Summary
We beschrijven een aangepaste methode op basis van agar die is ontworpen om de antischimmeleffecten van plantaardige producten te kwantificeren. Zowel volatiele als niet-volatiele bijdragen aan de antischimmelactiviteit kunnen via dit protocol worden beoordeeld. Bovendien kan de werkzaamheid tegen schimmels worden gemeten in belangrijke ontwikkelingsstadia in één experimentele opstelling.
Abstract
Het beschreven protocol is gebaseerd op een plug-transfer techniek die nauwkeurige bepaling van micro-organismenhoeveelheden en hun ontwikkelingsstadia mogelijk maakt. Een bepaald aantal sporen wordt verspreid op een agarplaat. Deze agarplaat wordt gedurende een bepaalde periode geïncubeerd om de schimmels in staat te stellen het verwachte ontwikkelingsstadium te bereiken, behalve voor sporen waar incubatie niet vereist is. Agarpluggen bedekt met sporen, hyphae of mycelium worden vervolgens teruggetrokken en overgebracht naar agarmedia die de antischimmelverbinding bevatten die moet worden getest, hetzij op afstand van de schimmels, hetzij in contact. Deze methode is van toepassing op het testen van zowel vloeibare extracten als vaste monsters (poeders). Het is bijzonder geschikt voor het kwantificeren van de relatieve bijdragen van vluchtige en niet-vluchtige agentia in bioactieve mengsels en voor het bepalen van hun effecten, met name op sporen, vroege hyphae en mycelium.
De methode is zeer relevant voor de karakterisering van de antischimmelactiviteit van biocontroleproducten, met name plantaardige producten. Voor de behandeling van planten kunnen de resultaten inderdaad worden gebruikt om de keuze van de toepassingswijze te begeleiden en om de triggerdrempels vast te stellen.
Introduction
Wereldwijde verliezen van groenten en fruit kunnen oplopen tot 50% van productie1 en zijn voornamelijk het gevolg van voedselbederf veroorzaakt door schimmelbederf in het veld of tijdens opslag na de oogst2,3, ondanks de uitgebreide werkgelegenheid van synthetische fungiciden sinds het midden van de twintigste eeuw4. Het gebruik van deze stoffen wordt heroverwogen omdat het ernstige gevaren voor het milieu en de gezondheid met zich mee brengt. Aangezien de schadelijke gevolgen van het gebruik ervan in ecosystemen zichtbaar zijn en het bewijs van mogelijke gevolgen voor de gezondheid zich heeft opgehoopt5,6, worden nieuwe alternatieven voor oude profylactische strategieën ontwikkeld voor pre - en post-harvest behandelingen7,8,9. Vandaar dat de uitdaging waar we voor staan tweeledig is. Nieuwe fungicide strategieën moeten ten eerste de werkzaamheid van voedselbescherming tegen fytopathogenen handhaven en tegelijkertijd bijdragen tot een drastische vermindering van de ecologische voetafdruk van landbouwpraktijken. Om dit ambitieuze doel te bereiken, worden strategieën voorgesteld die zijn geïnspireerd op de natuurlijke afweer die in planten is geëvolueerd, aangezien meer dan 1000 plantensoorten zijn gemarkeerd vanwege hun antimicrobiële eigenschappen8. Planten die bijvoorbeeld natuurlijke fungiciden hebben ontwikkeld om fytopathogenen te bestrijden, zijn een nieuwe bron bij het verkennen van de ontwikkeling van nieuwe biocontroleproducten2. Etherische oliën zijn vlaggenschipmoleculen van dit type. Bijvoorbeeld, Origanum essentiële olie beschermt tomatenplanten tegen grijze schimmel in kassen 10 en Solidago canadensis L. en cassia essentiële oliën zijn aangetoond dat het bewaren van nageoogst aardbeien tegen grijze schimmel schade11,12. Deze voorbeelden illustreren dat biocontrole en met name plantaardige producten een oplossing vormen die biologische werkzaamheid en ecologische duurzaamheid combineert.
Planten zijn dus een belangrijke bron van moleculen die van potentieel belang zijn voor de gewasbeschermingsindustrie. Er is echter slechts een handvol plantaardige producten voorgesteld om als biocontroleproducten te worden gebruikt, ook al worden zij algemeen erkend als veilig, niet-fytotoxisch en milieuvriendelijk2. Er zijn enkele problemen waargenomen bij de omzetting van het laboratorium naar het veld , zoals een afname van de werkzaamheid na toepassing in vivo2,9. Het wordt dus belangrijk om het vermogen van laboratoriumtests te verbeteren om de veldefficiëntie beter te voorspellen. In dit verband zijn antischimmeltestmethoden voor plantaardige producten nodig, zowel om hun antischimmeleffectiviteit te evalueren als om hun optimale gebruiksomstandigheden te definiëren. In het bijzonder zijn biocontroleproducten over het algemeen minder efficiënt dan chemische fungiciden, dus een beter begrip van hun werkingswijze is belangrijk voor het voorstellen van geschikte formuleringen, om de wijze van toepassing op gebieden te identificeren en om te bepalen welke ontwikkelingsfase van de ziekteverwekker kwetsbaar is voor het kandidaat-bioproduct.
Huidige benaderingen die antibacteriële en schimmelwerende activiteiten aanpakken, omvatten diffusiemethoden zoals agar-schijfdiffusie, verdunning, bioautografie en flowcytometrie13. De meeste van deze technieken, en meer in het bijzonder, de standaard antischimmelgevoeligheidstests - agarschijfdiffusie en verdunningstests - zijn goed aangepast voor het evalueren van de antimicrobiële activiteit van oplosbare verbindingen op bacteriële en schimmelsporen in vloeibare suspensuspensus14. Deze methoden zijn echter over het algemeen niet geschikt voor het testen van vaste verbindingen zoals gedroogd plantenpoeder of voor het kwantificeren van antischimmelactiviteit tijdens de groei van mycelium, omdat ze sporenverdunning of sporenverspreiding op agarplaten en/of verdunning van antischimmelverbindingen vereisen13. In de met voedsel vergiftigde methode worden agarplaten met het antischimmelmiddel ingeënt met een schijf met een diameter van 5-7 mm die is bemonsterd uit een 7-daagse oude schimmelcultuur zonder rekening te houden met de precieze hoeveelheid starten van mycelium. Na incubatie wordt de antischimmelactiviteit bepaald als een percentage van de radiale groeiremming17,18,19. Met deze aanpak kunnen we de antischimmelactiviteit op myceliale groei evalueren. De agarverdunningsmethode wordt daarentegen uitgevoerd om de antischimmelactiviteit te bepalen op sporen die direct zijn ingeënt op het oppervlak van de agarplaat die de antischimmelverbindingen bevat13,20,21. Deze twee benaderingen geven complementaire resultaten op antischimmelactiviteit. Dit zijn echter twee onafhankelijke technieken die parallel worden gebruikt en die geen nauwkeurige vergelijking naast elkaar bieden van de relatieve werkzaamheid van antischimmelverbindingen op sporen en mycelium17,20,22 omdat de hoeveelheid beginnend schimmelmateriaal verschilt in de twee benaderingen. Bovendien is de antischimmelactiviteit van een plantaardig product vaak het gevolg van de combinatie van antischimmelmoleculen die door planten worden gesynthetiseerd om ziekteverwekkers onder ogen te zien. Deze moleculen omvatten eiwitten, peptiden23,24, en metabolieten met een grote chemische diversiteit en behorend tot verschillende klassen moleculen zoals polyfenolen, terpenen, alcaloïden25, glucosinolaten8, en organosulfurverbindingen26. Sommige van deze moleculen zijn vluchtig of worden vluchtig tijdens een aanval van ziekteverwekkers27. Deze middelen zijn meestal slecht in water oplosbare en hoge dampdrukverbindingen die moeten worden teruggewonnen door waterdestillatie als essentiële oliën, waarvan sommige antimicrobiële activiteiten goed zijn vastgesteld28. Dampfase gemedieerde gevoeligheidstesten zijn ontwikkeld om de antimicrobiële activiteit van vluchtige stoffen na verdamping en migratie via de dampfase te meten29. Deze methoden zijn gebaseerd op de introductie van antischimmelverbindingen op afstand van de microbiële cultuur29,30,31,32,33. In de veelgebruikte dampfase agartest worden essentiële oliën op een papierschijf afgezet en in het midden van de deksel van de Petrischaal geplaatst op afstand van de bacteriële of schimmelspoorsuspensie, die wordt verspreid op agarmedium. De diameter van de zone van groeiremming wordt vervolgens op dezelfde manier gemeten als voor de agar-schijfdiffusiemethode20,24. Er zijn andere benaderingen ontwikkeld om kwantitatieve meting te bieden van de dampfase antischimmelgevoeligheid van etherische oliën, afgeleid van de bouillonverdunningsmethode waaruit een remmende dampfase gemedieerde antimicrobiële activiteit werd berekend32, of afgeleid van agar-disk diffusietesten31. Deze methoden zijn over het algemeen specifiek voor dampfaseactiviteitsstudies en niet geschikt voor contactremmingstesten. Dit sluit de bepaling uit van de relatieve bijdrage van vluchtige en niet-vluchtige agentia aan de antischimmelactiviteit van een complex bioactief mengsel.
De kwantitatieve methode die we hebben ontwikkeld is bedoeld om het antischimmeleffect van gedroogd plantenpoeder te meten op gecontroleerde hoeveelheden sporen en gekweekt mycelium afgezet op het oppervlak van een agarmedium om de luchtgroei van fytopathogenen te reproduceren tijdens infectie van planten15 en een onderling verbonden myceliaal netwerk16. De aanpak is een aangepaste experimentele opstelling op basis van de agarverdunnings- en voedselvergifmethoden die in dezelfde experimentele opstelling ook een zij-aan-zij kwantificering van de bijdrage van zowel vluchtige als niet-vluchtige antischimmelmetabolieten mogelijk maakt. In deze studie is de methode vergeleken met de activiteit van drie goed gekarakteriseerde antischimmelpreparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inocula voorbereiding
- Leg voorafgaand aan het experiment 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporen bewaard bij 4 °C op aardappel dextrose agar medium (PDA) en gedurende 4 dagen incuberen bij 30°C met regelmatige blootstelling aan licht ter bevordering van conidiavorming42 (Figuur 1, paneel A).
OPMERKING: Trichoderma spp. SBT10-2018 is geïsoleerd van hout en wordt gebruikt als model in deze studie voor zijn snelle groei en gemak van sporenherstel. Deze soort wordt bewaard door ons laboratorium. - Herstel conidia (figuur 1, paneel A)
- Leg 3 ml van 0,05% Tween-20 op het Trichoderma mycelium.
- Gebruik een hark om conidia vrij te maken van conidioforen; vermijd het neerdrukken van het mycelium om te voorkomen dat hyphae wordt weggescheurd.
- Herstel de oplossing snel met een micropipet om te voorkomen dat deze wordt geabsorbeerd door het agarmedium en over te brengen in een buis van 15 ml.
- Tel het totale aantal sporen met behulp van een hemocytometer en bereid een oplossing voor die 3 x 106 sporen/ml bevat.
OPMERKING: Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat hyphae wordt geëxtraheerd. Sporenpreparaat wordt vervolgens onder de microscoop gecontroleerd. Uiteindelijk kan voor stammen met zeer lucht- en pluizig mycelium een stap van filtratie met behulp van 40 μM zeeffilter worden toegevoegd om resterend myceliumfragment te elimineren.
2. Voorbereiding schimmelplaten (figuur 1, paneel B)
- Deponeer 100 μL van 3 x10 6 sporen/ml met een micropipet op een petrischaal met een diameter van 9 cm met PDA-medium om 4.800 sporen/cm2 te verkrijgen die overeenkomen met 925 sporen/5 mm diameter-agarplug.
- Voeg 10 g glazen kralen met een diameter van 2 mm toe met een steriele spatel en voer parallelle en loodrechte bewegingen uit naar voren en naar achteren om de sporen op het oppervlak van de agar gelijkmatig te verdelen.
- Draai de plaat 90° en herhaal de draaiende bewegingen (zoals in punt 2.2); herhaal deze stappen totdat de plaat volledig is gedraaid.
- Gebruik de plaat onmiddellijk om experimenten op te zetten waarbij sporen nodig zijn of incubeer de platen bij 30 °C gedurende 17 uur of 24 uur wanneer vroege hyphae of mycelium nodig zijn.
OPMERKING: Om de antischimmelactiviteit gemeten na myceliumplug-transfer en myceliumschijfoverdracht te vergelijken, gebruikt u een steriel pincet en plaatst u steriele 5 mm celluloseschijven willekeurig op het oppervlak van de agarplaat na het verspreiden van sporen.
3. Antischimmelverbindingen voorbereiding
- Plantaardig productpreparaat: knoflookpoederbereiding
- Schil de teentjes verse knoflook en snijd de teentjes in plakjes van 2-3 mm breed met een scalpelmesje.
- Droog de plakjes 2 dagen aan 40 °C.
- Maal de plakjes 3 x 15 seconden met een messenmolen om een fijn poeder te verkrijgen.
- Bewaar het knoflookpoeder bij 4 °C in buizen van 50 ml voor gebruik.
OPMERKING: Omdat knoflook niet autoclaafd is (om de afbraak van temperatuurgevoelige antischimmelverbindingen te voorkomen) reinigt u de grinder, de scalpel en de luchtdroger voor gebruik met 70% ethanol.
- Bereiding van etherische olie
- Bereid 0,5%, 1%, 2,5%, 5% en 20% Thymus vulgaris etherische olieoplossingen in 0,5% Tween-80.
- Meng goed om een emulsie te vormen voordat u deze in het PDA-medium toevoegt (zie rubriek 4.2).
- Carbendazim voorbereiding
- Weeg carbendazim om een 200 mg/L ethanoloplossing te bereiden (carbendazim is slecht oplosbaar in water).
- Bewaar de oplossing op kamertemperatuur voordat u deze in het PDA-medium toevoegt (zie rubriek 4.2).
LET OP: Carbendazim vormt een gevaar voor de gezondheid en het milieu. Draag handschoenen en maskers bij het hanteren van dit product. Bewaar het in een geventileerde ruimte.
4. Contactremmingstest
- Bereiding van agarplaten die knoflookpoeder bevatten
- PDA-medium voorbereiden en autoclaaf.
- Weeg de gewenste hoeveelheid knoflookpoeder af in een buis van 50 ml met behulp van een steriele spatel, om concentraties te verkrijgen die over het algemeen variëren van 0,25 mg/ ml tot 16 mg / ml.
- Voeg 10 ml PDA toe nadat u de temperatuur van het medium aan de binnenkant van de pols hebt gecontroleerd. De temperatuur moet zo laag mogelijk zijn om afbraak van gevoelige moleculen te voorkomen. Idealiter zou deze temperatuur 45 °C moeten zijn.
- Homogeniseer voorzichtig door de buis ondersteboven te draaien om het poeder gelijkmatig in het PDA-medium te verdelen. Giet snel 10 ml in een petrischaal met een diameter van 5 cm(afbeelding 1,paneel C).
- Met de Petrischaal op kamertemperatuur geplaatst, wacht u tot de agar stolt.
- Bereiding van agarplaten die etherische olie of carbendazim bevatten
- Breng 10 ml PDA aan in een buis van 50 ml. Controleer de temperatuur zoals bij punt 4.1.3.
- Voeg 100 μL van de verschillende oplossingen van Thymus vulgaris etherische olie toe in PDA om 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% en 0,2% oplossingen te verkrijgen (zie rubriek 3.2.1).
- Voeg het vereiste volume carbendazim uit de 200 mg/L-oplossing toe om oplossingen te verkrijgen variërend van 0,0625-2 mg/L (zie rubriek 3.3.1).
- Homogeniseer voorzichtig door de buis ondersteboven te draaien, giet snel 10 ml in een petrischaal met een diameter van 5 cm(figuur 1,paneel C).
- Met de Petrischaal op kamertemperatuur geplaatst, wacht u tot de agar stolt.
- Contactremmingstest (figuur 1)
- Met een steriele roestvrijstalen buis met een diameter van 5 mm, plot u een cirkel in het midden van Petrischalen die PDA of PDA bevatten, inclusief antischimmelverbindingen. Gooi de agarcilinder weg met een steriele tandenstoker (paneel C).
- Met een steriele roestvrijstalen buis met een diameter van 5 mm, plotcirkels willekeurig in de schimmelplaten van sectie 2. Plot tussen 15-20 cirkels per plaat (paneel B).
- Trek de agarcilinders bedekt met sporen, vroege hyphae of mycelium voorzichtig terug met een steriele tandenstoker en plaats de pluggen in de lege ruimte van Petrischalen die PDA of PDA bevatten, inclusief antischimmelverbindingen (paneel C).
- Incubeer de platen met sporen gedurende 48 uur bij 30 °C, 31 uur voor de platen die vroege hyphae bevatten en 24 uur voor de platen bedekt met mycelium (paneel C).
- Meet de diameter van radiale groei en bereken het percentage schimmelgroeiremming boven controle met behulp van de formule (paneel D)
% schimmelgroeiremming = (C - A/C)* 100
waarbij C de diameter is van radiale groei in PDA-medium en A de diameter van radiale groei in PDA-medium dat de antischimmelverbindingen bevat.
OPMERKING: Om de antischimmelactiviteit gemeten na myceliumplug-transfer en myceliumschijfoverdracht te vergelijken, met behulp van steriel pincet, breng een schijf met een diameter van 5 mm over die eerder op het oppervlak van de schimmelplaten was afgezet (punt 2 noot) in het midden van Petrischalen die PDA of PDA bevatten die antischimmelverbindingen bevatten en ga precies zo te werk als voor agar-plug transfer
5. Dampfase inhibitietest
- Bereiding van agarplaten die knoflookpoeder bevatten
- Ga verder zoals in punt 3.1.
- Bereiding van agarplaat die etherische olie of carbendazim bevat
- Ga verder zoals in punt 3.2 en 3.3.
- Voorbereiding van schimmelplaten
- Ga verder zoals in sectie 2.
- Dampfase antischimmelremmingstest (figuur 1)
- Giet 10 ml PDA-medium in het deksel van de Petrischalen met een diameter van 5 cm die 10 ml PDA-medium of 10 ml PDA-medium met antischimmelverbindingen bevatten in de bodem van de schalen. Wacht tot de agar volledig is gestold bij kamertemperatuur (paneel C).
- Gebruik een centrifugaalbuis van 50 ml als kalibratiegereedschap om een cirkel van PDA in het midden van het deksel te verkrijgen; verwijder de PDA rond de cirkel met een steriele spatel (paneel C).
- Plaats een cirkel in het midden van het PDA-medium dat in het deksel is geplaatst met een steriele roestvrijstalen buis met een diameter van 5 mm. Gooi de agar-cilinder weg met een steriele tandenstoker (paneel C).
- Vorm pluggen met een steriele roestvrijstalen buis met een diameter van 5 mm willekeurig in de schimmelplaten zoals in punt 4.3.2 (paneel B).
- Breng met behulp van een steriele tandenstoker de pluggen bedekt met sporen, vroege hyphae of mycelium van schimmelplaten voorzichtig over in de deksels van testplaten (paneel C).
- Incubeer bij 30 °C zoals in punt 4.3.4 (paneel C).
- Meet de diameter van de radiale groei en bereken het percentage schimmelgroeiremming met behulp van de formule in rubriek 4.3.5 (paneel D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het vermogen van de kwantitatieve methode om de werkingswijze van verschillende soorten antischimmelverbindingen te discrimineren te evalueren, vergeleken we de werkzaamheid van drie bekende antischimmelmiddelen. Carbendazim is een niet-vluchtig synthetisch fungicide dat op grote schaal is gebruikt om een breed scala aan schimmelziekten in planten te bestrijden39,40. Thymus vulgaris etherische olie is grotendeels beschreven voor zijn antibacteriële en schimmelwerende werking en wordt gebruikt als natuurlijk conserveermiddel voor levensmiddelen41. Knoflookpoeder is gekozen als model van een plantaardig bioproduct. Het is traditioneel gebruikt als een natuurlijke remedie met antimicrobiële activiteiten die grotendeels zijn toegeschreven aan de aanwezigheid van vluchtige organosulfurverbindingen, maar ook aan de aanwezigheid van niet-vluchtige saponinen en fenolverbindingen26, waardoor dit model een complexiteit heeft die relevant is in deze studie.
Deze kwantitatieve methode is gebaseerd op de overdracht van agarpluggen die gecontroleerde hoeveelheden schimmel bevatten in verschillende ontwikkelingsstadia van sporen naar mycelium, terwijl in de met voedsel vergiftigde methode 5-daags tot 7-daags mycelium wordt overgedragen van celluloseschijven13. In de test werden sporen, vroege hyphae (17 uur incubatie) en mycelium (24 uur incubatie) gebruikt als beginnend schimmelmateriaal. Het gebruik van schijfoverdracht is mogelijk niet relevant omdat conidia of resterende hyphae na schijfoverdracht ten minste gedeeltelijk op het agarmedium achterblijven, wat vervolgens leidt tot een onnauwkeurige meting van groeiremming zoals geïllustreerd in figuur 2. Verschillende diameters van schimmel-radiale groei zijn waargenomen na overdracht van agargebieden onder celluloseschijven, gevolgd door 24 uur incubatie(figuur 2,panelen A, B en C) die de aanwezigheid van resterende schimmelhyfase op agar na schijfoverdracht benadrukken. De kwantificering van resterende hyphae is bevestigd door de meting van de groei die leidt tot variabiliteit tot 22% diameter(figuur 2, paneel D). Het effect op de groeiremming werd vervolgens geëvalueerd met thymus vulgaris etherische olie als antischimmelverbinding en vergeleken met de remming verkregen na overdracht van agar-plug (figuur 2, paneel E). Groeiremming na schijfoverdracht was hoger dan na agar-plug overdracht voor lage Thymus olieconcentraties, wat leidde tot een overschatting van het remmende effect, wat mogelijk te wijten is aan onvolledige overdracht van schimmelmateriaal en de aanpak ondersteunt op basis van agar-plug transfer.
Trichoderma spp. SBT10-2018-groeiremming veroorzaakt door de drie antischimmelverbindingen werd vervolgens geëvalueerd met behulp van de contact- en dampfaseremmingstesten voor elke schimmelfase (Figuur 3). Sporen werden zorgvuldig verspreid op agarplaten om 4.800 sporen/ cm2te verkrijgen. Ze werden rechtstreeks overgebracht naar agarplaten die antischimmelverbindingen bevatten door middel van agar-plug extractie met behulp van een 5 mm steriele roestvrijstalen buis, waardoor het experiment kon beginnen met de sporen. Voor de twee andere ontwikkelingsstadia werden agarplaten bedekt met sporen eerst gedurende 17 uur of 24 uur bij 30 °C geïncubeerd voordat de agarplug werd overgedragen om ontkieming en vroege ontwikkeling van hyphae (17 uur) en myceliumvorming (24 uur) mogelijk te maken (figuur 3, paneel A). Om de bijdrage van actieve vluchtige moleculen aan de algehele antischimmelactiviteit te kwantificeren, is de contactremmingstest aangepast en werden sporen, vroege hyphae en mycelium op een afstand geplaatst van de antischimmelverbindingen die in PDA-medium werden gegoten, zoals voor de contactremmingstest. Trichoderma-radiale groei werd gemeten over 48 uur en het percentage remming is bepaald door vergelijking met controleomstandigheden. De minimale remmende concentratie (MIC) is gedefinieerd als de laagste concentratie antischimmelverbindingen die zichtbare groei na 48 uur incubatie bij 30°C voorkomt.
Figuur 3(paneel B) toont een hogere sporengevoeligheid voor carbendazim in vergelijking met vroege hyphae- en myceliumnetwerken met respectievelijk 50%, 22% en 30% groeiremming bij 0,25 μg/ml carbendazim wanneer Trichoderma en antischimmelverbindingen met contact waren. Gelijktijdig is een MIC-waarde van 0,5 μg/ml geschat op sporenkieming, terwijl een toename tot 0,75 μg/ml is verkregen bij vroege hyphae-rek en mycelium. Carbendazim daarentegen had geen antischimmeleffect op Trichoderma toen de schimmel op afstand van het fungicide werd geplaatst in overeenstemming met de lage vluchtigheid van deze stof. De resultaten die we hebben verkregen met Thymus vulgaris etherische olie (TEO) als antischimmelverbinding (figuur 3, paneel C) hebben een hogere sporengevoeligheid voor TEO aangetoond in vergelijking met vroege hyphae en mycelium met respectievelijk 65% en ongeveer 50% groeiremming bij 0,01% TEO. De verkregen MIC-waarden waren vergelijkbaar voor sporenkieming en vroege hyphae-rek (0,025% TEO) en hoger voor myceliumgroei (0,05% TEO). Zoals verwacht vertoonde Thymus vulgaris etherische olie identieke antischimmelactiviteit, ongeacht de afstand tussen de schimmel en de olie. Vergelijkbare MIC-waarden (0,025% TEO) werden verkregen bij sporenkieming en vroege hyphae-rek voor contact- en dampfasetesten, hoewel bij het lagere percentage een hogere gevoeligheid is waargenomen wanneer TEO- en Trichoderma-sporen in contact waren (60% groeiremming in contact versus 45% groeiremming op afstand). Verrassend genoeg waren de MIC-waarden op het mycelium verschillend in de contact- en dampfaseremmingstesten (0,05% versus 0,1%) wat suggereert dat een deel van de vluchtige moleculen niet actief is tegen een goed ontwikkeld mycelium. Ten slotte werd bij gebruik van knoflookpoeder als antischimmelverbinding(figuur 3, paneel D) een hogere werkzaamheid waargenomen tegen sporenkieming (50% groeiremming bij 0,25 mg/ml knoflookpoeder en MIC-waarde van 0,5 mg/ml) en vroege hyphae-rek (59% groeiremming bij 0,25 mg/ml en MIC-waarde van 0,5 mg/ml) dan bij myceliumgroei ( Wanneer contact- en dampfasetesten werden vergeleken, hebben de resultaten een significante afname van de antischimmelactiviteit op afstand aangetoond, ongeacht de ontwikkelingsfase van de schimmel. De MIC-waarden gingen van 0,5 mg/ml naar 1 mg/ml voor sporenkieming, van 0,5 mg/ml naar 2 mg/ml voor vroege hyphae-verlenging en van 0,75 mg/ml naar 4 mg/ml voor myceliumgroei(figuur 3,paneel D en figuur 4 voor representatieve foto's). Deze resultaten suggereren dus dat knoflookpoeder een mengsel bevat van zowel vluchtige als niet-vluchtige verbindingen met schimmelwerende eigenschappen.
Al met al tonen deze resultaten aan dat de relatieve bijdrage van vluchtige en niet-vluchtige agentia in plantaardige producten in verschillende schimmelgroeistadia kan worden bepaald, aangezien de experimentele omstandigheden vergelijkbaar zijn. Deze aanpak is dan bijzonder geschikt voor complexe mengsels van antischimmelverbindingen. Thymus vulgaris etherische olie is een mengsel van vluchtige stoffen en vertoont een vergelijkbare activiteit op afstand en in contact voor sporenkieming en vroege hyphae-rek, ondersteunt de vergelijking van deze dampfase en contactremmingstest en benadrukt dat de migratie naar de dampfase niet wordt belemmerd door in het agarmedium te gieten. De resultaten onderstrepen ook dat knoflookpoeder dat als model in deze studie wordt gebruikt , niet-vluchtige actieve bestanddelen bevat die een significante bijdrage leveren aan de algehele antischimmelactiviteit en die zijn verwaarloosd ten gunste van vluchtige thiosulfinaten afgeleid van allium27,28.
Figuur 1: Synoptisch schema van het protocol voor contact- en dampfasetesten Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Onnauwkeurigheid in verband met schimmeloverdracht van celluloseschijf. A. Schema dat de overdracht van de schijf op agarplaten bedekt met sporen en de overdracht van de schijf op het oppervlak vertegenwoordigt op agarplaten die antischimmelverbindingen bevatten B. Schema dat de overdracht van agar van gebieden onder celluloseschijven vertegenwoordigt, gevolgd door incubatie- en restgroeimeting. C. Representatief beeld van radiale groei van restmycelium na overdracht van oppervlakten onder celluloseschijven. D. Radiale groeimeting van restmycelium. E. Effect van Thymus vulgaris etherische olie op de groei van mycelium overgedragen van celluloseschijf of agar-plug (N=2, gemiddelde ± SD) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van antischimmelactiviteiten met behulp van de dampfase en contactremmingstesten op sporen, vroege hyphae en mycelium. A. Representatieve foto's van Trichoderma sporen, vroege hyphae (17 uur groei) en mycelium (24 uur groei). Trichoderma groeiremming door carbendazim (B), Thymus vulgaris etherische olie (C) en knoflookpoeder (D). (N=2, gemiddelde ± SD) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve foto's van knoflook antischimmel activiteit op agar platen in contact- (A) of damp-fase (B) inhibitietestenKlik hier om een grotere versie van deze figuur tebekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde aanpak maakt de evaluatie van antischimmeleigenschappen van minimaal verwerkte plantaardige producten mogelijk. In dit protocol wordt homogene verdeling van sporen op het agaroppervlak bereikt met behulp van 2 mm glazen kralen. Deze stap vereist hanteringsvaardigheden om de kralen goed te verdelen en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, waardoor uiteindelijk de vergelijking van antischimmeleffecten in verschillende stadia van schimmelgroei mogelijk is. We ontdekten dat 5 mm glasparels of overmatige rotatie tijdens het homogeniseren tijdens het verspreiden een variabele groeidiameter kunnen veroorzaken. Daarom raden we aan om de sporeverdeling onder de knie te krijgen voordat u gaat experimenteren. Bovendien moet bij het testen van plantenpoeders aandacht worden besteed aan homogene dispersie van het product in het agarmedium. Om te voorkomen dat het poeder zich op de bodem van de plaat bezinkt, moet het product in een agarmedium worden gemengd wanneer de temperatuur van het gesmolten medium 45 °C bereikt (bij kamertemperatuur van 24 °C). Deze temperatuur moet worden aangepast aan de lokale kamertemperatuur om sedimentatie te voorkomen.
Hoewel de methode die we hier beschrijven waardevolle inzichten kan opleveren, moeten een paar nadelen in overweging worden genomen. Deze methode maakt nauwkeurige en zij-aan-zij vergelijkingen mogelijk in één experimentele opstelling ten koste van een aanzienlijke hoeveelheid bereidingstijd, omdat het aantal te bereiden agarplaten aanzienlijk kan zijn, afhankelijk van de vragen die moeten worden beantwoord. Daarnaast is deze test een middelgrote test ontworpen voor 5 cm Petrischaaltjes. Daarom kan de hoeveelheid werkzame stoffen die nodig is om alle aspecten te testen aanzienlijk zijn. Dat betekent dat zeldzame stoffen mogelijk geen geschikte testkandidaten zijn voor dit protocol. Een verkleining van de test kan worden overwogen om kleinere Petrischalen te gebruiken en de grootte van de stekkers te verminderen. Dit kan worden getest met behulp van het benchmarkingprotocol dat hier wordt beschreven, met speciale aandacht voor de agar-plug-extractie, wat moeilijk kan zijn. De nauwkeurigheid van radiale groeimetingen kan op die kleinere schaal worden verminderd.
De huidige methoden zijn geschikt voor het meten van de antischimmelactiviteit van verbindingen in oplossing en zijn minder van toepassing op het bestuderen van poeders13. De door ons vastgestelde aanpak is goed aangepast voor zowel vloeibare als vaste verbindingen, waardoor de antischimmeleigenschappen van minimaal verwerkte plantaardige producten kunnen worden geëvalueerd. Dit vermindert de tijd die nodig is om extracten te testen en vermindert valkuilen met betrekking tot werkzame stoffen die een slechte oplosbaarheid vertonen. Aangezien sommige plantaardige producten actieve moleculen bevatten die gevoelig zijn voor hoge temperaturen43, biedt dit het voordeel dat het risico op verlies van activiteit van dergelijke verbindingen wordt beperkt. Deze aanpak is aangepast van de agar-diffusiemethode en voedsel vergiftigde methode15,16,17,18,19 om bovendien de directe vergelijking van antischimmelactiviteiten op verschillende schimmelgroeistadia mogelijk te maken met behulp van vergelijkbare experimentele instellingen. Agar-plug overdracht maakt nauwkeurige controle van de hoeveelheden micro-organismen binnen de test mogelijk. Dit is een voordeel ten opzichte van schijfoverdracht, wat leidt tot een overschatting van antischimmeleffecten geassocieerd met onvolledige overdracht van sporen of hyphae. Ten slotte, terwijl dampfasetesten over het algemeen niet worden toegepast op contactremmingstesten27 , 28,29,30,31, richt de methode die we voorstellen zich op de relatieve bijdragen van vluchtige en niet-vluchtige stoffen in complexe mengsels zoals plantenpoeders of extracten en maakt uiteindelijk de evaluatie van antischimmelactiviteiten in verschillende schimmelgroeistadia mogelijk.
De aanpak die we hier beschrijven kan bijzonder relevant zijn om de behoefte aan methoden te ondersteunen die antischimmeleigenschappen in plantaardige producten evalueren voor biocontrole. De kwantitatieve methode die we voorstellen stelt exploitanten in staat om de respectieve bijdragen van vluchtige en niet-vluchtige stoffen aan de antischimmelactiviteit van een complex bioactief mengsel te bepalen. Dit levert waardevolle informatie op die de keuze van de toepassingswijzen voor de behandeling en de relevantie van het uitvoeren van vloeistofextractie kan begeleiden. Toepassingen die kunnen worden overwogen op een afstand van het beoogde fytopathogen (bijvoorbeeld opname van het biocontroleproduct in een verpakking) of die mogelijk direct contact nodig hebben om de werkzaamheid van het biocontroleproduct te optimaliseren (verneveling op planten of het onderdompelen van fruit in een oplossing van biocontroleproduct). Het maakt ook de vergelijking mogelijk van de antischimmelefficiëntie in verschillende schimmelgroeistadia, van sporenkieming tot myceliumgroei in een later stadium, wat leidt tot de vaststelling van aanbevelingen voor het vaststellen van controledrempels die nodig zijn om biocontroleproducten op gewassen toe te passen. Het bepalen van de werkzaamheid van de stoffen in verschillende schimmelstadia kan inderdaad helpen om te categoriseren of stoffen kunnen worden gebruikt als preventieve of curatieve behandelingen en om het schema voor plantbehandelingen met biocontroleproducten te plannen. Dit is essentieel om de werkzaamheid van de producten te benutten wanneer ze in het veld of na de oogst worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
geen
Acknowledgments
We zijn Frank Yates erg dankbaar voor zijn waardevolle advies. Dit werk werd ondersteund door Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
