Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Une purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN ou à des MAPS a été développée pour identifier l’ensemble du targetome de tout ARN d’intérêt pour les bactéries. Cette technologie permet d’identifier tout type de partenaire ARN indépendamment du mécanisme de régulation. La caractérisation des réseaux de régulation dépendants de l’ARNs aidera à mieux comprendre la production de facteurs de virulence, la formation de biofilms et la survie des bactéries dans les cellules hôtes, et finalement lutter contre les infections staphylococciques.

Ce protocole peut être appliqué à toute bactérie grampositaire pathogène ou non pathogène. Noemie Mercier, doctorante du laboratoire du Dr Pascal Romby, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez une colonie de souches portant soit l’ARNspCN51 P3 MS2, soit les plasmides pCN51 P3 MS2 dans trois millilitres de milieu BHI complétés par 10 microgrammes par érythromycine microlitre en double.

Diluer chaque culture pendant la nuit dans 50 millilitres de milieu frais de BHI complété avec de l’érythromycine pour atteindre une DO 600 de 0,05. Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius en secouant à 180 rpm pendant six heures. Transférer chaque culture dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis jeter le surnageant, les congeler et les stocker à moins 80 degrés Celsius ou garder les pastilles sur la glace et effectuer directement la lyse mécanique des cellules.

Pour effectuer la lyse mécanique des cellules, ressuscitez les pastilles dans cinq millilitres de tampon A et transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres avec 3,5 grammes de billes de silice. Insérez les tubes dans un instrument de lyse à cellules mécaniques et exécutez un cycle de 40 secondes à quatre mètres par seconde. Centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes, puis récupérer le surnageant et le garder sur glace.

Assurez-vous que le surnageant est clair, en répétant la centrifugation si ce n’est pas le cas. Retirez la pointe de la colonne, puis mettez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultrapure. Ajouter 300 microlitres de résine amylose et laver la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Diluer 1, 200 picamoles de protéine MBP-MS2 dans six millilitres de tampon A et le charger dans la colonne.

Lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Ensuite, effectuez une purification d’affinité MS2. Chargez le lysat de la cellule dans la colonne et collectez la fraction d’écoulement dans un tube de collecte propre. Laver la colonne trois fois avec 10 millilitres de tampon A et recueillir la fraction de lavage, puis éluer la colonne avec un millilitre de tampon E et recueillir la fraction d’élution dans un microtube de deux millilitres.

Conservez toutes les fractions collectées sur la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN. Utilisez un millilitre de chaque fraction pour l’extraction de l’ARN. Ajouter un volume de phénol à l’ARN et mélanger vigoureusement, puis centrifuger le mélange à 16 000 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius.

Transférer la phase supérieure sur un microtube propre de deux millilitres. Ajouter un volume d’alcool isoamylique chloroforme et répéter la centrifugation, puis transférer la phase supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 100 % froid et 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à un pH de 5,2 et précipiter pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.

Le lendemain, centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 16 000 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez lentement l’éthanol avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter 500 microlitres d’éthanol froid à 80 % et centrifuger pendant cinq minutes.

Jetez l’éthanol en le pipetant lentement, puis séchez la pastille à l’aide d’un concentrateur à vide pendant cinq minutes en mode de fonctionnement. Ressusciter le culot dans un volume approprié d’eau ultrapure. Ce protocole a été employé pour étudier le targetome de RsaC dans S.aureus.

Plusieurs ARNm interagissant directement avec rsac ont été identifiés à l’aide de la technologie MAPS, révélant son rôle crucial dans le stress oxydatif et les réponses liées aux métaux. Pour confirmer les constructions d’ARNs MS2 et visualiser leur modèle d’expression, des cellules ont été récoltées après deux, quatre et six heures de croissance dans le milieu BHI. L’ARN a été extrait et l’analyse de northern blot a été exécutée utilisant la sonde dig RsaC-spécifique.

Le niveau de RsaC endogène a augmenté de manière significative après six heures de croissance. Il est important de savoir que le niveau de MS2-RsaC 544 et ms2-RsaC 1, 116 était comparable à celui de RsaC endogène à six heures. La purification d’affinité a été exécutée et des ARN ont été extraits des fractions brutes d’extrait, d’écoulement et d’élution dans la souche de type sauvage exprimant la balise MS2 seule et la souche mutante RsaC exprimant la construction MS2-RsaC 544.

Le 1,116 nucléotide long endogène RsaC a été enrichi dans la fraction d’élution, mais a interagi non spécifiquement avec la colonne d’affinité en raison de sa longueur et de sa structure secondaire complexe. Le MS2-RsaC 544 a été fortement enrichi en fraction d’élution démontrant qu’il a été retenu avec succès par la protéine de fusion MS2-MBP. Une analyse bioinformatique a révélé des cibles putatives d’ARNm selon le changement de pli entre l’ARNsM MS2 et le contrôle de l’ARNm2, indiquant que la sodA était la première cible putative.

Une analyse par transfert Northern a effectué une sonde DIG spécifique à la sodA après purification par affinité MS2 montre que la sodA a été efficacement co-enrichie avec MS2-RsaC 544 par rapport au contrôle MS2. Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que l’ajout de la balise MS2 peut affecter la confirmation, la stabilité ou la fonction de l’ARNs. Cela devrait être surveillé de près.

MAPS fournit un instantané de l’appariement des cibles ARN-ARN. Une validation expérimentale plus poussée démêlera leur fonction. Cette technique représente un outil puissant pour construire des réseaux de régulation de l’ARNs dans toutes les bactéries.