Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif
23 février 2021
La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.
Une purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN ou à des MAPS a été développée pour identifier l’ensemble du targetome de tout ARN d’intérêt pour les bactéries. Cette technologie permet d’identifier tout type de partenaire ARN indépendamment du mécanisme de régulation. La caractérisation des réseaux de régulation dépendants de l’ARNs aidera à mieux comprendre la production de facteurs de virulence, la formation de biofilms et la survie des bactéries dans les cellules hôtes, et finalement lutter contre les infections staphylococciques.
Ce protocole peut être appliqué à toute bactérie grampositaire pathogène ou non pathogène. Noemie Mercier, doctorante du laboratoire du Dr Pascal Romby, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez une colonie de souches portant soit l’ARNspCN51 P3 MS2, soit les plasmides pCN51 P3 MS2 dans trois millilitres de milieu BHI complétés par 10 microgrammes par érythromycine microlitre en double.
Diluer chaque culture pendant la nuit dans 50 millilitres de milieu frais de BHI complété avec de l’érythromycine pour atteindre une DO 600 de 0,05. Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius en secouant à 180 rpm pendant six heures. Transférer chaque culture dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis jeter le surnageant, les congeler et les stocker à moins 80 degrés Celsius ou garder les pastilles sur la glace et effectuer directement la lyse mécanique des cellules.
Pour effectuer la lyse mécanique des cellules, ressuscitez les pastilles dans cinq millilitres de tampon A et transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres avec 3,5 grammes de billes de silice. Insérez les tubes dans un instrument de lyse à cellules mécaniques et exécutez un cycle de 40 secondes à quatre mètres par seconde. Centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes, puis récupérer le surnageant et le garder sur glace.
Assurez-vous que le surnageant est clair, en répétant la centrifugation si ce n’est pas le cas. Retirez la pointe de la colonne, puis mettez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultrapure. Ajouter 300 microlitres de résine amylose et laver la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Diluer 1, 200 picamoles de protéine MBP-MS2 dans six millilitres de tampon A et le charger dans la colonne.
Lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Ensuite, effectuez une purification d’affinité MS2. Chargez le lysat de la cellule dans la colonne et collectez la fraction d’écoulement dans un tube de collecte propre. Laver la colonne trois fois avec 10 millilitres de tampon A et recueillir la fraction de lavage, puis éluer la colonne avec un millilitre de tampon E et recueillir la fraction d’élution dans un microtube de deux millilitres.
Conservez toutes les fractions collectées sur la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN. Utilisez un millilitre de chaque fraction pour l’extraction de l’ARN. Ajouter un volume de phénol à l’ARN et mélanger vigoureusement, puis centrifuger le mélange à 16 000 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius.
Transférer la phase supérieure sur un microtube propre de deux millilitres. Ajouter un volume d’alcool isoamylique chloroforme et répéter la centrifugation, puis transférer la phase supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 100 % froid et 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à un pH de 5,2 et précipiter pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.
Le lendemain, centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 16 000 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez lentement l’éthanol avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter 500 microlitres d’éthanol froid à 80 % et centrifuger pendant cinq minutes.
Jetez l’éthanol en le pipetant lentement, puis séchez la pastille à l’aide d’un concentrateur à vide pendant cinq minutes en mode de fonctionnement. Ressusciter le culot dans un volume approprié d’eau ultrapure. Ce protocole a été employé pour étudier le targetome de RsaC dans S.aureus.
Plusieurs ARNm interagissant directement avec rsac ont été identifiés à l’aide de la technologie MAPS, révélant son rôle crucial dans le stress oxydatif et les réponses liées aux métaux. Pour confirmer les constructions d’ARNs MS2 et visualiser leur modèle d’expression, des cellules ont été récoltées après deux, quatre et six heures de croissance dans le milieu BHI. L’ARN a été extrait et l’analyse de northern blot a été exécutée utilisant la sonde dig RsaC-spécifique.
Le niveau de RsaC endogène a augmenté de manière significative après six heures de croissance. Il est important de savoir que le niveau de MS2-RsaC 544 et ms2-RsaC 1, 116 était comparable à celui de RsaC endogène à six heures. La purification d’affinité a été exécutée et des ARN ont été extraits des fractions brutes d’extrait, d’écoulement et d’élution dans la souche de type sauvage exprimant la balise MS2 seule et la souche mutante RsaC exprimant la construction MS2-RsaC 544.
Le 1,116 nucléotide long endogène RsaC a été enrichi dans la fraction d’élution, mais a interagi non spécifiquement avec la colonne d’affinité en raison de sa longueur et de sa structure secondaire complexe. Le MS2-RsaC 544 a été fortement enrichi en fraction d’élution démontrant qu’il a été retenu avec succès par la protéine de fusion MS2-MBP. Une analyse bioinformatique a révélé des cibles putatives d’ARNm selon le changement de pli entre l’ARNsM MS2 et le contrôle de l’ARNm2, indiquant que la sodA était la première cible putative.
Une analyse par transfert Northern a effectué une sonde DIG spécifique à la sodA après purification par affinité MS2 montre que la sodA a été efficacement co-enrichie avec MS2-RsaC 544 par rapport au contrôle MS2. Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que l’ajout de la balise MS2 peut affecter la confirmation, la stabilité ou la fonction de l’ARNs. Cela devrait être surveillé de près.
MAPS fournit un instantané de l’appariement des cibles ARN-ARN. Une validation expérimentale plus poussée démêlera leur fonction. Cette technique représente un outil puissant pour construire des réseaux de régulation de l’ARNs dans toutes les bactéries.
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Aperçu
La technologie MAPS permet l'identification du targetome d'ARN régulateurs spécifiques in vivo, en particulier chez les bactéries à Gram positif. Cette méthode utilise une purification par affinité MS2 et le séquençage ARN pour co-purifier et identifier les partenaires ARN.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Microbiologie
- Biologie de l'ARN
Contexte
- Comprendre les réseaux régulateurs dépendants des ARN courts est essentiel pour étudier le comportement bactérien.
- L'identification des partenaires d'ARN peut éclairer les mécanismes des facteurs de virulence et de la formation de biofilms.
- La technologie MAPS permet l'identification indépendante des partenaires d'ARNs.
- Ce protocole s'applique aux bactéries à Gram positif, tant pathogènes que non pathogènes.
Objectif de l'étude
- Caractériser les réseaux régulateurs dépendants des ARN courts chez les bactéries.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de survie bactériens au sein des cellules hôtes.
- Développer des stratégies contre les infections staphylococciques.
Méthodes utilisées
- Purification par affinité MS2 couplée à un séquençage ARN.
- Culture de souches bactériennes en milieu BHI avec érythromycine.
- Co-purification de l'ARNs et de ses partenaires pour analyse.
- Identification des partenaires ARN par des techniques de séquençage.
Résultats principaux
- Identification réussie des partenaires d'ARNs petits dans les bactéries à Gram positif.
- Connaissances approfondies sur les réseaux régulateurs affectant la virulence et la survie.
- Démonstration du protocole par un étudiant en doctorat du laboratoire du Dr Pascal Romby.
- Applications potentielles dans la lutte contre les infections bactériennes.
Conclusions
- La technologie MAPS est un outil puissant pour l'étude des interactions ARN.
- La compréhension des réseaux d'ARNs peut conduire à de meilleures stratégies thérapeutiques.
- Cette méthode peut être adaptée à diverses espèces bactériennes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La technologie MAPS permet une cartographie complète du targetome des ARr régulateurs de petite taille chez les pathogènes à Gram positif, facilitant la validation des cibles dans le cadre de la découverte d'agents antimicrobiens. En révélant les interactions ARr-ARNm qui influencent la virulence et la survie, elle réduit les risques mécanistiques pour les programmes antibactériens en phase précoce. Cette approche renforce la confiance prédictive dans le choix des cibles ARr pour une intervention thérapeutique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des réseaux régulateurs dépendants des ARN courts afin de préciser les hypothèses thérapeutiques chez les bactéries à Gram positif.
- Valeur opérationnelle : Fournit un aperçu des cibles des ARN courts afin d'accompagner la détection biologique des risques et la validation fonctionnelle des cibles.
- Valeur scientifique : Identifie des cibles d'ARNm putatives telles que sodA, reliant l'activité des ARN courts aux voies de réponse au stress oxydatif et aux métaux.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives de séquençage ARN à partir de fractions co-purifiées afin de permettre une identification reproductible des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise la capture par fusion MS2-MBP sur résine amylose, permettant une montée en échelle de l'essai chez différentes souches de bactéries Gram-positives.
- Valeur scientifique : Fournit des paramètres d'enrichissement (par exemple, la fraction d'élution) pour distinguer les interactions ARN spécifiques des interactions non spécifiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie les régulons d'ARNr à des sorties phénotypiques telles que la production de facteurs de virulence et la formation de biofilms chez Staphylococcus aureus.
- Valeur opérationnelle : Soutient l'alignement translationnel des biomarqueurs en associant l'activité des ARNr aux voies de réponse au stress pertinentes pour l'infection.
- Valeur scientifique : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en validant les cibles d'ARNr par des méthodes orthogonales telles que le Northern blot.
Intégration du pipeline et du flux de travail
MAPS s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible à l'optimisation du composé précurseur, en particulier pour les programmes antibactériens ciblant la régulation basée sur l'ARN.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur la fonction des ARN courts en cartographiant les interactomes d'ARN in vivo dans des conditions de croissance définies.
- Écrantage : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles normalisés de lyse, de capture par affinité et d'extraction d'ARN, compatibles avec le séquençage.
- Analyse : Fournit des mesures de rapport d'expression entre les fractions MS2-ARN court et les fractions témoins afin de hiérarchiser les cibles les plus fiables pour des analyses complémentaires.
- Recherche translationnelle : Relie les cibles des ARN courts aux mécanismes de survie de l'hôte, orientant la validation préclinique de stratégies anti-infectieuses.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour le profilage des cibles des ARN courts chez des espèces Gram-positives pathogènes et non pathogènes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans l'identification des cibles des ARN courts, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la régulation post-transcriptionnelle.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la capture des interactions ARN-protéine dans des lysats bactériens.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions de type aller/stop dans le choix des cibles antimicrobiennes, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des cibles d'ARN courts fondée sur les données d'enrichissement et la corrélation phénotypique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en clonage moléculaire, culture bactérienne et manipulation d'ARN.
- Nécessite une infrastructure de lyse mécanique, des systèmes de chromatographie et des capacités de séquençage de l'ARN.
- Exige une standardisation interéquipes pour la conception des constructions (par exemple, fusions MS2-sARN) et la validation de leur expression.
- Suppose de prendre en compte des adaptations concernant la stabilité et la structure secondaire des sARN lors de l'application à divers modèles de bactéries Gram-positives.
- Limite pratique : les cibles présumées nécessitent une validation orthogonale (par exemple, Northern blot) afin de confirmer la spécificité, en raison de possibles interactions non spécifiques.
