Article de méthode

Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

DOI :

10.3791/61799

⸱

13 octobre 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole couvre une analyse détaillée de la composition du peptidoglycane à l’aide de la spectrométrie de masse par chromatographie liquide couplée à un logiciel avancé d’extraction de caractéristiques et d’analyse bioinformatique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le peptidoglycane est un composant important des parois cellulaires bactériennes et une cible cellulaire commune pour les antimicrobiens. Bien que certains aspects de la structure du peptidoglycane soient assez conservés dans toutes les bactéries, il existe également des variations considérables entre les Gram positifs/négatifs et entre les espèces. En outre, il existe de nombreuses variations, modifications ou adaptations connues du peptidoglycane qui peuvent se produire au sein d’une espèce bactérienne en réponse à une phase de croissance et / ou à des stimuli environnementaux. Ces variations produisent une structure très dynamique qui est connue pour participer à de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la croissance / division, la résistance aux antibiotiques et l’évitement de la défense de l’hôte. Pour comprendre la variation au sein du peptidoglycane, la structure globale doit être décomposée en ses parties constitutives (appelées muropeptides) et évaluée pour la composition cellulaire globale. La peptidoglycomique utilise la spectrométrie de masse avancée combinée à une analyse de données bioinformatiques de haute puissance pour examiner la composition du peptidoglycane dans les moindres détails. Le protocole suivant décrit la purification du peptidoglycane à partir de cultures bactériennes, l’acquisition de données d’intensité de muropeptides par chromatographe liquide – spectromètre de masse et l’analyse différentielle de la composition du peptidoglycane à l’aide de la bioinformatique.

Introduction

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Le peptidoglycane (PG) est une caractéristique déterminante des bactéries qui sert à maintenir la morphologie cellulaire, tout en fournissant un soutien structurel aux protéines et autres composants cellulaires 1,2. L’épine dorsale du PG est composée d’acide muramique N-acétyl lié au β-1,4-1,4 (MurNAc) et de N-acétyl glucosamine (GlcNAc)1,2. Chaque MurNAc possède un peptide court lié au résidu ᴅ-lactyle qui peut être réticulé avec des peptides adjacents liés au disaccharide (Figure 1A,B). Cette réticulation produit une structure en forme de maille qui englobe toute la cellule et est souvent appelée sacculus (Figure 1C). Au cours de la synthèse du PG, des précurseurs sont générés dans le cytoplasme et transportés à travers la membrane cytoplasmique par des flippases. Les précurseurs sont ensuite incorporés dans le PG mature par les enzymes transglycosylase et transpeptidase, qui produisent respectivementles liaisons glycosidique et peptidique3. Cependant, une fois assemblées, il existe de nombreuses enzymes produites par les bactéries qui modifient et / ou dégradent le PG pour effectuer un certain nombre de processus cellulaires, y compris la croissance et la division. En outre, il a été démontré que diverses modifications du PG confèrent des adaptations spécifiques à la souche, aux conditions de croissance et au stress environnemental, qui ont été impliquées dans la signalisation cellulaire, la résistance aux antimicrobiens et l’évasion immunitaire de l’hôte4. À titre d’exemple, une modification courante est l’ajout d’un groupe acétyle C6 sur le MurNAc qui confère une résistance en limitant l’accès aux liaisons glycane β-1,4 aux enzymes lysozymes produites par l’hôte qui dégradent PG 4,5,6. Chez les entérocoques, la substitution du ᴅ-Ala terminal de la chaîne latérale peptidique par ᴅ-Lac confère une plus grande résistance à l’antimicrobien, la vancomycine 7,8.

La procédure générale d’isolement et de purification des PG est restée relativement inchangée depuis qu’elle a été décrite dans les années 19609. Les membranes bactériennes sont dissoutes par traitement thermique avec SDS, suivi de l’élimination enzymatique des protéines liées, des glycolipides et de l’ADN restant. Le sacculus intact purifié peut ensuite être digéré en composants individuels par hydrolyse de la liaison β-1,4 entre GlcNAc et MurNAc. Cette digestion produit des disaccharides GlcNAc-MurNAc avec toutes les modifications structurelles et / ou réticulations intactes et sont appelés muropeptides (Figure 1B).

L’analyse de la composition du PG a d’abord été réalisée par séparation chromatographique liquide à haute pression (CLHP) pour purifier chaque muropeptide, suivie d’une identification manuelle des muropeptides10,11. Cela a depuis été remplacé par la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS), qui augmente la sensibilité de détection et diminue la charge de travail manuelle de purification de chaque muropeptide individuel. Cependant, la nature longue et complexe de l’identification manuelle des muropeptides est restée un facteur limitant, réduisant le nombre d’études menées. Ces dernières années, avec l’émergence des technologies « omiques », l’extraction automatisée de caractéristiques LC-MS est devenue un outil puissant, permettant la détection et l’identification rapides de composés individuels dans des échantillons complexes à partir de très grands ensembles de données. Une fois les caractéristiques identifiées, le logiciel bioinformatique compare statistiquement la variation entre les échantillons à l’aide d’une analyse différentielle isolant même les différences minimes entre les ensembles de données complexes et les affichant graphiquement à l’utilisateur. L’application de logiciels d’extraction de caractéristiques pour l’analyse de la composition PG vient tout juste de commencer à être explorée 12,13,14 et couplée à l’analyse bioinformatique 12. Contrairement à l’analyse protéomique qui bénéficie des bases de données de protéines facilement disponibles qui prédisent la fragmentation peptidique permettant une identification entièrement automatisée, il n’existe actuellement aucune bibliothèque de fragmentation pour la peptidoglycomie. Cependant, l’extraction de caractéristiques peut être couplée à des bases de données structurelles connues et prévues pour prédire l’identification des muropeptides12. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation de l’extraction de caractéristiques à base de LC-MS combinée à une bibliothèque de muropeptides pour l’identification automatisée et l’analyse différentielle bioinformatique de la composition PG (Figure 2).

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Protocole

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1. Préparation d’échantillons de peptidoglycane

  1. Croissance des cultures bactériennes
    REMARQUE : La croissance des cultures bactériennes varie en fonction de l’espèce bactérienne et des conditions de croissance examinées. Les paramètres expérimentaux à tester définiront les conditions de croissance.
    1. Cultiver des cultures bactériennes dans les conditions de croissance requises pour la souche bactérienne et la conception expérimentale. Cultiver des bactéries sous forme de cultures triples (répliques biologiques), c’est-à-dire trois colonies distinctes par souche ou condition de croissance.
      NOTE: Les conditions de croissance et la phase de croissance sont connues pour avoir des effets significatifs sur la composition du PG 1,2,10. Il faut prendre grand soin de maintenir la cohérence entre les cultures et les répétitions pour s’assurer que les changements de composition sont dus aux paramètres expérimentaux et non à une erreur expérimentale.
    2. Refroidir rapidement la culture à 4 °C, recueillir par centrifugation (11 000 x g, 10 min, 4 °C) et congeler la pastille cellulaire à -20 °C. Laver la pastille de la cellule avec du phosphate de sodium prérefroidi à 4 °C, 20 mM pH 6,5 avant la congélation. La production de la pastille de cellules congelées doit être effectuée aussi rapidement et de manière aussi cohérente que possible entre les échantillons afin de limiter l’activité des enzymes qui pourraient modifier et/ou dégrader le PG pendant le processus de collecte. Les échantillons peuvent être traités directement par le processus d’extraction (section 1.2) sans congélation; Cependant, assurez-vous que tous les échantillons sont traités de la même manière.
      REMARQUE : Pour assurer une quantité suffisante de produit pour les étapes ultérieures, une pastille à cellules humides de taille importante est utilisée. Cela produit une pastille de sacculi suffisamment grande, qui est facilement visualisée et entretenue pendant les étapes de lavage répétitives (sections 1.2.5 et 1.2.14) sans perte significative de produit. Selon la bactérie et les conditions de croissance, ce rendement variera probablement. Pour la bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L d’une culture de 0,5 OD600 ont produit une pastille cellulaire de 3–4 g et étaient suffisantes pour produire ~10 mg de sacculi purifiés (section 1.2.17)12. Il s’agit d’un excès de sacculi important par rapport à ce qui est requis pour la LC-MS (section 2); Cependant, il contribuera à la précision de la mesure (section 1.2.17) et à la normalisation (section 1.3).
  2. Extraction de sacculi peptidoglycanes
    NOTE: Le protocole d’extraction de PG est adapté de la réf.9,11,15. Ce protocole extraira le PG des cellules bactériennes individuelles comme un sacculi entier, exempt d’autres composants cellulaires. Le protocole peut être utilisé avec des bactéries à Gram négatif ou à Gram positif. Cependant, pour les cellules à Gram positif, des ajustements peuvent être nécessaires pour isoler la structure PG plus épaisse et éliminer les polymères associés à la paroi cellulaire; tels que les acides teichoïques.
    1. Resuspendre les pastilles cellulaires congelées à environ 1:10 du volume de culture initial de 20 mM de phosphate de sodium pH 6,5. Effectuer cette étape à 4 °C (peut représenter 1 à 8 mg de poids de pastilles à cellules humides par mL de tampon11,12).
      NOTE: Pour maintenir l’état d’acétylation du PG, un pH de 6,5 ou moins est nécessaire15,16.
    2. Ajouter goutte à goutte la suspension cellulaire au phosphate de sodium de dodécylsulfate (SDS) 20 mM pH 6,5 pour un volume final de 1:1 (c.-à-d. que la concentration finale est de 4 % de SDS), en agitant doucement dans une fiole à fond rond munie d’un condenseur refroidi à l’eau. (Figure 2, étape 2)
    3. Maintenir une ébullition douce pendant 30 min à 3 h sous agitation pour assurer une dissociation complète de la membrane. Assurez-vous que le mélange résultant est complètement clair, sans amas cellulaires ou viscosité restants. Une ébullition plus longue est préférable pour garantir une dissociation complète.
    4. Laissez-le refroidir à température ambiante. L’échantillon peut être laissé à température ambiante pendant la nuit.
      REMARQUE: Lorsque des FDS sont présentes, conserver les échantillons à température ambiante pour conserver les FDS dans la solution.
    5. Recueillir le sacculi sous forme de pastille par ultracentrifugation à 70 000 x g pendant 40 min (ou le temps nécessaire pour sédimenter complètement les sacculi) à 25 °C.
    6. Lavage répétitif des sacculi par ultracentrifugation successive (section 1.2.5) et suspension dans ~50 mL de phosphate de sodium à température ambiante 20 mM pH 6,5 jusqu’à ce que le tampon de lavage ait une concentration SDS ~0,001%. En règle générale, 5 à 7 lavages suffisent.
      REMARQUE: Pour tester la concentration de la FDS restante dans le tampon de lavage, utilisez le colorant colorimétrique, Stains-all17.
    7. Resuspendre les sacculi dans 5–10 mL de phosphate de sodium à température ambiante 20 mM pH 6,5.
    8. Sonifier brièvement l’échantillon (~40 %, 50 W, 20 kHz, 20 s) à température ambiante pour disperser les touffes.
      REMARQUE: Une sonication prolongée provoquera mécaniquement le cisaillement de la structure PG18.
    9. Compléter l’échantillon avec 50 μg/mL d’amylase, de DNase et de RNase, 10 mM de sulfate de magnésium, et digérer à 37 °C pendant 1 h avec agitation ou nutation.
      REMARQUE: La digestion de l’amylase élimine tout glycogène restant piégé dans le sacculi11.
    10. Ajouter 100 μg/mL de pronase et digérer à 37 °C pendant une nuit avec agitation ou nutation et ~0,02 % d’azoture de sodium.
      NOTE: La digestion de la pronase élimine les enzymes ajoutées (de la rubrique 1.2.9) et élimine les lipoprotéines liées de manière covalente au PG.
      ATTENTION : L’azoture de sodium est hautement toxique et nécessite des méthodes d’utilisation et d’élimination appropriées.
    11. Ultracentrifugeuse à 70 000 x g pendant 40 min (ou le temps nécessaire pour sédimenter complètement les sacculi) à 25 °C pour éliminer l’azoture de sodium.
    12. Remettez la pastille en suspension dans 25 mL de 2% SDS 20 mM phosphate de sodium pH 6,5.
    13. Faire bouillir pendant 1 h dans un cuiseur à vapeur ou dans la fiole à fond rond munie d’un réfrigérant refroidi à l’eau (point 1.2.2).
      REMARQUE: La deuxième étape d’ébullition SDS élimine toutes les protéines et contaminants restants du sacculi.
    14. Répéter le lavage des sacculi (section 1.2.6) avec ~50 mL d’eau distillée double à température ambiante (ddH2O) jusqu’à ce que la concentration de FDS soit de ~0,001 %.
    15. Remettez en suspension la pastille dans une quantité suffisante deddH2Opour suspendre les sacculi, lavez le récipient (p. ex. 25 mL) et congelez toute la nuit à -80 °C. Le volume peut varier car l’échantillon sera lyophilisé à l’étape suivante, bien que les petits volumes nécessitent moins de temps pour se lyophiliser.
    16. Le lendemain, lyophilisez la suspension et conservez à température ambiante.
    17. Mesurer la quantité de sacculi lyophilisés obtenue sur une balance analytique.
    18. Diluer les sacculi dans le ddH2O à 10 mg/mL et soniquer brièvement pour briser les amas avant une analyse plus approfondie.
  3. Quantification du peptidoglycane purifié
    1. Quantifier la quantité de sacculi purifiés de la section 1.2.18 pour s’assurer que les données sur les spécifications massiques sont égalisées pendant l’analyse différentielle (section 3.2). Suivez la méthodologie détaillée décrite dans la référence15.
      NOTE: Les sacculi purifiés (section 1.2.18) sont décomposés en composants individuels de sucre et d’acides aminés par hydrolyse acide. Les composants individuels sont séparés et quantifiés par chromatographie par échange d’anions à l’aide de la détection ampérométrique pulsée. Compte tenu de la structure de PG (Figure 1), les muropeptides individuels sont composés d’un seul résidu MurNAc et d’un seul résidu GlcNAc. Par conséquent, la quantification de la concentration de l’un ou l’autre résidu représente la quantité de muropeptides 1:1 dans l’échantillon. MurNAc est préféré en raison de la séparation nette des pics des autres composants PG pendant la chromatographie16.

2. Acquisition de données de spectrométrie de masse

  1. Préparation de muropeptides pour la spectrométrie de masse
    1. Compléter 800 μg de sacculi purifiés avec 100 μg/mL de mutanolysine, 100 mM d’acétate d’ammonium pH 5,5 et 50 mM de chlorure de magnésium dans une réaction de 100 μL.
    2. Digestion à 37 °C pendant la nuit.
    3. Ajouter 1:1 volume 0,5 M tampon de borate pH 9,0 et compléter avec ~10 mg/mL de borohydrure de sodium (NaBH4).
      NOTE: La mutarotation des sucres cycliques entre les formes α et β anomères provoquera de multiples formations de pics lors de la séparation par chromatographie liquide des muropeptides. Le traitement avec NaBH4 élimine l’interconversion entre les deux formes en réduisant MurNAc en muramitol11. Le traitement ne réduit pas les résidus de sucre 1,6-anhydro MurNAc ou 1,4-liés.
      ATTENTION : La réaction duNaBH4 produit de petites quantités d’hydrogène gazeux. La réaction NaBH4 créera des bulles et les tubes de microfuge doivent être maintenus ouverts pour permettre au gaz de s’échapper.
    4. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant ~20–30 min.
    5. Centrifuger brièvement pour déposer l’échantillon dans le tube de microfuge et éliminer les bulles.
    6. Ajuster le pH à <4,0 en utilisant de l’acide phosphorique 1:5, ajouté par incréments de 5 μL. Testez le pH à l’aide de bandelettes de test de pH décisif.
    7. Centrifuger à ~17 000 x g pendant 1 min pour sédimenter toute matière insoluble restante.
    8. Filtre à l’aide de filtres microcentrifuges de 0,2 μm.
    9. Les échantillons sont centrifugés pendant 10 minutes à 30 000 x g avant l’injection dans la LC-MS pour s’assurer que les particules ne sont pas injectées dans la SEP.
  2. Configuration de LC-MS
    1. Fixer une colonne de particules superficiellement poreuses C18 (100 mm x 2,1 mm, taille des pores <3 μm) à un spectromètre de masse QTF, quadripôle, avec une précision de détection m/z minimale à quatre décimales.
    2. Effectuer la séparation par chromatographie liquide des muropeptides
      NOTA: Chaque triple biologique (section 1.1.1) doit être passé trois fois par la LC-MS (sections 2.2.2 à 2.2.3) (triplat technique). Par conséquent, chaque condition testée aura un total de neuf fichiers de données LC-MS. L’acquisition des données a été effectuée à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce (voir le tableau des matières). Cependant, le logiciel d’acquisition doit être choisi en fonction des machines EM. Ce qui suit représente un guide pour la configuration du MS avec des paramètres spécifiques pour l’exécution de ce protocole. Pour une description détaillée, veuillez vous référer au manuel du fabricant.
      1. Pour la séparation chromatographique, préparer les solvants suivants à 0,1 % d’acide formique (A) et d’acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique (B).
      2. Mettre en place une méthode de séparation chromatographique en utilisant les paramètres suivants.
      3. Réglez le débit sur 0,4 mL/min.
      4. Conditionnez la colonne pendant 10 min à 2 % B (~24 volumes de colonne).
      5. À l’aide d’un échantillonneur automatique, injecter 10 μL d’échantillon de la section 2.1.9.
        REMARQUE : Exécutez un échantillon initial via le protocole LC-MS avant de commencer la collecte de données. Cette exécution n’est pas utilisée pour les données, mais pour augmenter la reproductibilité du temps de rétention pour toutes les exécutions suivantes. La reproductibilité du temps de rétention est requise pendant le traitement spectral (section 3.1) pour l’identification et le regroupement précis des pics du rapport masse/charge (m/z).
      6. Séparer les muropeptides en utilisant 2% B pendant 5 min (~12 volumes de colonne), puis l’augmenter à 15% B sur 13 min (~30 volumes de colonne), l’augmenter à 50% B sur 10 min (~24 volumes de colonne), et enfin l’augmenter à 98% B sur 2 min (~5 volumes de colonne).
        REMARQUE: Jeter (envoyer aux déchets) les 2 premières minutes et les 5 dernières minutes de la pente.
      7. Terminez par un lavage de colonne à 98 % B pendant un rééquilibrage de 6 min (~14 volumes de colonne) et de 20 min (~47 volumes de colonne).
    3. Effectuer la détection par spectrométrie de masse des muropeptides
      1. Étalonner l’axe de masse en mode positif à l’aide d’un mélange de réglage dans de l’acétonitrile contenant des étalons de masse de référence LC-MS en suivant les instructions du fabricant MS.
        NOTE: Le MS est réglé avant le début des cycles chromatographiques (section 2.2.2.1).
      2. Configurez une méthode d’acquisition de données MS à l’aide des paramètres suivants.
        NOTE: Les données MS et MS/MS sont collectées (sections 2.2.3.2 à 2.2.3.6) simultanément à la séparation chromatographique des muropeptides (sections 2.2.2.4 et 2.2.2.5). Les paramètres chromatographiques et MS (sections 2.2.2.2 et 2.2.3.2) sont une méthode unique qui est ajoutée lors de la configuration d’une liste de travail pour exécuter plusieurs échantillons en séquence.
      3. Réglez la tension capillaire de l’électropulvérisation à 4,0 kV et la température du gaz de séchage à 350 ° C avec un débit de 13 L / min.
        NOTA : L’azote (pureté >99 %) doit être utilisé comme gaz de nébulisation, de séchage et de collision pendant toute collecte de données par spectrométrie de masse.
      4. Réglez la pression du nébuliseur à 40 psi et réglez le fragmenteur sur 150 V.
      5. Réglez les tensions RF de la buse, de l’écumeur et de l’octapôle sur 1000 V, 65 V et 750 V, respectivement.
      6. Réglez la plage de balayage sur 300–2 000 m/z en mode ion positif 4 GHz (plage dynamique étendue).
      7. Définissez la collecte de données en utilisant l’acquisition MS/MS dépendante des données avec une fréquence de balayage MS et MS/MS de 1 spectre/seconde. Sélectionnez cinq masses de précurseurs par cycle, dans l’ordre de charge simple, double et triple.
      8. Réglez les énergies de collision de fragmentation MS/MS à 15, 20 et 30 eV.

3. Analyse différentielle de l’abondance des muropeptides

  1. Traitement spectral du chromatogramme LC-MS
    REMARQUE : L’extraction récursive des caractéristiques a été effectuée à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce (voir le tableau des matières). D’autres logiciels d’extraction de fonctionnalités peuvent être utilisés. Cependant, d’autres logiciels peuvent nécessiter un traitement manuel supplémentaire des données pour effectuer l’extraction récursive très robuste. Divers logiciels utilisent la fonction terminologique, l’entité et le composé de manière presque interchangeable. Pour l’analyse PG, tous se réfèrent à l’identification du chromatogramme ionique LC-MS représentatif d’un muropeptide individuel (p. ex., figure 3). Au cours du traitement spectral (section 3.1), une caractéristique représente les multiples pics m/z qui englobent les multiples espèces ioniques possibles d’un seul muropeptide qui sont regroupées sous un seul marqueur composé.
    1. Sous Fichier, démarrez un nouveau projet.
    2. Ajoutez les fichiers de données LC-MS QTOF et attribuez des fichiers de données individuels à une condition / groupe expérimental, par exemple, deux conditions de croissance différentes.
    3. Exécutez l’assistant de traitement des données Extraction de caractéristiques récursives par lots (petites molécules/peptides) et définissez les filtres de traitement des données pour qu’ils correspondent aux paramètres des conditions LC-MS et à l’instrumentation pour identifier, regrouper et vérifier avec précision les pics m/z représentant des muropeptides individuels. À partir du chromatogramme, examiner la dérive du temps de rétention et la variation de m/z de pics similaires connus pour définir les paramètres de filtre initiaux.
      REMARQUE : L’extraction de caractéristiques récursives utilise un algorithme initial d’extraction de caractéristiques moléculaires non ciblées pour identifier et aligner les caractéristiques du chromatogramme (pics m/z ) dans tous les fichiers de données. Une fois créées, ces entités sont utilisées pour réévaluer les fichiers de données originaux (récursifs) avec un algorithme d’extraction de caractéristiques moléculaires ciblées afin d’améliorer la fiabilité et la précision des caractéristiques identifiées. Il est préférable de définir l’extraction initiale non ciblée avec une fenêtre de détection étroite et d’utiliser des paramètres de détection plus larges pour l’extraction récursive afin d’identifier les pics dans tous les fichiers de données qui peuvent manquer lors de l’extraction initiale. L’exécution de l’extraction récursive des fonctionnalités peut prendre des heures en fonction du nombre d’échantillons, de la complexité des données et du matériel informatique présent
    4. Passez en revue les résultats de l’extraction des fonctionnalités. Si un nombre important d’entités n’ont pas réussi à s’aligner dans un groupe, ajustez les paramètres de filtrage récursifs pour élargir/restreindre la fenêtre de détection selon vos besoins. Pour ce faire, inspectez le chromatogramme et le profil isotopique de chaque caractéristique extraite pour vous assurer que la détection des caractéristiques a été effectuée de la même manière dans tous les fichiers de données. En outre, pour chaque entité identifiée dans un fichier de données, examinez le score, les avertissements éventuels et si la fonctionnalité a réussi les paramètres de filtre choisis.
      Remarque : Il faut veiller à garder les fenêtres de détection suffisamment étroites pour que les fonctionnalités distinctes ne soient pas regroupées par erreur. Ceci est souvent noté par des profils isotopiques disparates entre les fichiers de données, ou des variations significatives m/z / temps de rétention. Inversement, s’il existe plusieurs caractéristiques avec des temps de rétention m/z et similaires, il est possible que les paramètres de filtre aient été trop stricts, ce qui a entraîné la division d’un pic MS en deux caractéristiques. Par conséquent, exécutez à nouveau l’extraction des entités (section 3.1.3) avec des paramètres de filtre de temps de rétention ajustés pour permettre un meilleur regroupement de ces entités. La visualisation des pics d’abondance les plus faibles indiquera si les filtres utilisés (section 3.1.3) ont identifié avec précision les pics au-dessus du bruit de fond. Si les pics d’abondance les plus faibles semblent similaires à l’arrière-plan, réexécutez l’extraction d’entités avec de nouveaux paramètres de filtre d’arrière-plan.
    5. Exportez les données sous la forme d’un fichier d’échange composé (.cef) (un format compatible avec le logiciel statistique) ou d’un fichier séparé par colonne (.csv) contenant la masse, le temps de rétention et l’abondance de chaque caractéristique pour chaque échantillon.
  2. Analyse différentielle des caractéristiques spectrales
    REMARQUE : L’analyse différentielle a été effectuée à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce (voir le tableau des matières). D’autres logiciels bioinformatiques peuvent être utilisés.
    1. Ouvrez le programme et, lorsque vous y êtes invité, démarrez un nouveau projet.
    2. Suivez les instructions pour l’importation et l’analyse des données. Lors de l’importation des données, téléchargez les fichiers extraits de la fonctionnalité (section 3.1). Au cours de l’analyse des données, choisissez la signification et le changement de pli pour l’analyse différentielle et sélectionnez les données de référence à l’intensité médiane dans tous les fichiers de données. Ne définissez pas de filtres de données (si cela a été fait lors de l’étape précédente de traitement des spectres (section 3.1)) car l’application de filtres annulerait l’extraction robuste des caractéristiques récursives. Cependant, comme pour l’extraction de caractéristiques, l’analyse différentielle doit être alignée en fonction de la masse (m/z) et du temps de rétention en raison de la dérive dans la collecte de données LC-MS. Utilisez les paramètres déterminés dans l’extraction de caractéristiques (section 3.1).
      REMARQUE : Normaliser entre les fichiers de données à l’aide de la quantification des muropeptides (section 1.3) pour s’assurer que les variations sont dues à des paramètres expérimentaux et non à des variations dans la purification des sacculi (section 1.2). Utilisez l’option de mesureur externe pour ajuster chaque fichier de données en fonction des différences de concentration de MurNAc dans l’échantillon.
    3. Une fois l’analyse terminée, examiner les analyses graphiques et statistiques résultantes pour identifier les muropeptides qui démontrent un changement d’abondance significatif entre les conditions expérimentales testées.
    4. Sous le navigateur de projet, cliquez avec le bouton droit sur les différentes analyses et choisissez une option d’exportation pour enregistrer les détails de l’entité sous la forme d’un fichier de données séparé par colonne (.csv) qui contient le m/z, le temps de rétention, les valeurs d’intensité brutes et normalisées, la valeur p, le FDR et les changements de pli pour chaque entité. Plusieurs analyses doivent être sauvegardées pour obtenir toutes les données pertinentes.
    5. Exportez un deuxième fichier .csv contenant uniquement les muropeptides qui ont dépassé les analyses statistiques, y compris la valeur p <0,05 et le changement de pli >2.
  3. Annoter l’identité du muropeptide aux caractéristiques spectrales
    NOTE: Chaque caractéristique identifiée doit se voir attribuer une structure muropeptidique prédite basée sur le m / z et cette annotation confirmée par l’examen de la fragmentation MS / MS. Après confirmation des annotations, il peut être nécessaire d’effectuer et d’affiner l’analyse différentielle (section 3.2).
    1. Dans le logiciel d’analyse différentielle, sous Interprétation des résultats, sélectionnez ID browser. Ajouter une bibliothèque de structures muropeptidiques attendues et sélectionner des paramètres similaires à ceux utilisés précédemment (section 3.1.3). Cela produira une annotation muropeptide prédite pour chaque caractéristique identifiée. Une bibliothèque de structures muropeptidiques peut être produite à l’aide du m/z pour les structures muropeptidiques prévues et du logiciel de base de données MS (voir le tableau des matériaux). Cependant, une bibliothèque des m /z de >6 000 muropeptides possibles peut être trouvée dans la référence12.
    2. Sélectionnez l’annotation du muropeptide prédit en fonction du score correspondant et de la pertinence biologique du muropeptide prédit, c’est-à-dire choisissez le muropeptide le plus susceptible d’être présent dans l’échantillon biologique.
    3. Confirmer manuellement l’annotation prédite du muropeptide en comparant les pics m /z du chromatogramme MS/MS au m/z prédit de toutes les fragmentations possibles d’une structure muropeptidique connue (p. ex., figure 4).
      1. Visualisez les données MS et MS/MS à l’aide d’un programme de visualisation par chromatogramme (voir le tableau des matériaux, figure 4).
      2. Dessinez la structure prédite du muropeptide à l’aide d’un éditeur moléculaire (programme de dessin de structure chimique) (voir le tableau des matériaux, figure 4, encart gris). Utilisez l’outil de fragmentation de masse pour afficher le m/z des fragments MS lorsque chaque liaison est rompue individuellement ou en combinaison.
        REMARQUE: Selon l’énergie de fragmentation utilisée pour la SEP / SEP, la fragmentation peut se produire à n’importe quelle liaison dans la structure du muropeptide. Cependant, certaines liaisons sont plus facilement / fréquemment fragmentées à des niveaux d’énergie plus faibles. Par exemple, la fragmentation dans la chaîne latérale peptidique se produit le plus souvent au niveau de la liaison amide entre les acides aminés. Lors de l’évaluation de la fragmentation, il est important de noter que les résidus de GlcNAc sont très facilement fragmentés à partir du muropeptide. Par conséquent, la fragmentation de la structure muropeptidique connue doit être évaluée avec et sans GlcNAc. En raison de la fragmentation du GlcNAc à la source, plusieurs caractéristiques extraites dans le traitement spectral (section 3.1) peuvent représenter une structure muropeptidique unique. Si elles sont trouvées, ces caractéristiques doivent être fusionnées et l’analyse différentielle réévaluée.
      3. Comparer toutes les fragmentations possibles de la structure du muropeptide qui a été déterminée (section 3.3.3.2) au chromatogramme MS/MS (section 3.3.3.1). Pour confirmer l’annotation du muropeptide, les pics m /z de fragments multiples doivent être trouvés dans le chromatogramme MS/MS avec une fenêtre d’alignement m/z très minimale (Figure 4).
      4. Afin d’élucider l’identité des muropeptides en cas de fragmentation ambiguë de la SM/SM, répéter les sections 2.2.2 à 2.2.3 avec des échantillons (section 2.1.9) pour l’acquisition de données MS/MS supplémentaires incorporant une liste précurseur préférée de m/z et un temps de rétention avec des énergies de collision de fragmentation MS/MS supplémentaires.
    4. Pour les entités co-éluantes qui ont été annotées comme le même muropeptide, exécutez à nouveau l’analyse différentielle (section 3.2.2) et fusionnez les caractéristiques extraites.
  4. Évaluation des changements globaux dans les modifications des muropeptides
    1. Modifier le fichier .csv (section 3.2.4) des muropeptides à variation de pli élevé statistiquement significatif afin d’inclure une seule colonne pour chaque modification de muropeptide. Remplissez cette colonne avec une désignation pour chaque muropeptide annoté (section 3.3) (p. ex., GlcNAc ou MurNAc acétylé versus dé-N-acétylé).
    2. Téléchargez le fichier .csv modifié dans Perseus22,23. Importez les valeurs d’intensité normalisées dans la zone Importation principale et importez la désignation de modification dans la zone Importation catégorielle.
    3. Sous Annoter les lignes, cliquez sur Annoter catégoriquement les lignes et ajoutez des fichiers de données à chaque paramètre expérimental.
    4. Sous test, cliquez sur deux exemples de tests pour effectuer le test t d’un élève (valeur p < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Cliquez sur 1D pour effectuer l’annotation 1D22,23. Une annotation FDR 1D < 0,05 indique un changement d’abondance significatif pour la modification du muropeptide entre les paramètres expérimentaux testés. La définition de la valeur de seuil (s0) = 1 affichera les scores FDR d’annotation 1D pour tous les muropeptides.
    6. Dans un logiciel graphique (voir le tableau des matériaux), produire une carte thermique du changement de pli d’abondance pour chaque modification du muropeptide et montrer le score d’annotation 1D pour démontrer la signification (Figure 5B). Le changement de pli de chaque modification de muropeptide peut être produit dans Microsoft Excel en utilisant les intensités brutes de tous les muropeptides individuels qui contiennent la modification.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sensibilité accrue de détection des machines MS associée à un logiciel de reconnaissance de pics très puissant a amélioré la capacité d’isoler, de surveiller et d’analyser les compositions de substances d’échantillons complexes dans les moindres détails. Grâce à ces avancées technologiques, des études récentes sur la composition du peptidoglycane ont commencé à utiliser des techniques automatisées d’extraction de caractéristiques LC-MS 12,13,14,24 par rapport à l’ancienne méthodologie basée sur HPLC<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode pour purifier le peptidoglycane à partir de cultures bactériennes, un procédé de détection LC-MS et une analyse de composition à l’aide de techniques bioinformatiques. Ici, nous nous concentrons sur les bactéries à Gram négatif et quelques légères modifications seront nécessaires pour permettre l’analyse des bactéries à Gram positif.

La préparation des muropeptides est restée pratiquement la même depuis sa première production dans les années 1960 9,11,15.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs aimeraient remercier la Dre Jennifer Geddes-McAlister et le Dr Anthony Clarke pour leur contribution au perfectionnement de ce protocole. Ces travaux ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des IRSC accordées au C.M.K (PJT 156111) et une BESC Alexander Graham Bell du CRSNG décernée à l’EMA. Des figures ont été créées le BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Colonne de phase inverse Equipment
C18 - AdvanceBio Colonne peptidique (100 mm x 2,1 mm, 2,7 µ ; m)Acquisition de données LC-MSAgilent
Contrôleur de ballon chauffant, OptichemFisher50-401-788pour 4 % SDS
ébullition Manteau chauffant, 1000mL HémisphériqueFisherCG1000008pour 4 % SDS
ébullition Incubateur, 37° ; Cpour la purification des sacculi et la préparation des échantillons MS
Condenseur Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805pour 4 % SDS
ébullition LyophiliseurLabconcopour la lyophilisation des sacculi
Agitateur magnétiqueFisher90-691-18pour 4 % SDS ébullition
spectromètre de masse Q-Tof modèle UHD 6530AglientAcquisition de données LC-MS
filtres de microcentrifugation, Nanosep MF 0.2 µ ; mFisher50-197-9573nettoyage de l’échantillon avant injection MS Support d’autoclave
Fisher12-000-102pour 4 % SDS ébullition
Pince autoclaveFisherS02629pour 4 % SDS ébullition
ballon à fond rond - 1 litre pyrexFisher07-250-084pour 4 % SDS
ébullition Sonicateur modèle 120FisherFB120pour la purification des sacculi
Sonicateur - micro pointeFisherFB4422pour la purification des sacculi
UltracentrifugeBeckmande lavage des sacculi
Bouteilles d’ultracentrifugeuse, Ti45FisherNC9691797étapes de lavage des sacculi
Citypour condenseur
Software
ChemdrawCambridgesoftéditeur moléculaire pour la prédiction de la fragmentation des muropeptides
Excel Microsoftaffichage de listes de muropeptides annotés, d’abondance, de motifs isotopiques, etc.
MassHunter AcquisitionAglientexécutant l’instrument QTOF
MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientAnalyse différentielle bio-informatique
MassHunter Base de données et bibliothèque de composés personnels AglientMuropeptide m/z Base de données MS
MassHunter ProfinderAglientExtraction
de caractéristiques récursivesMassHunter Analyse qualitativeVisualisation AglientMS et chromatogrammes MS/MS
PrismGraphpadLogiciel de représentation graphique
PerseusMax Plank Institut de biochimieAnnotation
Material
AcetonitrileFisherA998-4
Acétate d’ammoniumFisherA637
AmylaseSigma-AldrichA6380
Acide boriqueFisherBP168-1
DNaseFisherEN0521
Acide formiqueSigma-Aldrich27001-500ML-R
Mixage de réglage LC-MS - HP0321AgilentG1969-85000
Chlorurede magnésium Sigma-AldrichM8266
Sulfate de magnésiumSigma-AldrichM7506
Mutanolysine de Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Azote gazeux (pureté de >99 %)PraxairNI 5.0UH-T
Acide phosphoriqueFisherA242
Pronase E à partir de Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNaseFisherEN0531
Azoture de sodiumFisherS0489
Borohydrure de sodiumSigma-Aldrich452890
Dodécylsulfate de sodium (SDS)FisherBP166
Hydroxyde de sodiumFisherS318
Sodium Phosphate (dibasique)FisherS373
Phosphate de sodium (monobasique)FisherS369
Colorants-toutSigma-AldrichE9379
étapes Fisher refroidi à l’eau 1D

Références

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Mots-clés

Analyse du peptidoglycaneAnalyse bioinformatique des donn esComposition des muropeptidesPurification du peptidoglycaneExtraction des sacculiUltracentrifugationDigestion enzymatiqueExtraction de caract ristiquesAnalyse diff rentielle

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