Summary
Vi presenterar ett mikrofluidiskt system för hög genomströmningsstudier på komplexa livsmaskiner, som består av 1500 kulturenheter, en rad förbättrade peristaltiska pumpar och en blandningsmodul på plats. Det mikrofluidiska chippet möjliggör analys av de mycket komplexa och dynamiska mikromiljöförhållandena in vivo.
Abstract
Härma in vivo miljöförhållanden är avgörande för in vitro-studier på komplexa livsmaskiner. Nuvarande tekniker som riktar sig till levande celler och organ är dock antingen mycket dyra, som robotteknik, eller saknar nanolitervolym och millisekekunders tidsnoggrannhet vid vätskemanipulation. Vi presenterar häri design och tillverkning av ett mikrofluidiskt system, som består av 1 500 kulturenheter, en rad förbättrade peristaltiska pumpar och en blandningsmodul på plats. För att demonstrera kapaciteten hos den mikrofluidiska enheten upprätthålls neurala stamcellssfärer (NSC) i det föreslagna systemet. Vi observerade att när NSC-sfären utsätts för CXCL dag 1 och EGF i dag 2, är den rundformade konformationen väl underhållen. Variation i inmatningsordningen för 6 läkemedel orsakar morfologiska förändringar i NSC-sfären och uttrycksnivå representativ markör för NSC-stemness (dvs. Hes5 och Dcx). Dessa resultat tyder på att dynamiska och komplexa miljöförhållanden har stora effekter på NSC-differentiering och självförnyelse, och den föreslagna mikrofluidiska enheten är en lämplig plattform för studier med hög genomströmning på de komplexa livsmaskinerna.
Introduction
Tekniker med hög genomströmning är avgörande för biomedicinska och kliniska studier. Genom att parallellt genomföra miljontals kemiska, genetiska eller levande cell- och organoidtester kan forskare snabbt identifiera gener som modulerar en biomolekylär väg och anpassa sekventiell läkemedelsinmatning till ens specifika behov. Robotik1 och mikrofluidiska chips i kombination med ett enhetskontrollprogram gör det möjligt att automatisera komplexa experimentella procedurer, som omfattar cell-/vävnadsmanipulation, vätskehantering, avbildning och databehandling/datakontroll2,3. Därför kan hundratals och tusentals experimentella tillstånd upprätthållas på ett enda chip, enligt önskad genomströmning4,5.
I detta protokoll beskrev vi design och tillverkning förfarandet för en mikrofluidisk enhet, som består av 1500 kultur enheter, en rad förbättrade peristaltic pumpar och på plats blandning modulus. Cellkulturkammaren på 2 nivåer förhindrar onödig sax under medium utbyte, vilket säkerställer en ostörd kulturmiljö för långsiktig levande cellavbildning. Studierna visar att den föreslagna mikrofluidiska enheten är en lämplig plattform för studier med hög genomströmning av de komplexa livsmaskinerna. Dessutom tillåter de avancerade egenskaperna hos det mikrofluidiska chipet automatiserad beredning av mycket komplexa och dynamiska mikromiljöförhållanden in vivo, som de ständigt växlande cytokinerna och ligandskompositionerna6,7, vars slutförande tar månader för konventionella plattformar som 96-brunnsplatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofluidisk chipsdesign
- Designa den mikrofluidiska multiplexern bestående av 18 inlopp, som var och en styrs av en enskild ventil och en peristaltisk pump. För att öka vätskevolymen som drivs av per pumpcykel, få den peristaltiska pumpen att bestå av 3 styrkanaler, som avsiktligt breddades till 200 μm och 10 anslutna flödesledningar.
- Designa den savfria kulturkammaren. Replikeringen av 2-nivå kulturenheten består av en lägre cellkulturkammare (400 μm x 400 μm x 150 μm) och ett högre buffertskikt (400 μm x 400 μm x 75 μm), vilket förhindrar oönskad saxspänning på celler under mellanutbyte (figur 1).
- Designa funktioner för hög genomströmning. Duplicera kulturenheten för att bilda en matrislayout på 30 x 50, som upptar ett område på cirka 7 cm x 5 cm i storlek.
2. Chiptillverkning och funktion
- Tillverkning av replikformningen med UV-litografi
OBS: Replikformningen tillverkades på kiselskiva enligt standardfotolitografiprotokollet8.- Tillverkning av kanalstrukturerna
- Snurrande fotoresist: Snurra kappa 5 ml av SU-8 3025 negativ fotoresist på en kiselskiva vid 500 rpm för 10 s och 3000 rpm för 30 s.
- Mjuk bakning: Lägg skivan på en kokplatta vid 65 °C i 2 min och sedan 95 °C i 10 min, Kyl ner den till rumstemperatur.
- Justering och härdning: Fäst skivan och masken på justeringshållaren och slå på ljuskällan i 18 s för att bota den exponerade fotoresisten.
- Förpostexponering baka: Rampa upp skivan till 95°C vid 110°C/h från rumstemperatur och håll den minst 40 minuter tills den tas bort.
- Utveckla: Doppa skivan i utvecklingslösningen (SU-8-utvecklaren) och omrör den i 2,5 minuter för att tvätta bort redundant fotoresist och få den 25 μm höga kanalstrukturen.
- Hårdbak: Täck skivan med petriskål i glas och grädda vid 65 °C i 2 min, rampa sedan upp till 160 °C vid 120 °C/h och håll den i 3 timmar.
- Tillverkning av cellkulturkammaren med buffertskiktet
- Använd parametrarna i steg 2.1.1.1 för att snurra kappan 7 ml av SU-8 3075 negativ fotoresist på ovanstående skiva.
- Mjuk grädda (beskrivs i steg 2.1.1.2) skivan och ändra masken så att den överensstämmer väl med markörer på skivan. Slå sedan på ljuskällan i 24 s för att bota den exponerade fotoresisten.
- Doppa skivan till utvecklingslösningen (SU-8-utvecklaren) och omrör den i 4 minuter och 40 sekunder för att tvätta bort redundant fotoresist och få en 75 μm hög lagerstruktur som runt den 25 μm höga kanalstrukturen som tillverkats tidigare. Hårdbakad (beskriven i steg 2.1.1.6) skivan för att göra den komplexa strukturen starkare.
- Upprepa steg 2.1.2.1-2.1.2.3 för att tillverka en 75 μm hög kammarstruktur som staplas på lagerstrukturen.
- Tillverkning av ventilstrukturerna
- Använda parametern i steg 2.1.1.1 för att snurra kappan 5 ml av AZ 50x positiv fotoresist på ovanstående skiva.
- Mjuk grädda (beskrivs i steg 2.1.1.2) skivan och gör masken väl i linje med markörer på skivan och håll sedan ljuskällan på i 20 s och av omedelbart i 30 s. Upprepa lampan på/ av proceduren i 5 cirklar för att bota den exponerade fotoresisten.
- Doppa skivan för att matcha utvecklaren och agitera den i ca 8 min för att tvätta bort redundant fotoresist och få de rundformade ventilerna som överlappar styrkanalerna för att säkerställa god anslutning. Hårdbak (beskrivs i steg 2.1.1.6) den mönstrade skivan för att göra hela modellen starkare.
- Tillverkning av kanalstrukturerna
- Mikrofluidisk chipproduktion med mjuk litografi
- Behandla de mönstrade och tomma kiselplattorna med rimetylklorosilan i 15 minuter.
- Bered 3 portioner PDMS-gel (10:1 monomer/katalysatorförhållande) motsvarande 50 g flödesskikt, 20 g kontrollskikt 2 respektive 20 g membran.
- Gjut 50 g PDMS-gel på den mönstrade kiselskivan och gasa dem i 1-2 timmar i vakuumkammaren vid -0,85 MPa för att kopiera flödesskiktet.
- Avgasa de 2 portionerna av 20 g PDMS och snurra den på den mönstrade skivan och en tom kiselskiva vid 2000-2800 varv/min i 30 s för att förbereda ett kontrollskikt och membranskikt.
- Sätt de PDMS-täckta skivorna i ventilerande ugn i 60 min vid 80 °C för inkubation.
- Justera och bind ihop de olika lagren genom anpassad optisk enhet (zooma in 100x) och plasmaetsningsmaskin. Förvara den sedan i en ventilerande ugn i 2 timmar vid 80 °C för att förbättra bandet av chipet.
- Stansa inloppshålen på chippet och bind det sedan på ett PDMS-belagt täckskydd och härdat i minst 12 timmar vid 80 °C före användning.
- Chipdrift
- Anslut miniatyrpneumatiska magnetventiler till spånets kontrollskikt och öppna det anpassade MATLAB-grafiskaanvändargränssnittet 8 för att länka och styra strömbrytaren.
- Ställ in stängningstrycket på push-up PDMS-membranventiler till 25 psi.
- Leverera dynamiskt föränderliga kombinatoriska/sekventiella ingångar tillangivna kammare (figur 2d)genom att ventilerna sätts av i tid.
3. Generering av dynamiska ingångar i cellulära mikromiljö
- Spånbehandling och cellbelastning
- Håll standardförhållandena för odling (37 °C, 5 % CO2)på mikroskopet i minst 5 timmar.
- Fyll chippet med beläggningsmedium (dvs. som nämns i ANMÄRKNINGEN) och inkubera det vid standardkulturförhållandena (beskrivet i steg 3.1.1) i minst en timme.
- Spola chipet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller cellkulturmedium (Dulbecco's Modified Eagles medium, DMEM) för att bygga en hälsosam odlingsmiljö.
- Skörda celler vid 80% konfluens och återanvänd cellerna med odlingsmedia (DMEM) med en densitet på ~ 106/ ml. Ladda sedan celler i chipet genom att tryck på den cellinnehållande lösningen.
OBS: För att odla olika cellinjer på chip krävs motsvarande beläggningsmedium för att behandla cellodlingskammaren. Vanligtvis, för experiment på 3T3 fibroblast och vidhäftande kultur av kammare är alla ventiler som styr kulturkamrarna öppna, celler strömmar in i alla odlingskammare inom samma kolumn.
- Installation för livecellsavbildning med högt dataflöde
OBS: För bildförvärv användes ett inverterat mikroskop med ett automatiserat translationellt stadium och en digital kompletterande halvledarkamera av metalloxid (CMOS). Scen- och bildförvärvet kontrollerades via den anpassade programvaran.- Visualisera matrisen i kulturkammare med hjälp av 10x objektivlins i ljust fält för att bekräfta och definiera platskoordinaterna för varje kammare i matrisen 30 x 50.
- Omvandla objektivet till 20x eller 40x, välj sedan platskoordinaterna för önskad kammare och översättningsstadiet flyttas till tilldelad position efter bekräftelse. Finjustera x, y, z-fokalplanet för att få en optimal bild.
- Optimal ljusintensitet, exponeringstid och andra bildparametrar fastställdes individuellt för varje kanal (dvs. ljusfälts- och fluorescensavbildning).
- Ställ in intervallet och varaktigheten för bildcykeln, spara banan och starta sedan avbildningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den konventionella peristaltiska pumpen på chip beskrevs först av Stephen Quake år 2000, med vilken peristalsisen aktiverades av mönstret 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Siffran 0 och 1 anger "öppen" och "stäng" av de tre horisontella kontrolllinjerna. Studier med mer än 3 ventiler (t.ex. fem) har också rapporterats11. Även om den peristaltiska pumpen som består av 3 styrledningar och 3 flödesledningar ger nanoliternoggrannhet, är transporthastigheten för långsam för att mata 1 500 kulturkammare. För att lösa problemet inkluderar vi fler flödesledningar (dvs. de 10 anslutna kanalerna) för att öka vätskevolymen som drivs av per pumpcykel (dvs. 101, 100, 110, 010, 011, 001). Således kan näringsämnena och drogerna effektivt levereras till utsedda kammare. Den peristaltiska pumpen transporteras vätskevolymen kan öka med 16x till ~ 50 nanoliter per pumpcykel. Eftersom matrisen av peristaltiska pumpar styrs av 3 anslutna styrkanaler (figur 1b), levereras lösningarna från varje inlopp samtidigt till chippet och möjliggör omedelbar blandning. Kombinatoriska och sekventiella ingångar kan därför genereras genom att de inlopp som är anslutna till olika lösningar är i rätt tid. Med samma metodik kan dynamiska varierande cytokin- och ligandkoncentrationer också genereras. Till exempel kan valda kombinationer av 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L och 4 tomma kulturmedier generera en sinusvågfluktuation (mellan 0 och 0,5 g/L) i koncentration med stegstorlekar från 0,0005 till 0,01 g/L.
För primärcellskulturen är det viktigt att upprätthålla en stabil mikromiljö. Shear stress och utmattning av konditionerat medium under medium utbyte kommer att påverka cellulärt beteende och cell öde12. För att komma till rätta med dessa problem utformar vi ett buffertlager för att förhindra oönskad saxbelastning på celler under medium exchange(figur 1c). Till skillnad från de konventionella odlingsenheterna är de främsta fördelarna med enheten (dvs. ventilstyrda) deras förmåga att blanda, leverera och underhålla oberoende förhållanden på plats. I figur 2dvisade vi att ett komplext kinesiskt ord kan skapas på chip via exakt leverans av vätskor till utsedda positioner och underhåll av ett opåverkat tillstånd i enskilda kulturkammare. Den aktiva fluidiska enhetens kapacitet vid blandning på plats illustreras med ett videoklipp som visar de dynamiskt föränderliga FITC-koncentrationerna i en kulturkammare (figur 3c och video 7:47-7:50), som uppnås genom att styra pumphastigheten för 2 oberoende peristaltiska pumpar anslutna till 2 inlopp12. Numerisk simulering tyder på att när mediet riktas uppifrån och ner genom kulturkamrarna når klippflödet snabbt botten av kulturbrunnen (Video 4:07-4:25). Savkrafterna kan effektivt förhindras när lösningen riktas från vänster till höger. Även vid ett ingångsflöde på 10 mm/s förblir cell- eller mikrometerstor vävnad ostörd längst ner på odlingsenheten.
Som visas i figur 3b(1) styrs varje inlopp av en annan ventil än den nedre peristaltiska pumpen. När ett läkemedel väljs ut för att levereras till utsedda kamrar är inloppet som är anslutet till läkemedlet öppet och driften av matrisen av den peristaltiska pumpen transporterar endast detta läkemedel. För 2 eller flera droger öppnar vi helt enkelt de anslutna inloppen för att generera en blandning av droger med samma volym. Vi integrerar också en oberoende peristatisk pump oberoende av matrisen (Figur 2g), som kan fungera med en annan pumphastighet än matrisen och därför generera olika utspädningar. För att efterlikna de dynamiska miljöförhållandena in vivo NSC genererades sekventiellt och kombinatoriskt tillstånd på 6 ligander (dvs. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), som består av 720 och 56 olika förhållanden, med hjälp av matrisen av peristaltiska pumpar och levererades till de utsedda kamrarna. I detalj kan sekventiella förhållanden representeras som Sij = {ligand i läggs till på dag j} och ett kombinatoriskt tillstånd som Ci = {ligand i är närvarande}, där ligand i = Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF och j=1,2,3,4,5,6. Svar från NSC celler och sfärer registrerades varannan timme under kultur och stimulering.
NSC-sfärer upprätthålls i 400 μm med 400 μm cellkulturkammare (figur 2e och figur 4). Differentiering och stemness (dvs. självförnyelse) av stamcellerna representeras av uttrycksnivån för Dcx respektive Hes5. Vi observerade att när NSC-sfären utsätts för CXCL dag 1 och EGF i dag 2, är den runda formade konformationen väl underhållen och det finns en uppenbar ökning av sfärens storlek. NSCs med hög-Dcx uttrycksnivå dö på 3rd dagen när EGF ersätts av PACAP, vilket tyder på effekter på de differentieradecellerna 13,14,15,16. Celler börjar fästa på obehandlad PDMS-yta vid stimulering av DLLden 4: e dagen och dissociate i enskilda celler med tillsats av PDGF den 5:e dagen och Jagged på den 6:e dagen. Förändringar i ingångsordningen för dessa 6 ligands ger särskiljande NSC-status(figur 5). Till exempel varierar utveckling av NSCs dramatiskt när CXCL växlar position med PDGF längs sekvensen (Figur 5a och 5b). Dessa resultat visar att de dynamiska varierande miljöförhållandena har stora effekter på NSCs differentiering och självförnyelse, vilket banar väg för utveckling av plattformar för biomedicinska studier samt kliniska tillämpningar.
Bild 1:Design av mikrofluidchipet med hög genomströmning. Den förbättrade peristaltiska pumpen består av flera flödeskanaler och breddade styrkanaler, vilket leder till en ökning av den överförda vätskevolymen per pumpcykel. b. Det är inte så att det Matrisen av peristaltiska pumpar styrs av 3 anslutna styrledningar. Därför kan införandet av olika inlopp vid programmerade tidpunkter generera kombinatoriska, sekventiella och dynamiska varierande ingångssignaler. c. I. För att förhindra oönskat savflöde designade vi en 2-nivå kulturenhet. Cellerna hålls längst ner på den lägre nivån, vilket är 150 μm i djup. d. I. Varje kulturkammare är ansluten till 4 kanaler, vilket gör att lösningen kan riktas genom uppifrån och ner och vänster-höger riktningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Tillverkning av mikrofluidchips med hög genomströmning. Mikrostrukturer av kontroll- och flödeslager var först mönstrade på kiselplattor, på vilka PDMS är gjuten för replikering. b. Det är inte så att det Styr-, membran- och flödesskikten är justerade och sammansplade med plasmaetsning och termisk bindning. c-f. Chippets avancerade egenskaper demonstreras med gröna, blå och gula matfärger. Vi visar att genom att ventilerna är avstängda i rätt tid kan lösningar med nanoliternoggrannhet levereras till de utsedda kamrarna. g. Matrisen av peristaltiska pumpar styrs av 3 anslutna manöverledningar (dvs. Control-1) och en oberoende peristaltisk pump som styrs av andra 3 manöverledningar (dvs. Control-2). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Ett schema som visar den aktiva flytande enheten. Ett schema som visar att (a)celler flödar genom förbikopplingskanalen. b)Ventiler som styr inloppet och den peristaltiska pumpen. ochc)celler strömmar in i odlingskamrarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa bilder av NSC-sfären när de stimuleras av sekventiella läkemedelsinmatningar. Ljusa fält (översta raden), Hes5-GFP (andra raden), Dcx-Desred (tredje raden) bilder visar att vid sekventiell stimulering sker betydande celldöd bland både Dcx-höga och Hes5-höga celler. Framväxten av det mörka området tyder på stamcellernas död, som lokaliserar mestadels i kärnregionen. Skalbar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Variationer i NSC-sfärkonformation, Dcx- och Hes5-uttrycksnivå, när de stimuleras av olika sekventiella ingångar. Det visas att variation i ingångsordningen för 6 läkemedel orsakar förändringar i vävnad, morfologiska och uttrycksnivå för signalmolekyler, vilket indikerar känsligheten hos NSC-sfären för de dynamiska miljöförhållandena. Indatasekvenserna: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Jagged,( b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Jagged, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Jagged, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Jagged. Skalbar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika mikrofluidiska enheter har utvecklats för att utföra multiplexerade och komplexa experiment17,18,19,20. Mikrobrunnar gjorda av en matris med topologiska urtag kan till exempel fånga enskilda celler utan användning av yttre kraft, som visar fördelaktiga tecken inklusive liten provstorlek, parallellisering, lägre materialkostnad, snabbare svar, högkänslighet 21,22,23,24. Droppe och ytspänning begränsad droppe eliminerar behovet av hjälphårdvara som en mikropump, vilket gör transporten av droppar mer billig ochmiljövänligare 25,26. Droppar av vätskor kan lätt deponeras på ytan av mikropipetter eller sprutmunstycken, och efter experimenten kan systemen underlättas och återanvändas27,28. Slipchip-tekniken möjliggör multiplexerade reaktioner utan inblandning av integrerade pumpar eller ventiler, och därför användarvänliga och producentvänliga29,30. Dessa system står dock inför ett antal tekniska hinder, såsom lagring av nanoliterlösningar i mikrobrunnar, kontroll av fuktighet och begränsningar av parallell teknik för vätskedispensering med låg volym.
I det här dokumentet beskrev vi ett protokoll för biomedicinska experiment med hög genomströmning med hjälp av livecellavbildningssystem och en anpassad mikrofluidisk enhet. Förfarandena för chiptillverkning inklusive UV och mjuk litografi, och inställningsparametrar för automatisk fluorescerande avbildning demonstreras i detalj. Resultaten visar att de avancerade funktionella funktionerna (dvs. kulturkammaren på 2 nivåer och den förbättrade peristaltiska pumpen) i det föreslagna mikrofluidiska chipet överträffar tidigare rapporterade enheter och uppfyller behoven av att genomföra tusentals parallella experiment. Vi beskrev också de avgörande parametrarna (t.ex. underhåll av konditionerat medium) som man noggrant bör kontrollera för att upprätthålla hälsosamma miljöer för odling av primär- och stamceller.
Cellbaserade biomedicinska experiment, som inkluderar komplexa protokoll och programmerad tillsats av kemikalier, anses ofta tidskrävande och mödosamma. Till exempel, förutom cellmanipulationsförfarandena, kräver kombinatoriska ingångar av 6 droger med timpåfyllning minst 250 pipettingsteg per timme och upprepning till slutet av experimentet. Dessutom kräver modellering av dynamiska miljöförhållanden in vivo att man i rätt tid tillför en eller flera cytokiner, ligands och läkemedel med noggrannheten i sekunder, vilket är omöjligt för manuell drift. Vi häri visar att genom att ansluta inloppen av chipet till flera droger, eller olika koncentrationer av enda läkemedel, kombinatoriska, sekventiella och dynamiskt varierande ingångssignaler kan genereras och upprätthållas i de savfria cellulära miljöerna. De morfologiska och kemiska reaktionerna hos celler och vävnader, som upprätthålls i de parallellt löpande odlingskamrarna, kan sedan övervakas i realtid med hjälp av den kommersiella mikroskopprogramvaran.
Med ökande genomströmning av mikrofluidiska enheter och automatiserad datainsamling under bioimaging kan livecellavbildningssystemet generera tusentals bilder varje timme. Till exempel genererar kontinuerlig körning av 1500-enhetschipet i en vecka 252 000 bilder. Det kan ta månader att manuellt spåra utvecklingen av vävnader och cellpopulationer (t.ex. uttrycksnivån för fluorescerande märkta biomolekyler) på encellsnivå. Med hjälp av ett anpassat MATLAB-program kan de massiva data automatiskt sorteras, formateras och analyseras. Spår som visar rörlighet, morfologiska egenskaper och uttrycksnivå för signalmolekyler kan hämtas (visas i videon), vilket undviker mänskliga fel och sparar mycket tid.
Därför visar den metodik vi demonstrerar här lämpliga protokoll för att utföra biomedicinska experiment med hög genomströmning med automatiserad cell- och vävnadsmanipulation, fluorescerande avbildning och dataanalys. Avstängningsavkopplingen av membranventiler ger optimal vätskevolym, tid och rumslig upplösning för att rekonstruera de ständigt föränderliga och komplexa miljöförhållandena för in vitro som ett organ-på-chip. Även om protokollet är betydligt mer komplext jämfört med de biomedicinska övergångsmetoderna (t.ex. manuella förfaranden med 96-brunnsplattor), är det presenterade protokollet och plattformen inte begränsade till studier av cell- och vävnadsfunktioner. Screening av kombinatoriska och sekventiella läkemedel input kan göra det möjligt för oss att utveckla terapier för kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författare bekräftar det tekniska stödet från Zhifeng Cheng från Chansn Instrument (Kina) LTD. Detta arbete stöddes av bidrag (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
