ARNr spécifique peuvent généralement être déduites de son targetome. A cet effet, plusieurs outils de prédiction in silico ont été développés tels que IntaRNA et CopraRNA^5,6,7. Ils s’appuient notamment sur la complémentarité des séquences, l’énergie d’appariement et l’accessibilité du site d’interaction potentiel pour déterminer les partenaires d’ARNs putatifs. Cependant, les algorithmes de prédiction n’intègrent pas tous les facteurs influençant l’appariement de bases in vivo tels que l’implication d’ARN chaperons⁸ favorisant des interactions sous-optimales ou la co-expression des deux partenaires. En raison de leurs limites inhérentes, le taux de faux positifs des outils de prédiction reste élevé. La plupart des approches expérimentales à grande échelle sont basées sur la co-purification des couples ARNs:ARNm interagissant avec une protéine de liaison à l’ARN marqué (RBP)^6,9. Par exemple, la méthode RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) a identifié des duplex d’ARN co-purifiés avec des chaperons d’ARN tels que Hfq et ProQ dans Escherichia coli^10,11. Une technologie similaire appelée UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) a été appliquée aux ARNs associés à la RNase E- et Hfq dans E. coli^12,13. Malgré les rôles bien décrits de Hfq et ProQ dans la régulation par l’ARN dans plusieurs bactéries^8,14,15,la régulation basée sur l’ARNs semble être indépendante de l’ARN chez plusieurs organismes comme S. aureus^16,17,18. Même si la purification des duplex d’ARN en association avec les RNases est possible comme démontré par Waters et ses collègues^13,cela reste délicat car les RNases déclenchent leur dégradation rapide. Par conséquent, l’approche MS2-Affinity Purification couplée au Séquençage de l’ARN (MAPS)^19,20 constitue une alternative solide chez de tels organismes.

Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, MAPS utilise un ARN spécifique comme appât pour capturer tous les ARN en interaction et ne repose donc pas sur l’implication d’un RBP. L’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En bref, l’ARNs est marqué au 5' avec l’aptamère à ARN MS2 qui est spécifiquement reconnu par la protéine ms2. Cette protéine est fusionnée avec la protéine de liaison au maltose (MBP) pour être immobilisée sur une résine amylose. Par conséquent, l’ARNsM2 et ses partenaires ARN sont retenus sur la colonne de chromatographie d’affinité. Après élution avec du maltose, les ARN co-purifiés sont identifiés à l’aide d’un séquençage d’ARN à haut débit suivi d’une analyse bioinformatique(Figure 2). La technologie MAPS dessine finalement une carte en interaction de toutes les interactions potentielles se produisant in vivo.

La technologie MAPS a été mise en œuvre à l’origine dans la bactérie Gram négatif non pathogène E. coli^21. Remarquablement, MAPS a aidé à identifier un fragment dérivé de l’ARNt interagissant spécifiquement avec les ARNs RyhB et RybB et empêchant tout bruit transcriptionnel de l’ARNr pour réguler les cibles de l’ARNm dans des conditions non induisantes. Par la suite, maps a été appliqué avec succès à d’autres ARNs de E. coli comme DsrA^22,RprA^23,CyaR²³ et GcvB²⁴ (Tableau 1). En plus de confirmer des cibles précédemment connues, MAPS a étendu le targetome de ces ARNs bien connus. Récemment, MAPS a été réalisée dans Salmonella Typhimurium et a révélé que l’ARNs SraL se lie à l’ARNm rho, codant pour un facteur de terminaison de transcription^25. Grâce à cet appariement, SraL protège l’ARNm rho de l’arrêt prématuré de la transcription déclenché par Rho lui-même. Fait intéressant, cette technologie n’est pas limitée aux ARNs et peut être appliquée à n’importe quel type d’ARN cellulaires comme l’illustre l’utilisation d’un fragment dérivé de l’ARNt²⁶ et d’une région non traduite 5'-de l’ARNm²² (Tableau 1).

La méthode MAPS a également été adaptée à la bactérie pathogène à Gram positif S. aureus^19. Plus précisément, le protocole de lyse a été largement modifié pour briser efficacement les cellules en raison d’une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif et pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Ce protocole adapté a déjà démêlé l’interactome de RsaA^27,RsaI²⁸ et RsaC^29. Cette approche a donné des aperçus sur le rôle crucial de ces ARNs dans les mécanismes de régulation des propriétés de surface cellulaire, de l’absorption de glucose, et des réponses oxydantes de stress.

Le protocole élaboré et mis en œuvre dans E. coli en 2015 a récemment été décrit en détail³⁰. Ici, nous fournissons le protocole MAPS modifié, qui est particulièrement adapté à l’étude des réseaux de régulation de l’ARNs chez les bactéries Gram-positives (paroi cellulaire plus épaisse), qu’elles soient non pathogènes ou pathogènes (précautions de sécurité).

Protocole

1. Tampons et supports

1. Pour les expériences MAPS, préparez les mémoires tampons et les supports suivants :
   - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ et 1 mM TNT)
   - Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl₂ et 1 mM TNT)
   - Tampon de charge d’ARN (0,025 % de cyanol de xylène et 0,025 % de bleu de bromophénol dans l’urée 8 M)
   - Brain Heart Infusion (BHI) milieu (12,5 g de cerveau de veau, 10 g de peptone, 5 g de cœur de bœuf, 5 g de NaCl, 2,5 g de_Na2HPO₄ et 2 g de glucose pour 1 L)
   - Bouillon de lysogenèse (LB) milieu (10 g de peptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de NaCl pour 1 L)
2. Pour les analyses par transfert northern, préparer les tampons suivants :
   - Solution bloquante (1x acide maléique et réactif bloquant 1 %)
   - Solution d’hybridation (50 % de formamide, 5x SSC, 7 % de SDS, 1 % de solution bloquante et 0,2 % de N-lauryl sarcosine, 50 mM de phosphate de sodium). Chauffer avec agitation pour dissoudre.
   ATTENTION: Suivez attentivement les précautions de sécurité liées à chaque produit.
   - 1 M phosphate de sodium (58 mM de phosphate de sodium dibasique et 42 mM de phosphate de sodium monobasique)
   - Solution saline, tampon citrate de sodium (SSC), concentré 20x (NaCl 3 M et citrate trisodique 300 mM)

2. Questions de sécurité

1. Effectuer toutes les étapes impliquant des bactéries pathogènes viables dans un laboratoire de confinement de niveau 2.
   REMARQUE: Seuls les extraits cellulaires peuvent être pris à l’extérieur après la lyse (étape 5).
2. Mettez un sarrau de laboratoire et des gants.
3. Assurez-vous que les poignets sont couverts.
4. Nettoyer l’enceinte de sécurité biologique (classe II) avec une solution désinfectante.
5. Éliminer les déchets solides exposés aux bactéries dans le bac biomédical approprié.
6. Traiter les flacons contenant des liquides contaminés avec une solution désinfectante. Ensuite, jetez-le dans un évier.
7. Lavez-vous soigneusement les mains et les poignets avec du savon et retirez le sarrau de laboratoire avant de quitter le laboratoire de confinement de niveau 2.

3. Construction du plasmide

REMARQUE: À des fins de clonage, il est crucial d’identifier d’abord les limites de l’ARNs endogène. Les plasmides pCN51-P3 et pCN51-P3-MS2 sont décrits dans Tomasini et coll. (2017)²⁷. Le promoteur P3 permet une expression élevée de l’ARNs d’une manière dépendante de la densité cellulaire (c.-à-d. lorsque les bactéries entrent dans la phase stationnaire de croissance). De nombreux ARNs staphylococcique s’accumulent au cours de cette phase de croissance.

1. Amplifier la séquence d’ARNs par PCR à l’aide d’une ADN polymérase haute fidélité et d’un appareil de PCR. Suivez attentivement les instructions du fabricant et lisez Garibyan et Avashia (2013)³¹ pour plus de détails.
2. Utilisez les modèles suivants pour concevoir les amorces spécifiques :
   
   et 5'-CGCGGATCC(N)-3' pour les amorces avant et arrière, respectivement.
   NOTE : Ces oligonucléotides permettent de fusionner la séquence MS2 (en gras) à l’extrémité 5' de l’ARNs d’intérêt. Le Pst Les sites de restriction I et BamHI (soulignés) sont ajoutés aux extrémités 5' et 3' de la construction MS2-sRNA pour cloner l’amplicon dans le plasmide pCN51-P3^27. (N) correspond à la séquence spécifique au gène (15-20 nucléotides).
3. Digérer 1 μg de plasmide pCN51-P3 et 1 μg du produit PCR à ARNsM2 avec 2 U de PstI et 1 U de BamHI dans le tampon approprié selon les recommandations du fabricant.
4. Incuber 1 h à 37 °C et purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification par PCR (voir la table des matériaux).
5. Mélanger le plasmide pCN51-P3 digéré (300 ng) et l’amplicon MS2-ARNs (rapport molaire pour vecteur:insert = 1:3) dans un tube de 1,5 mL. Voir Revie et coll. (1988)³² pour maximiser l’efficacité de la ligature. Ajouter 1 μL du tampon ligase et 10 U de Ligase T4 dans chaque tube. Réglez le volume à 10 μL avec de l’eau ultrapure.
6. Incuber à 22 °C pendant au moins 2 h.
7. Ajouter 5 μL de mélange de ligature à 50 μL de cellules DH5α DH5α congelées chimiquement compétentes. Lisez Seidman et coll. (2001)³³ pour en savoir plus sur la transformation des plasmides et les cellules chimiquement compétentes.
8. Incuber 30 min sur la glace.
9. Choc thermique (45 s à 42 °C) le tube de transformation à l’aide d’un bloc thermique ou d’un bain-marie.
10. Ajouter 900 μL de milieu LB et incuber à 37 °C pendant 30 min.
11. Plaque 100 μL de la suspension bactérienne sur une plaque de gélose LB complétée par de l’ampicilline (100 μg/μL).
    REMARQUE: le vecteur pCN51-P3 code pour un gène de résistance à l’ampicilline, ce qui permet de sélectionner uniquement des clones de E. coli porteurs du plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.
12. Extraire le plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA d’une culture bactérienne nocturne (5 mL) cultivée en présence d’ampicilline (100 μg/μL) à l’aide d’un kit de minipréparation d’ADN plasmidique (voir la table des matériaux).
13. Vérifiez la construction par séquençage^{sanger 34} en utilisant l’amorce suivante, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
14. Transformer le plasmide pCN51-P3-MS2-ARNstronique en cellules DC10B chimiquement compétentes pour E. coli.  Répétez les étapes 3.7 à 3.11.
15. Extraire le plasmide pCN51-P3-MS2-ARNs (voir étape 3.12) et transformer 1 à 5 μg d’ADN plasmidique en cellules S. aureus électrocompétentes HG001 ΔsRNA à l’aide d’un appareil d’électroporation. Suivez attentivement les instructions du fabricant. Lisez Grosser et Richardson (2016)³⁵ pour en savoir plus sur les méthodes de préparation de S. aureusélectrocompétent.
    ATTENTION : Cette étape implique la manipulation des bactéries pathogènes (voir étape2).
16. Ajouter 900 μL de milieu BHI et incuber à 37 °C pendant 3 h.
17. Centrifugeuse 1 min à 16 000 x g. Jetez le surnageant.
18. Résurendre la pastille dans 100 μL de BHI et plaquer la suspension bactérienne sur des plaques de gélose BHI complétées par de l’érythromycine (10 μg/μL).
    REMARQUE: Le vecteur pCN51-P3 code également un gène de résistance à l’érythromycine, qui permet de sélectionner uniquement des clones de S. aureus porteurs du plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Récolte des bactéries

ATTENTION : Cette étape implique la manipulation de bactéries pathogènes (voir étape 2).

1. Cultiver une colonie de souches porteuses de pCN51-P3-MS2-ARNr ou de plasmides pCN51-P3-MS2²⁷ dans 3 mL de milieu BHI complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) en double.
2. Diluer chaque culture pendant la nuit dans 50 mL (≈1/100) de milieu frais BHI complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) pour atteindre une DO_600nm de 0,05. Utiliser des fioles stérilisées de 250 mL (rapport fiole/milieu de 5:1).
   REMARQUE: Les conditions moyennes et de croissance doivent être définies en fonction du modèle d’expression de l’ARNs étudié.
3. Cultiver des cultures à 37 °C en secouant à 180 rpm pendant 6 h.
4. Transférer chaque culture dans un tube à centrifuger de 50 mL.
5. Centrifuger à 2 900 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
6. Conservez les granulés sur la glace et effectuez directement une lyse mécanique des cellules (étape 5) ou congelez et entreposez les granulés à -80 °C.

5. Lyse cellulaire mécanique

ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées sur la glace et les tampons doivent être à 4 °C. Utilisez des gants et prenez toutes les précautions pour protéger les échantillons contre les RNases.

1. Remise en suspension des granulés (étape 4.6) dans 5 mL du tampon A.
2. Transférer les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 mL avec 3,5 g de billes de silice (0,1 mm).
3. Insérez des tubes dans un instrument de lyse de cellules mécaniques (voir tableau des matériaux). Exécuter un cycle de 40 s à 4,0 m/s.
   REMARQUE: Si un cycle ne suffit pas à briser les cellules, laissez l’appareil refroidir pendant 5 min tout en gardant les échantillons sur la glace. Ensuite, répétez un autre cycle de 40 s à 4,0 m/s. L’efficacité de la lyse cellulaire peut être testée en plaquant le surnageant sur une plaque de gélose BHI.
4. Centrifuger à 15 700 x g pendant 15 min. Récupérez le surnageant et gardez-le sur la glace.

6. Préparation de la colonne

ATTENTION : Veillez à ne pas laisser sécher la résine amylose. Si nécessaire, scellez la colonne avec un embout. Préparez toutes les solutions avant de commencer la purification par affinité.

1. Mettez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne (voir table des matériaux).
2. Retirez la pointe de la colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultrapure.
3. Ajouter 300 μL de résine amylose.
4. Laver la colonne avec 10 mL de tampon A.
5. Diluer 1 200 pmol de protéine MBP-MS2 dans 6 mL de tampon A et le charger dans la colonne.
6. Laver la colonne avec 10 mL de tampon A.

7. Purification par affinité MS2 (Figure 1)

1. Chargez le lysat de cellule dans la colonne.
   REMARQUE : Conservez 1 mL du lysat cellulaire (extrait brut, CE) pour extraire l’ARN total (étape 8) et effectuer une analyse par transfert Northern (étape 9) et transcriptomique (étape 10).
2. Recueillir la fraction d’écoulement (FT) dans un tube de collecte propre.
3. Laver la colonne 3 fois avec 10 mL de tampon A. Recueillir la fraction de lavage (W).
4. Éluer la colonne avec 1 mL de tampon E et recueillir la fraction d’élution (E) dans un microtube de 2 mL.
5. Conservez toutes les fractions collectées sur la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN (étape 8) ou congelez-les à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

8. Extraction de l’ARN des fractions collectées (CE, FT, W et E)

1. Utiliser 1 mL de chaque fraction (y compris FT et W) pour l’extraction de l’ARN.
2. Ajouter 1 volume de phénol. Mélanger vigoureusement.
   ATTENTION: Le phénol est volatil et corrosif, faites attention et travaillez en toute sécurité sous une hotte.
3. Centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min à 20 °C.
4. Transférer la phase supérieure dans un microtube propre de 2 mL.
5. Ajouter 1 volume d’alcool chloroforme/isoamylique (24:1) et répéter les étapes 8.3 à 8.4.
   ATTENTION: Travaillez en toute sécurité sous une hotte.
6. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol froid à 100 % et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (NaOAc) pH 5,2.
7. Précipiter pendant la nuit à -20 °C.
   NOTA : Les précipitations peuvent également être effectuées dans un bain d’éthanol/de glace carbonique pendant 20 min ou à -80 °C pendant 2 h.
8. Centrifuger à 16 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Retirez lentement l’éthanol avec une pipette tout en faisant attention à ne pas déranger la pastille.
   ATTENTION : La pastille d’ARN n’est pas toujours visible et est parfois lâche en présence d’éthanol.
9. Ajouter 500 μL d’éthanol froid à 80 %.
10. Centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
11. Jetez l’éthanol en le pipetant lentement. Séchez la pastille à l’aide d’un concentrateur à vide, 5 min en mode de fonctionnement.
12. Ressusciter la pastille dans un volume approprié (15-50 μL) d’eau ultrapure. Congeler la pastille à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
13. Évaluer la quantité d’ARN (260 nm) et la qualité (rapports de longueur d’onde 260/280 et 260/230) à l’aide d’un spectrophotomètre/fluoromètre (voir la table des matériaux). Suivez attentivement les instructions du fabricant.
    NOTA : 3-4 μg sont généralement obtenus dans la fraction d’élution (E). Cela dépend principalement des conditions testées.

9. Analyse de la purification par affinité MS2 par transfert Northern³⁶

1. Diluer 5 μg d’ARN des fractions CE, FT, W et 500 ng de fraction E dans 10 μL d’eau ultrapure et mélanger avec 10 μL de tampon de charge d’ARN.
2. Incuber 3 min à 90 °C.
3. Chargez les échantillons dans des puits d’un gel d’agarose à 1% complété par 20 mM de thiocyanate de guanidium et faites fonctionner le gel à 100-150 V dans un tampon TBE 1x à 4 °C. Lisez Koontz (2013)³⁷ pour plus de détails.
4. Transférer les ARN sur une membrane de nitrocellulose par transfert sous vide pendant 1h ou transfert de capillarité pendant la nuit.
   Remarque : la méthode de capillarité est plus efficace pour les grands ARN.
5. ARN de réticulation UV sur la membrane (120 mJ à 254 nm) à l’aide d’un réticulant ultraviolet.
6. Insérez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté ARN tourné vers le haut.
7. Ajouter 10-20 mL de solution d’hybridation préchauffée. Incuber 30 min à 68 °C.
8. Jetez la solution et ajoutez 10 à 20 mL de solution d’hybridation fraîche complétée par 1 μL de sonde spécifique à l’ARNs. Incuber pendant la nuit à 68 °C.
   REMARQUE : La sonde d’ARN marquée DIG est synthétisée à l’aide d’une trousse d’étiquetage de l’ARN DIG et en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, une sonde radiomarquée peut être utilisée.
9. Laver la membrane avec 10-20 mL de solution de lavage 1 (2x SSC et 0,1% SDS) pendant 5 min à 20 °C. Répétez une fois.
10. Laver la membrane avec 10-20 mL de solution de lavage 2 (0,2x SSC et 0,1% SDS) pendant 15 min à 68 °C. Répétez une fois.
11. Incuber avec 10-20 mL de solution de blocage pendant au moins 30 min à 20 °C.
12. Jeter la solution et ajouter 10-20 mL de la solution bloquante complétée par l’anticorps polyclonal anti-digoxigenin (1/1000), conjugué à la phosphatase alcaline. Incuber 30 min à 20 °C.
13. Laver la membrane avec 10-20 mL de la solution de lavage 3 (1x acide maléique et 0,3% Tween 20) pendant 15 min à 20 °C. Répétez une fois.
14. Incuber la membrane avec 10-20 mL de la solution de détection (0,1 M Tris HCl et 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min à 20 °C.
15. Mettez la membrane sur un film plastique et faites-la tremper avec le substrat (voir tableau des matériaux). Incuber 5 min dans l’obscurité.
16. Scellez la membrane dans un film plastique. Mettez la membrane dans une cassette d’autoradiographie.
17. Exposez la membrane à un film d’autoradiographie dans la pièce sombre dédiée.
    REMARQUE: Le temps d’exposition dépend de la force du signal, de quelques secondes à quelques minutes.
18. Révélez le film exposé dans un dispositif de développement automatique.

10. Préparation des échantillons pour le séquençage de l’ARN

REMARQUE : Cette étape ne concerne que les ARN extraits des fractions E et CE.

1. Ajouter à chaque échantillon 10 μL de tampon DNase 10x et de DNase I (1 U/μg d’ARN traités). Ajouter de l’eau pour un volume final de 100 μL.
2. Incuber 1 h à 37 °C.
3. Extraire et purifier les ARN comme décrit précédemment (étapes 8.2 à 8.11).
4. Ressusciter la pastille d’ARN dans 20 μL d’eau ultrapure.
   REMARQUE : La présence d’ADN restant peut être vérifiée à l’aide de la PCR et d’amorces spécifiques (p. ex. gène 16S).
5. Évaluer la quantité et la qualité de l’ARN à l’aide d’un système d’analyse par électrophorèse basé sur la microfluidique (voir la table des matériaux).
   REMARQUE: 1 μg est généralement obtenu dans la fraction d’élution (E) après traitement par DNase.
6. Retirez les ARN ribosomiques à l’l’munition d’un kit d’épuisement de l’ARNr bactérien.
   REMARQUE : les ARN volumineux et abondants (c’est-à-dire les ARNr) ont tendance à interagir non spécifiquement avec la colonne d’affinité. 500 ng d’ARN extrait sont nécessaires pour effectuer cette étape.
7. Évaluez à nouveau la quantité et la qualité de l’ARN à l’aide d’un système d’analyse par électrophorèse basé sur la microfluidique.
8. Préparer des bibliothèques d’ADNc avec 10 à 20 ng d’ARN ribodéré à l’aide d’un kit de préparation de la bibliothèque d’ADNc et en suivant les instructions du fabricant.
9. Séquencer les bibliothèques obtenues à l’aide d’un instrument de séquençage (p. ex., extrémité unique, 150 pb; voir la table des matériaux).
   REMARQUE: 5-10 millions de lectures par échantillon sont généralement suffisantes.

11. Analyse des données RNAseq (Figure 2)

1. Téléchargez les fichiers de séquençage FastQ à partir de la plateforme de séquençage.
2. Accès à l’instance Galaxy de la station biologique Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) et connexion.
   REMARQUE: Chaque algorithme mentionné peut être facilement trouvé à l’aide de la barre de recherche. Un guide de l’utilisateur est fourni pour chaque outil.
   Attention : La version des outils requis peut différer du serveur Galaxy public^38.
3. Cliquez sur l’icône Obtenir des données, puis sur Télécharger un fichier à partir de votre ordinateur. Téléchargez le fichier de séquençage FastQ de chaque contrôle MS2 et échantillons d’ARNsM2. Téléchargez également le fichier de génome de référence FASTA et le fichier d’annotation GFF.
4. Exécutez les rapports FastQC Read Quality (Galaxy Version 0.69).
   Remarque : cet outil fournit une évaluation de la qualité des séquences brutes (par exemple, score de qualité, présence de séquences d’adaptateur).
5. Exécutez l’outil de rognage de lecture flexible Trimmomatic (Galaxy Version 0.36.6) pour supprimer notamment les séquences d’adaptateurs et les lectures de mauvaise qualité. Indiquez les séquences d’adaptateurs utilisées pour la préparation de la bibliothèque (p. ex., TruSeq 3, à extrémité unique). Ajoutez les opérations Trimmomatic suivantes : SLIDINGWINDOW (Nombre de bases=4 ; Qualité moyenne = 20) et MINLEN (Longueur min des lectures = 20).
6. Réexécutez les rapports FastQC Read Quality (Galaxy Version 0.69).
7. Run Bowtie2 - la carte se lit par rapport au génome de référence (Galaxy Version 2.3.2.2). Utilisez le fichier FASTA de référence du génome de l’historique pour mapper les lectures avec les paramètres par défaut (local très sensible).
   Remarque : fichier BAM généré par l’outil Bowtie2 peut être visualisé à l’aide de la visionneuse de génomique intégrative (IGV). Le fichier BAI associé sera également requis.
8. Si vous le souhaitez, exécutez Flagstat qui compile les statistiques pour le jeu de données BAM (Galaxy Version 2.0).
9. Exécutez htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) qui aligne les fonctions qui se chevauchent dans le fichier d’annotation GFF. Utilisez le mode Intersection (non vide).
10. Archivez tous les fichiers de comptage bruts de l’analyse htseq-count dans un seul fichier Zip.
11. Exécutez SARTools DESeq2 pour comparer les données (Galaxy Version 1.6.3.0). Fournissez le fichier Zip contenant les fichiers de comptage brut et le fichier de conception, un fichier délimité par des tabulations décrivant l’expérience. Suivez attentivement les instructions fournies pour générer le fichier de conception.

Résultats

Les résultats représentatifs proviennent de l’étude du targetome RsaC chez S. aureus^29. RsaC est un ARNs 1,116 nt-long non conventionnel. Son extrémité 5' contient plusieurs régions répétées tandis que son extrémité 3' (544 nt) est structurellement indépendante et contient tous les sites d’interaction prédits avec ses cibles ARNm. L’expression de cet ARNs est induite lorsque le manganèse (Mn) est rare, ce qui est souvent produit dans le contexte de la réponse immunitaire de l’hôte. À l’ai...

Discussion

Un protocole modifié pour les bactéries à Gram positif
Le protocole initial de MAPS a été développé pour étudier l’interactome de l’ARNs dans l’organisme modèle E. coli^20,30. Ici, nous décrivons un protocole modifié qui convient à la caractérisation des réseaux de régulation ARN-dépendants dans l’agent pathogène humain opportuniste S. aureus et est certainement transposable à d’autres bactéries Gram-positives, pathogènes ou n...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Tubes à centrifuger 15 mL	Falcon	352070
Tube à centrifuger 2 mL	Starstedt	72.691
2100 Bioanalyseur Instrument	Agilent	G2939BA	quantité et qualité de l’ARN
Flacon de culture 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Bactérien cultures
Tubes à centrifuger de 50 mL	Falcon	352051	Culture centrifugation
Éthanol absolu	VWR Chemicals	20821.321	Extraction et purification de l’ARN
Allegra X-12R Centrifugeuse	Beckman Coulter		Granulation bactérienne
Ampiciline (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Milieu de croissance
Résine d’amylose	Nouveau Angleterre BioLabs	E8021S	Purification d’affinité MS2
Anti-dioxigénine AP Fragment Fab	Sigma Aldrich	11093274910	Dosages par transfert de Northern
Cassette d’autoradiographie ThermoFisher	Scientific	50-212-726	Dosages par transfert de Northern
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Construction plasmidique
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	Sigma-Aldrich	53286	Milieu de croissance
Réactif bloquant	Sigma Aldrich	11096176001	Dosages par transfert de Northern
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Dosages de Northern (substrat)
Centrifugeuse 5415 R	Eppendorf		Extraction et purification de l’ARN
Chloroforme	Dominique Dutscher	508320-CER	Extraction de l’ARN et purification
DIG-RNA Mélange de marquage	Sigma-Aldrich	11277073910	Dosages par transfert de Northern
DNase I	Roche	4716728001	Traitement par DNase
Érythromycine (éry)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Milieu de croissance
Dispositif FastPrep	MP Biomedicals	116004500	Lyse mécanique
Thiocyanate de guanidium	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Essais par transfert de Northern
Hybridation Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Essais par transfert de Northern
Tubes d’hybridation	Techne	FHB16	Essais par transfert de Northern
Alcool isoamylique	Fisher Scientific	A/6960/08	Extraction et purification de l’ARN
LB (Lysogeny Broth)	Sigma-Aldrich	L3022	Milieu
de croissance Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lyse mécanique
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100	Construction plasmidique
Dispositif à eau Milli-Q Millipore		Z00QSV0WW	Eau ultrapure
Spectrophotomètre NanoDrop	ThermoFisher Scientific		ARN/DNA quantité et qualité
Membrane nitrocellulosique	Dominique Dutsher	10600002	Northern blot
tests Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Nettoyage et décontamination
Phénol	Carl Roth	38.2	Extraction et purification de l’ARN
Phusion High-Fidelity DNA polymérase	New England Biolabs	M0530	Construction plasmidique
pMBP-MS2	Addgene	65104	Production MS2-MBP Colonne
chromatographie Poly-Prep	BioRad	7311550	Purification d’affinité MS2
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Construction plasmidique Fluorimètre
Qubit 3	Invitrogen	15387293	quantité d’ARN
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Lyse mécanique
ScriptSeq Kit complet	Illumina	BB1224	Préparation des librairies d’ADNc
Spectrophotomètre Genesys 20 ThermoFisher	Scientific	11972278	Cultures bactériennes
SpeedVac Savant Appareil à vide ThermoFisher	Scientific	DNA120	Extraction et purification de l’ARN
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern blot
T4 ADN ligase	ThermoFisher Scientific	EL0014	Construction plasmidique
TBE (Tris-Borate-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Essais par transfert de Northern
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Construction plasmidique
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Essais par transfert de Northern
Processeur de film à rayons X	hu.q	HQ-350XT	Tests de transfert de Northern
Films à rayons X Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Tests de transfert de Northern