Summary
癌細胞と線維芽細胞を同時注入し、腫瘍の成長を経時的に監視するためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、腫瘍増殖の調節因子としての線維芽細胞の役割の分子基盤を理解するために使用できます。
Abstract
がん関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍を促進する微小環境を作り出すことにより、腫瘍の成長に重要な役割を果たすことができます。腫瘍微小環境におけるCAFの役割を研究するためのモデルは、線維芽細胞、さまざまな組織からの線維芽細胞、および線維芽細胞の特定の遺伝的要因の機能的重要性を理解するのに役立ちます。マウスモデルは、in vivoの状況における腫瘍の成長と進行の寄与を理解するために不可欠です。ここでは、がん細胞を線維芽細胞と混合し、マウスに導入して腫瘍を発生させるプロトコールを提供する。経時的な腫瘍サイズと最終的な腫瘍重量が決定され、グループ間で比較されます。記載されたプロトコルは、腫瘍の成長および進行におけるCAFの機能的役割についてより多くの洞察を提供することができる。
Introduction
腫瘍微小環境の中で、最も顕著な細胞型の1つは、がん関連線維芽細胞(CAF)1です。これらの癌腫関連線維芽細胞は、腫瘍抑制の役割を果たすことができる2,3。例えば、S100A発現線維芽細胞は、発がん物質をカプセル化し、癌腫形成から保護することができるコラーゲンを分泌する4。さらに、膵臓がんにおけるα平滑筋アクチン(SMA)陽性筋線維芽細胞の枯渇は免疫抑制を引き起こし、膵臓がんの進行を加速させます2。CAFはまた、癌細胞と共進化し、腫瘍の進行を促進することができます5、6、7、8。線維芽細胞は、腫瘍促進環境を作り出す細胞外マトリックスタンパク質を合成して分泌することができる8。これらの細胞外マトリックスタンパク質は、組織の機械的硬化を引き起こす可能性があり、これは腫瘍の進行に関連する9,10。沈着した細胞外マトリックスは、免疫浸潤11を阻害する物理的障壁として作用することができる。CAFsによるマトリックス沈着は、CAFsによって生成されるフィブロネクチンが腫瘍浸潤を促進することが示されているため、腫瘍浸潤とも関連している12。CAFは、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-6(IL-6)、およびCXC-ケモカインリガンド12(CXCL12)を分泌することにより、血管新生を促進し、免疫抑制細胞を腫瘍微小環境に動員します13,14,15。腫瘍増殖の促進における中心的な役割のために、癌関連線維芽細胞は抗癌療法の新たな標的である6,16,17,18。
以下のプロトコルは、十分に確立され広く使用されている腫瘍増殖のマウスモデルにおいて、線維芽細胞が腫瘍の成長にどのように影響するかをテストするための方法について説明しています。腫瘍微小環境における線維芽細胞の重要性を理解するために、マウスに癌細胞を導入してその成長を監視するための標準プロトコルは、癌細胞導入を伴う線維芽細胞を含むように変更されました。癌細胞は、皮下または皮内に導入することができる。皮内導入は、皮膚自体から発生する腫瘍をもたらすであろう。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射する異種移植片は、癌増殖を促進する能力における線維芽細胞、線維芽細胞の亜集団、およびタンパク質因子の役割を分析するための重要な方法論的ツールを表しています19,20,21。癌細胞と線維芽細胞をマウスに同時注射するための詳細なプロトコルが提供されています。この方法は、線維芽細胞の存在または非存在を比較するために、異なる供給源からの線維芽細胞を比較するために20、または特定のタンパク質の発現の有無にかかわらず線維芽細胞を比較するために使用することができる19。癌細胞および線維芽細胞が導入された後、腫瘍の大きさを経時的にモニターすることができる。実験の終わりに、腫瘍を解剖して計量することができます。腫瘍の成長を経時的に監視することにより、さまざまな要因の重要性を分析できます。
腫瘍増殖における線維芽細胞の役割を研究するための可能な代替アプローチがあります。一例として、線維芽細胞で優先的に発現されるドライバーを有する遺伝子の組織特異的ノックアウトを提供するCre-loxedベースのモデルがある。このようなアプローチは、腫瘍の進行に対する線維芽細胞における特定の遺伝子および経路の役割を調査する機会も提供する。Cre-loxベースのアプローチと比較して、提供されたプロトコルは、腫瘍の成長がわずか数週間で監視されるため、線維芽細胞の役割を監視するためのはるかに迅速なアプローチを表します。提供されたアプローチはまた、遺伝子操作されたマウスのコロニーを生成および収容する必要がないため、大幅に安価である。提供されたプロトコルは、マウスコロニーを開発する必要なしに、shRNAを使用して異なる遺伝子のノックダウンの効果を迅速にテストするために使用できます。提供されたアプローチは、異なる数の線維芽細胞の比較、異なる癌細胞と線維芽細胞の比率、異なる遺伝子のノックダウン、さらには異なる組織部位または種からの線維芽細胞の比較を可能にするため、より柔軟である。Cre-loxアプローチは、線維芽細胞がより生理学的な状況でマウス内に存在するという利点を有するであろう。
ここで報告されたプロトコルは、腫瘍の成長に対する線維芽細胞の影響を迅速かつ費用効果の高い方法で監視しようとする科学者にとって価値があります。このプロトコルは、腫瘍増殖に対する腫瘍増殖に関する線維芽細胞または異なるソースからの線維芽細胞の異なるサブセットを調査する科学者にとって特に価値があります。腫瘍の開始が生理学的な状況で起こることが重要であるならば、遺伝子操作されたマウスモデルが考慮されるべきです。
これらの実験を実行するには、いくつかの可能なアプローチがあります。免疫コンピテントマウスを宿主として使用することができ、線維芽細胞と免疫細胞の相互作用の調査が可能になります。免疫コンピテントマウスモデルの場合、マウスがん細胞とマウス胚性線維芽細胞(MEF)を注射する必要があります。MEFを使用することで、研究者は広範囲のノックアウトマウス系統を利用して、目的の遺伝子の有無を試験することもできます。あるいは、免疫不全マウスを使用して、ヒト癌細胞に由来するマウスにおける腫瘍の増殖の促進におけるヒト線維芽細胞の役割を試験することができる。癌細胞の導入は、皮下または同所的に行うことができる。黒色腫の場合、後述するように、腫瘍-線維芽細胞混合物を皮内注射して、黒色腫が発症する皮膚内の位置をより厳密にシミュレートする同所性注射を行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物管理委員会によって承認されました。
注:マウス系統の宿主マウスに一致する癌細胞と線維芽細胞を選択します。宿主マウスの性別に一致する癌細胞と線維芽細胞を選択します。繁殖コロニーからマウスを入手するか、評判の良いベンダーから購入します。8~10週齢のマウスに腫瘍を導入する。毛皮を持つマウスは、毛包周期の休止期または休止期になります。癌細胞に対する線維芽細胞の比率を0.5対3で計画します。
1.実験に使用するマウスの適切な数を決定します
- 研究を実行する前に、検出力分析を実行して、研究に使用するマウスの適切な数を決定します。次の式を使用して、指定した検出力を持つ実験のサンプルサイズを決定します。
n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
αが選択された有意水準(通常は0.05)である場合、1-α/2 = 0.975およびZ = 1.960です。
βは電力であり、80%の電力が必要な場合は、Z = 0.84です。
ES、効果サイズ = \μ1-μ 0\/σ
ここで、μ0は仮説H0の平均、μ 1は仮説H1の平均、σは関心のある結果の標準偏差です22。
注:サンプルサイズの計算の詳細については、22を参照してください。
2.注射用の癌細胞を生成する
- 次の式で関連する成長率を決定します。
Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
注:24時間で2倍になるセルの例が示されています
倍加時間 = ln(2)/成長率
24 時間 = LN(2)/成長率
24*成長率 = .693
成長率 = .693/24= .028875 - プレート化するがん細胞の数と、注射前に細胞を増殖させる必要がある時間を決定します。
注:形成された腫瘍ごとに0.25〜100万個の癌細胞が注入されます。 - 式に従って十分な数のセルを生成するのに必要な日数を計算します
N(t)=N(0)egr*t
ここで、N(t)は時刻tの細胞数、N(0)は時刻0の細胞数、grは成長率、tは時間です。
注:500,000個の細胞を増殖させて、12個の腫瘍のそれぞれに10個の6 個の細胞を生成するためのこれらの計算の例。これらの計算に基づいて、必要な数の細胞を成長させるには5日で十分です。
N(t)=N(0)egr*t
12 x 106 = 500,000e(gr*t)
12 x 106=500,000e(.028875*t)
24=e(.028875*x)
ln(24)=0.028875x
3.178=0.028875x
X = 110時間= 4.59日
細胞がプレートに付着し、収集中に失われた細胞のために余分な時間を確保してください。 - プレート癌細胞。
注:培養細胞を扱うときは、手袋と白衣を着用してください。
注:層流フードで細胞操作を実行して、空気からサンプルへの微生物の導入を最小限に抑えます。使用前に組織培養フードを紫外線で処理してください。滅菌技術を使用し、滅菌細胞培養プラスチック製品と、組織培養処理プレート、ピペット、コニカルチューブなどの消耗品のみを使用してください。- バイアル内の細胞数と播種後の所望の細胞濃度に基づいて、組織培養プレートの正しい数とサイズを計算します。
- 組織培養プレートにラベルを付けます。
- 37°Cの水で水浴を準備します。
- 培地を円錐形のチューブに分注し、37°Cの水浴に入れます。 多くの癌細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させることができます。
- 必要な数の凍結細胞のバイアルを液体窒素冷凍庫から取り出します。
注意: 液体窒素冷凍庫で細胞を取り扱うときは、冷凍庫の手袋を使用してください。 - 穏やかに振とうしながら、水浴中で細胞バイアルを素早く解凍する。
注意: 無菌性を維持するために、バイアルを取り扱うときに手袋にエタノールを追加します。 - 組織培養フード内で滅菌技術を使用して、10 mLのDMEM + 10%FBSを含む15 mLのコニカルチューブに細胞をピペットで入れます。
- 細胞混合物を180 x g で5分間遠心分離します。
- 滅菌吸引または滅菌10 mLピペットで上清を静かに取り除きます。
- ペレット内の細胞を1 mLのDMEM + 10%FBSに静かに再懸濁します。
- 再懸濁した細胞を滅菌p1000で標識した組織培養プレート上にピペットします。
- 滅菌済みの10 mLピペットを使用して、血清を含むピペット培地を組織培養プレートに入れます。
- 組織培養プレートを5%CO2を含む37°Cの組織培養インキュベーター内でインキュベートする。
- がん細胞を拡張して、注射に十分ながん細胞を生成します。
注:コンフルエント性について光学顕微鏡で細胞を監視します。2〜3日ごと、または必要に応じてトリプシン処理して、細胞が100%コンフルエントに達するのを防ぎます。多数の細胞が必要な場合は、ハイパーフラスコ(材料表)を使用して、スペース効率および中効率の高い方法で多数の細胞を増殖させます。細胞を継代する必要があるたびに、次の手順に従います。- 滅菌吸引または滅菌10 mLピペットでプレートから培地を取り除きます。
- 温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でピペッティングしてプレートを穏やかに洗浄します。次に、滅菌吸引またはピペットでPBSを取り外します。
- ピペット5 mLの1xトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)をPBSで10 cmプレートで細胞上に置き、37°Cで5分間インキュベートします。
- 穏やかなタップでプレートから細胞を取り除き、プレートから細胞を取り除きます。
- 滅菌済みの10 mLピペットを使用して、細胞をコニカルチューブ内の10%FBS血清とともにDMEMに回収します。
- 円錐管を180 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を注いで取り除きます。セルペレットが見えるはずです。それがチューブに残っていることを確認するためにそれを見てください。
- 1 mLのDMEM + 10%FBSを添加し、穏やかに上下にピペッティングして、ペレット細胞を再懸濁します。
- 細胞をDMEM + 10% FBSで適切なサイズの新しい組織培養プレートに再懸濁します(10 mLの培地は10 cmの組織培養プレートに適しています)。
3.注射用の線維芽細胞を生成します
注:原発性線維芽細胞は、倍増/継代が多すぎると老化します。限られた数の継代または倍増の後に初代線維芽細胞を使用することが重要です。線維芽細胞がマウスまたはヒトの皮膚から成長した継代または倍増の数を追跡します。初代ヒト皮膚線維芽細胞には、継代数が15未満の線維芽細胞を使用します。.マウス胚性線維芽細胞には、継代数が9未満の線維芽細胞を使用します。線維芽細胞は、コンフルエントになると変化します。線維芽細胞が約90%コンフルエントになったらトリプシン処理します。線維芽細胞は、培養方法によって異なる性質を持ちます。多くの科学者は、組織様環境をより効果的に捕捉する3Dコラーゲンマトリックスなどの組織培養プレートよりも生理学的に関連性のある基質での培養を促進しています23、24、25。
- セクション2.1の式を使用して、線維芽細胞の増殖速度を決定します。
- セクション2.2の式を使用して、線維芽細胞を拡張するのに必要な日数を決定します。
- セクション2.3で説明されているように、適切な日に適切な培地を使用して線維芽細胞をプレート化し、癌細胞と線維芽細胞が同じ日に注射の準備ができていることを確認します。
- 適切な培地で線維芽細胞を拡張して、セクション2.4で説明されている手順に従って必要な十分な数の線維芽細胞を生成します。
4.マウスを剃って注射用のマウスを準備する
注意: マウスを扱うときは、白衣、ヘアネット、靴カバー、手袋を着用してください。
- 注射の1〜2日前に、施設動物管理委員会の規則に従って、マウスに麻酔をかける。麻酔にイソフルランを使用する場合は、イソフルランとO2の混合物を使用してください。マウスを麻酔室に入れ、イソフルラン(5%)/ O2 混合物を導入して麻酔を誘発します。次に、麻酔をかけた動物にノーズコーンを置き、イソフルラン(2%)/ O2 混合物の一定の流れで麻酔の手術面を維持します。
- マウスのつま先をつまんでマウスが動かないことを確認し、動物をチェックして、適切な麻酔の手術面にいることを確認します。
- 外科用ブレード#40を備えた動物バリカンを使用して、毛皮が除去されるまで動物バリカンを皮膚に複数回通して、マウスの側面の適切な位置から毛皮をそっと取り除きます。
- マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。
5.注射用の癌細胞と線維芽細胞を準備します
注:がん細胞と線維芽細胞は、採取後できるだけ早く、できれば30分以内に注射する必要があります。注射の朝に、組織培養プレートとは別に癌細胞と線維芽細胞を採取します。セルの種類ごとに、次の手順を実行します。
- 組織培養プレートから培地を穏やかに滅菌吸引するか、培地をピペッティングして除去します。
- 細胞を破壊することなく、5 mLのPBSを穏やかにピペットで行います。PBSを回転させます。PBSを吸引またはピペットで静かに吸引します。
- PBS中のトリプシン-EDTA5 mLを細胞層上に穏やかにピペットし、37°Cで5分間インキュベートします。
- 穏やかなタップでプレートから細胞を取り除き、細胞を取り除きます。10 mLピペットで細胞を数回ピペットし、10%FBSを含むDMEMを含むコニカルチューブに細胞を移します。
- 円錐管を180 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を穏やかに注ぎ、細胞ペレットを保持して取り除きます。セルペレットをPBSで2回洗浄します。毎回、10 mLのPBSを細胞にピペットで貼り付けます。p1000ピペットで静かに混ぜます。
- ステップ5.5のように細胞を遠心分離します。ピペットでPBSをそっと取り外し、繰り返します。
- 洗浄したペレット化した細胞をp1000を含む1 mLのPBSに再懸濁します。
- 血球計算盤のスライドをアルコールできれいにして乾かします。
- 100 μLの細胞混合物をチューブにピペットし、0.4%トリパンブルーを400 μL加えて、最終トリパンブルー濃度を0.32%にします。
- チャンバーがいっぱいになるまで細胞混合物をピペッティングすることにより、カバーガラスの下にあるガラス血球計算盤のチャンバーをそっと満たします。
- 顕微鏡を使用して、10倍の対物レンズのグリッド線に焦点を合わせます。
- 生きている、染色されていない細胞と青い細胞を16個の正方形の1セットで数えます。
- 16個の正方形の4セットすべてを数えます。
- 16個の正方形の4セットのクリアセルとブルーセルのセル数を平均し、10,000を掛けます。5を掛けて、トリパンブルーからの1:5希釈を補正します。
- 最終的なカウントは、生細胞と死細胞の細胞/ mLの濃度です。体積を掛けて、癌細胞と線維芽細胞の総数を決定します。生菌の割合が>80%であることを確認します。
- 注射中にサンプルが少なくとも20%失われると仮定して、計画されたすべての注射に十分な数の黒色腫細胞と線維芽細胞があることを確認します。
- 必要な数の細胞を新しいコニカルチューブに移し、遠心分離(180 x gで5分間)によって細胞をペレット化します。
- 10 mLピペットで上清を除去します。
- 適切な量の米国薬局方(USP)グレードのPBS(皮内注射の場合は腫瘍あたり50 μL、皮下注射の場合は腫瘍あたり100 μL)に必要な濃度でペレットを再懸濁します。.
6.がん細胞と線維芽細胞をマウスに注入する
注:施設の動物管理委員会によって承認された場合は、各マウスに2つの腫瘍を注入し、各脇腹に1つずつ注入します。どのマウスが左右の側面にどの注射を受けるかをランダム化します。注射するマウスの数に応じて、マウスに麻酔をかけ、がん細胞と線維芽細胞をバッチでマウスに注入します。
- がん細胞の皮下注射用
- セクション4.1に記載されているようにマウスを麻酔します。
- 剃った皮膚をアルコール綿棒で拭きます。
- 滅菌シリンジに希望の量の細胞または細胞混合物を満たし、シリンジを27ゲージの針でキャップします。
注意: 気泡がないことを確認してください。必要に応じてシリンジをフリックして気泡を取り除きます。細胞がシリンジに導入されたら、凝集を防ぐためにシリンジを連続的に反転させて、シリンジ内の細胞をよく混合してください。 - マウスの脇腹の皮下領域に針を挿入し、細胞をマウスに静かに注入します。皮下注射には腫瘍あたり100 μLの細胞懸濁液を使用します(注射あたり100 μLを超える容量を使用することは推奨されません)。
- マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。必要に応じて、マウスが完全に回復するのを助けるために、小屋や加熱パッドなどの追加の断熱材をマウスに提供します。
- がん細胞の皮内注射用
- セクション4.1に記載されているようにマウスを麻酔します。
- 剃った皮膚をアルコール綿棒で拭きます。
- 滅菌シリンジに希望の量の細胞または細胞混合物を満たし、シリンジを27ゲージの針でキャップします。
注意: 気泡がないことを確認してください。必要に応じてシリンジをフリックして気泡を取り除きます。細胞がシリンジに導入されたら、凝集を防ぐためにシリンジを連続的に反転させて、シリンジ内の細胞をよく混合してください。 - マウスの脇腹の皮膚の皮内領域に27ゲージの針を挿入し、マウスの皮内領域に細胞を静かに注入します。皮内注射には腫瘍あたり50μLの細胞懸濁液を使用します(注射あたり50μLを超える容量を使用することは推奨されません)。
- マウスが麻酔から回復するまでマウスを監視します。マウスが苦しんでいる兆候がある場合は、獣医師に相談してください。必要に応じて、マウスが完全に回復するのを助けるために、小屋や加熱パッドなどの追加の断熱材をマウスに提供します。
7.腫瘍の成長中にマウスを監視する
- 痛みや苦痛の兆候(猫背姿勢、身もだえ、発声、ケージに沿って伸びる、腹部をケージの床の底に押し付ける、ケージの周りを移動するのをためらう)または膿瘍の形成がないかマウスを毎日監視します。マウスが苦しんでいる兆候がある場合は、獣医師に相談してください。
- 腫瘍が形成されたら、約2〜3日ごとに腫瘍の量を測定します。ノギスで腫瘍の長さ(最長辺)と幅(長さに垂直)を測定します。
注:ベストプラクティスは、データのばらつきを減らすために、実験全体で同じ人がこれらの測定を実行することです。測定のために、セクション4.1で説明されているようにマウスを麻酔します - 式で腫瘍体積を計算します 体積= 0.5 x(長さx幅2)。
8.腫瘍を採取し、腫瘍重量を測定する
- 腫瘍の成長が施設動物管理委員会によって確立された実験エンドポイントに達したときにマウスを安楽死させます。マウスをチャンバーに入れ、呼吸停止後1分間、圧縮されたCO2 でチャンバー空気をゆっくりと(毎分20〜30%)置換して安楽死させる。
- マウスに頸椎脱臼を行います。げっ歯類をしっかりした平らな面に拘束します。頭蓋骨の付け根の首の後ろに頑丈なペンまたは他の物を置きます。尻尾の付け根を持つ手で後方に引っ張りながら、頭を拘束している物体で素早く前後に押します。脊髄が切断されていることを触診で確認します。
注意: 頸部脱臼は、経験豊富なラボ担当者が行う必要があります。 - 実験の各マウスについて、呼吸、心拍、つま先のつまみに対する反応がないことを確認して、マウスが生きていないことを確認します。
- 滅菌メスと外科用ハサミを使用して、マウスから腫瘍全体を切除します。外科用ハサミで、腫瘍から非腫瘍組織を切り取ります。
- 分析天秤で腫瘍の重さを量り、腫瘍の重さを記録します。
9.腫瘍体積と腫瘍重量の統計分析
- 反復測定分散分析(ANOVA)を使用して、各グループの腫瘍体積を経時的に比較します。マウスごとに2つの腫瘍を注射した場合、対応のある分析を実行します。
- 両側検定を使用して、ANOVAのグループ間の腫瘍重量を比較します。次に、Tukeyの事後検定を使用して、どのグループが互いに有意に異なるかを判断できます。マウスごとに2つの腫瘍を注射した場合、対応のある分析を実行します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2058ヒト黒色腫細胞および初代ヒト皮膚線維芽細胞を無菌条件下で培養した。細胞を回収し、PBSで3回洗浄した。免疫不全マウス(NU/J-Foxn1ヌード系統)を25万個のA2058メラノーマ細胞のみで片側腹部に皮下注射した。もう一方の側面では、マウスに25万個のA2058メラノーマ細胞と75万個の線維芽細胞の混合物を注射した。細胞を12匹の免疫不全マウスに注射した。左右の脇腹への注射は無作為化された。腫瘍量は、注射後12、14、16、19、および21日目にモニターされました(図1A)。安楽死の際、腫瘍を切除し、画像化し(図1B)、体重を測定した(図1C)。線維芽細胞の存在は、有意に大きな腫瘍をもたらす。
図1:同時注射された線維芽細胞の存在下と非存在下での黒色腫増殖の比較。 メラノーマ細胞を、一次皮膚線維芽細胞の有無にかかわらずヌードマウスに導入した。(A)線維芽細胞を同時注射した場合とない場合の黒色腫の経時的な腫瘍体積のプロット。体積は0.5 *長さ*幅2として計算されました。平均体積と平均の標準誤差(SEM)がプロットされます。有意性を決定するためにANOVAを実施した。(B)切除された腫瘍の画像。(C)21日目の実験終了時の腫瘍の最終重量。平均重みとSEMがプロットされます。対応のない両側t検定を使用して、最終的な重みを比較しました。* は p < 0.05 を示し、*** は p < 0.001 を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
図1の実験では、ヒト皮膚線維芽細胞をヒトA2058メラノーマ細胞と同時導入すると、線維芽細胞を同時注入せずにメラノーマ細胞を導入した場合よりも大きな腫瘍が生じました。この差は、腫瘍の体積と腫瘍の重量に基づいて簡単に検出できます。結果は、癌関連線維芽細胞が腫瘍増殖を促進できるという複数の報告と一致しています5、6、7、8。腫瘍体積や腫瘍重量など、ここで説明するエンドポイントに加えて、追加のエンドポイントもモニタリングできます。追加の分析も可能です。例えば、発生した腫瘍は、ホルマリンに集めて固定し、パラフィンを包埋し、組織学のためにヘマトキシリンとエオジンで分析することができます。あるいは、発生した腫瘍を最適な切断温度化合物(OCT)に集めて、特定のタンパク質の免疫蛍光法でさらに分析することもできます。
これらの実験の重要な制限の1つは、癌細胞と同時注射された線維芽細胞が、数回の細胞分裂後に老化または死亡する可能性があることです。あるいは、同時注射された線維芽細胞は腫瘍から離れて移動してもよく、その場合、それらは腫瘍の成長に影響を及ぼさないかもしれない。線維芽細胞が老化、死滅、または腫瘍から離れると、時間の経過とともにその存在量が少なくなり、共導入された線維芽細胞の影響が腫瘍の成長にとって重要ではなくなります。実際、導入された癌細胞は、宿主から追加の線維芽細胞を動員することが期待されている。導入された線維芽細胞で特定の遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされる実験の場合、時間の経過とともに、コードされたタンパク質を発現する宿主線維芽細胞の動員により、観察される可能性のある表現型が低下すると予想されます。導入された線維芽細胞の存在をモニターするために、線維芽細胞は、GFP26、27などの蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作され得る。線維芽細胞がGFPを発現している場合、フローサイトメトリーを使用して、導入後の異なる日に腫瘍内に存在する線維芽細胞の数をモニターできます。代替として、ルシフェラーゼ酵素を線維芽細胞に導入することができ、生物発光イメージングを使用して、マウスにおける線維芽細胞の量を経時的にモニターすることができる。線維芽細胞が腫瘍微小環境から急速に排除された場合、Cre-lox遺伝子操作マウスモデルはこの懸念に対処し、記載された研究を補完します。
ヒトのがん細胞や線維芽細胞をヌードマウスに導入して実験を行うと、免疫系が限られていることが結果に大きな影響を与えることが予想されます。胸腺ヌードマウス(NU / J)はT細胞を欠いているため、細胞性免疫を欠いています。それらはまた、B細胞の発達において部分的な欠陥を有する。細胞媒介免疫、すなわち活性化されたCD8+ T細胞を介した細胞の死滅は、腫瘍増殖の抑制に重要な役割を果たすことができる28,29。最近の研究では、癌関連線維芽細胞とCD8+ T細胞との間の相互作用が報告されている30,31,32。免疫系を持つマウスにマウスのがん細胞やマウス線維芽細胞を導入することは、この問題に対処する代替アプローチと考えることができます。
別の代替アプローチは、Cre-loxシステムを使用して宿主線維芽細胞における特定のタンパク質のレベルまたは活性を調節する遺伝子改変マウスモデルを使用することである。そのようなアプローチの1つは、FSP1、Col1a1、Col1a2、またはPDGFRa 33、34、35などのドライバーで線維芽細胞に富むCre-loxモデルを使用することです。Cre/loxリコンビナーゼモデルでは、注入された線維芽細胞が死滅したり、腫瘍から離れたりする心配はありません。
提供されるプロトコルには、その成功に不可欠ないくつかのステップがあります。線維芽細胞の成長はプロトコルの重要な部分であり、結果に大きく貢献する可能性があります。原発性線維芽細胞は容易に老化し、線維芽細胞が指数関数的成長段階にあり、老化していないことを確認するために、通過または倍増を注意深く監視する必要があります。老化性線維芽細胞は、腫瘍の成長に劇的な影響を与える可能性のある高レベルのサイトカインを分泌すると予想されています36、37、38。したがって、継代数が注意深く文書化され、プロトコルが老化性線維芽細胞の分析を要求しない限り、注入された線維芽細胞が老化していないことが非常に重要です。
線維芽細胞がコンフルエントになると、それらは多数の変化を受けることが予想され、そのうちのいくつかは、細胞周期に再び入ると逆転する可能性があります39、40、41、42、43、44。線維芽細胞を増殖状態に維持し、90%コンフルエントになったら分割することは、研究の一貫性を可能な限り高めるために重要です。組織培養プレート上で線維芽細胞を培養することもその挙動に影響を与える可能性が高く、3Dコラーゲンマトリックスなどの代替物を考慮する必要があります23,24,25。3Dマトリックスで培養された線維芽細胞は、2D表面45、46、47、48、49で増殖した線維芽細胞とは実質的に異なる遊走パターンを示し、腫瘍に導入されると腫瘍促進能力に影響を与える可能性が高く、線維芽細胞は腫瘍細胞外マトリックス微小環境50の確立において積極的な役割を果たす。
皮内注射を介してメラノーマ細胞をマウスに注射すると、皮下注射よりも再現性の高い腫瘍増殖が得られます。皮内領域にはほとんどスペースがないため、これはトリッキーなステップです。針を慎重に配置することが重要です。皮内注射を行う場合、50μLの溶液のみが注射される。経験豊富な研究者でも、これらの注射は漏れる可能性があります。腫瘍が形成されない場合は最終分析から除外できるように、各注射が漏れたかどうかに注意することが重要です。
注射用の注射器の準備は、別の重要なステップです。シリンジからすべての気泡を取り除くことが重要であり、気泡を除去するためにシリンジをフリックする必要があります。細胞が凝集しないことも重要です。凝集を防ぐためにシリンジを繰り返し反転させます。
これらの実験のもう一つのトリッキーな側面は、腫瘍体積の測定が人によって異なる可能性があることです。腫瘍体積測定値のばらつきを制限するために、実験中のすべてのマウスおよびすべての時点ですべての腫瘍体積測定を行う責任を1人のラボメンバーに割り当てることが役立ちます。
可能な限り宿主マウスと同性の癌細胞をマウスに注射することが好ましい。性別が時間の経過とともに腫瘍のサイズに影響を与えるかどうかを判断するために、両方の性別を使用し、性別を変数としてANOVAモデルに含めることができます。
腫瘍微小環境を理解することは、腫瘍形成への洞察を得るために不可欠です。このプロトコルは、線維芽細胞の役割、さまざまな種類の線維芽細胞、および腫瘍の成長に影響を与える可能性のある線維芽細胞内のさまざまな経路を理解するための基礎を提供できます。これらの実験からの知見は、線維芽細胞が腫瘍増殖を促進するのを防ぐ新しい治療標的を特定する可能性があります18。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、有益な意見を提供してくれたColler研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。H.A.C.は、リタ・アレン財団のミルトン・E・カッセル奨学生でした。NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1、NIH 1 R01 AR070245-01A1、黒色腫研究アライアンスチーム科学賞、がん研究所臨床検査統合プログラム賞、アイリスカンターウィメンズヘルスセンター/ UCLA CTSI NIHグラントUL1TR000124、カリフォルニア大学がん研究調整委員会、デビッドゲフィン医学部代謝テーマ賞、臨床トランスレーショナルサイエンスインスティテュート、ジョンソン総合がんセンター、 Broad Stem Cell Research Center(Rose Hills and Ha Gaba)からのInnovation Award、UCLA SPORE in Prostate Cancer(National Cancer Institute of the National Cancer Institute of the National Institutes of the National Institutes、Award Number P50CA092131)、Broad Stem Cell Center、Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLAからのイノベーション賞、 腫瘍細胞生物学トレーニングプログラム(USHHSルースL.キルシュスタイン機関国立研究サービス賞#T32 CA009056)、UCLA AR32の皮膚科T071307プログラム、およびUCLA筋細胞生物学、病態生理学および治療T32トレーニングプログラム5 T32 AF 65972。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G Needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 326895 | |
| Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 | WAHL Professional | 8787-450A | |
| Athymic nude mice (NU/J) | The Jackson labs | 002019 | These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced. |
| Cancer cells | ATCC | ATCC® CRL-11147™ | This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used. |
| Cell Culture Multi Flasks | Fisher Scientific | 14-826-95 | |
| Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Countess Cell Counting Chamber | Fisher Scientific | C10228 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used. |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| PBS USP grade for injection into mice | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterile 10 ml serological pipet | Celltreat | 667210B | |
| Sterile 5 ml serological pipet | Celltreat | 229005B | |
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns | Fisher Scientific | 09-740-61A | |
| Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 15400054 | |
| Sterile tissue-culture grade PBS | Fisher Scientific | 50-751-7476 | |
| Sterle 25 ml serological pipet | Celltreat | 667225B | |
| TC treated 100 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| TC treated 150 x 20 mm dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| TC treated 60 x 15 mm dishes | Genesee Scientific | 25-260 | |
| Trypan blue | Fisher Scientific | C10228 |
References
- Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D.
- Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
- Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
- Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
- Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
- Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
- Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
- Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
- Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
- Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
- Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
- Sullivan, L. M.
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
- Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
- Hoffman, R. M.
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
- Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
- Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
- Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
- Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
- Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
- Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
- Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
- Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
- Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
- Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
- Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
- Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
- Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
- Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).
