Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Oligonukleotide wie small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs) oder anti-micro-RNA (anti-miR) in reife Adipozyten zu liefern, um die Protein- und micro-RNA-Expression zu modulieren.
Abstract
Die Veränderung der Adipozytenfunktion trägt zur Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und Insulinresistenz bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Die Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in Adipozyten bleibt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Differenzierung muriner Fibroblasten in reife Adipozyten und zur Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in reifen Adipozyten durch Reverse-Transfektion unter Verwendung von small-interfering RNA (siRNA) und micro-RNA mimicking (miR mimic) Oligonukleotiden. Dieses Reverse-Transfektionsprotokoll beinhaltet die Inkubation des Transfektionsreagenz und der Oligonukleotide, um einen Komplex in der Zellkulturplatte zu bilden, zu dem die reifen Adipozyten hinzugefügt werden. Die Adipozyten dürfen sich dann in Gegenwart des Oligonukleotid-/Transfektionsreagenzienkomplexes wieder an der adhärenten Plattenoberfläche befestigen. Funktionelle Analysen wie die Untersuchung der Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse können an den transfizierten 3T3-L1 reifen Adipozyten durchgeführt werden, um den Einfluss von Protein- oder Mikro-RNA-Manipulation auf die Adipozytenfunktion zu untersuchen.
Introduction
Fettleibigkeit gilt als Hauptrisikofaktor für zahlreiche Stoffwechselerkrankungen, darunter Insulinresistenz (IR), Typ-2-Diabetes (T2D) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. Aktuelle Therapien haben es nicht geschafft, die ständig steigende Prävalenz dieser Krankheiten zu stoppen, und das Management der IR von adipösen und diabetischen Patienten bleibt ein wichtiges klinisches Problem. Fettgewebe spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Energieöostase, und seine pathologische Ausdehnung während der Fettleibigkeit trägt zur Entwicklung von IR und T2D2,3bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Viele Forschungsstudien haben die Rolle proteinkodierender RNAs in der Adipozytenphysiologie und ihre Assoziation mit Fettleibigkeit untersucht.
In jüngerer Zeit hat die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), insbesondere Mikro-RNAs (miRs), neue Konzepte im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Regulation von Genexpressionsprogrammen entwickelt. Studien haben gezeigt, dass ncRNAs wichtige Regulatoren der Adipozytenfunktion sind und dass ihre Dysregulation eine wichtige Rolle bei Stoffwechselerkrankungen spielt4. Daher ist die Manipulation von Proteinen und ncRNAs in Adipozyten entscheidend, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre Auswirkungen auf Pathologien wie T2D zu entschlüsseln. Die Manipulation der Expression von Proteinen und ncRNAs in vivo sowie in primären Adipozyten bleibt jedoch eine große Herausforderung, was die Verwendung von In-vitro-Adipozytenmodellen begünstigt.
Murine 3T3-L1 Fibroblasten unterscheiden sich leicht in reife, funktionelle und insulin-responsive Adipozyten, die eine gut charakterisierte Zelllinie sind, die zur Untersuchung der Adipozytenfunktion verwendet wird (z. B. Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipolyse und Adipokinsekretion)5,6,7,8,9,10. Diese Eigenschaften machen 3T3-L1-Adipozyten zu einem attraktiven Modell, um die Expression von proteinkodierenden und nc-RNAs zu modulieren, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre potenzielle Rolle bei Adipositas-bedingten Krankheiten zu entschlüsseln. Während 3T3-L1-Fibroblasten mit handelsüblichen Reagenzien leicht zu transfizieren sind, sind differenzierte 3T3-L1-Adipozyten leider eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien. Aus diesem Grund haben sich zahlreiche Studien zur Manipulation der Genexpression in 3T3-L1-Zellen auf die Adipozytendifferenzierung und nicht auf die Adipozytenfunktion konzentriert.
Lange Zeit war die einzige effiziente Technik, um Adipozyten zu transfizieren, die Elektroporation5, die mühsam und teuer ist und Zellschäden verursachen kann. Dieser Artikel berichtet über eine Reverse-Transfektionstechnik mit einem gängigen Transfektionsreagenz, das die praktische Zeit für die Transfektion verkürzt, keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit hat und viel kostengünstiger ist als die Elektroporation. Dieses Protokoll eignet sich perfekt für die Transfektion von siRNA und anderen Oligonukleotiden wie Micro-RNA-Mimics (miR-Mimics) und Anti-MiRs. Das Prinzip des Reverse-Transfektionsprotokolls besteht darin, das Transfektionsreagenz und die Oligonukleotide zu einem Komplex in der Zellkulturplatte zu inkubieren und dann die reifen Adipozyten in die Vertiefungen zu säen. Dann befestigen sich die Adipozyten wieder an der adhärenten Plattenoberfläche in Gegenwart des Oligonukleotid/Transfektionsreagenzkomplexes. Diese einfache, effiziente und kostengünstige Methodik ermöglicht die Untersuchung der Rolle proteinkodierender RNAs und miRs bei der Adipozytenfunktion und ihrer potenziellen Rolle bei Adipositas-bedingten Erkrankungen.
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Protocol
HINWEIS: Verwenden Sie sterile Techniken, um alle Schritte des Protokolls in einer laminaren Flusszellenkulturhaube auszuführen. Siehe Materialtabelle für Details zu allen Reagenzien und Geräten.
1. Differenzierung von murinen 3T3-L1 Fibroblasten in Adipozyten
- Züchten Sie die 3T3-L1-Fibroblasten in 100-mm-Schalen in Kulturmedium DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% neugeborenes Kälberserum und 1% Penicillin und Streptomycin (Abbildung 1A). Stellen Sie das Geschirr in einen Gewebekultur-Inkubator(7% CO 2 und 37 °C).
- Wechseln Sie zwei Tage nach dem Zusammenfluss das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% fetales Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 0,25 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 0,25 μM Dexamethason, 5 μg/ml Insulin und 10 μM Rosiglitazon.
HINWEIS: Es dauert 5 Tage, um die Konfluenz zu erreichen, wenn die Zellen mit 300.000 Zellen pro 100-mm-Schale ausgesät werden. - Zwei Tage später ersetzen Sie das Kulturmedium durch DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 5 μg/ml Insulin und 10 μM Rosiglitazon und inkubieren Sie 2 Tage lang. Dann füttern Sie die Zellen alle 2 Tage mit DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin (Abbildung 1B).
- Transfizieren Sie die 3T3-L1-Adipozyten 7-8 Tage nach Beginn des Differenzierungsprotokolls.
HINWEIS: Es ist wichtig, vor der Transfektion ein hohes Differenzierungsniveau (>80%) zu erreichen, um die Proliferation der verbleibenden Fibroblasten nach der Transfektion zu vermeiden, was zu einer gemischten Zellpopulation führen würde, die die Ergebnisse verzerren könnte.
2. Vorbereitung von vorbeschichteten Platten
- Bereiten Sie am Tag vor oder einige Stunden vor der Transfektion eine Lösung von Kollagen Typ I bei 100 μg/ml in 30% igem Ethanol aus einer Stammlösung bei 1 mg/ml vor. Fügen Sie 250 μL Kollagen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und 125 μL pro Well einer 24-Well-Platte hinzu und verteilen Sie die Lösung über die Oberfläche der Well.
- Lassen Sie die Platte ohne Deckel unter der Kulturhaube, bis das Kollagen trocknet. Zweimal mit dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) waschen.
HINWEIS: Vorbeschichtete Platten sind ebenfalls erhältlich.
3. Herstellung der Transfektionsmischung
HINWEIS: Die Endkonzentration von siRNA liegt zwischen 1 und 100 nM (1 bis 100 pmol siRNA pro Vertiefung einer 12-Well-Platte). Die Endkonzentration der miR-Mimik beträgt 10 nM (10 pmol/well). Bestimmen Sie die beste Konzentration jeder siRNA, miR-Mimik oder eines anderen Oligonukleotids vor Beginn des Experiments, um Off-Target-Effekte zu vermeiden. Führen Sie Transfektionsexperimente in dreifacher Ausführung durch, um die statistische Analyse der Ergebnisse zu erleichtern. Bereiten Sie alle rezienten Im Übermaße vor, um den normalen Verlust während des Pipettierens zu berücksichtigen.
- Mischen Sie durch Pipettieren (Volumen/Volumen) die siRNA (oder andere Oligonukleotide) mit einem verbesserten minimalen essentiellen Medium (Tabelle 1). 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte minimal essentielle Medium zur siRNA hinzu und mischen Sie es mit einer Pipett (Tabelle 1). 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (während dieser Zeit fahren Sie mit Abschnitt 4 fort). Fügen Sie die Transfektionsmischung zu jeder Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte hinzu.
4. Herstellung der 3T3-L1-Adipozyten
- Waschen Sie die Zellen in der 100 mm Petrischale zweimal mit D-PBS. Fügen Sie 5x Trypsin zu den Zellen hinzu (1 ml pro 100-mm-Schüssel) und achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin zu bedecken. Warten Sie 30 s und entfernen Sie das Trypsin vorsichtig.
- Die Petrischale für 5-10 min bei 37 °C im Inkubator inkubieren. Tippen Sie auf die 100-mm-Schüssel, um die Zellen zu lösen.
- Fügen Sie 10 ml DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipetieren Sie das Medium vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu lösen und die Zellsuspension zu homogenisieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 6,25 x10 5 Zellen / ml Medium ein. Säen Sie 800 μL der Zellsuspension/Vertiefung einer 12-Well-Platte (5 x10 5 Zellen) oder 400 μl der Zellsuspension/Vertiefung einer 24-Well-Platte (2,5 x 105 Zellen), die die Transfektionsmischung enthält.
HINWEIS: Eine 100-mm-Petrischale aus Adipozyten ermöglicht die Herstellung einer 12-Well-Platte oder einer 24-Well-Platte. Eine 100 mm Schale enthält in der Regel 6-7 x10 6 Adipozyten, die 5 x 105 Adipozyten pro Vertiefung einer 12-Well-Platte entsprechen. - Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator(7% CO 2 und 37 °C) und stören Sie die Zellen 24 Stunden lang nicht. Ersetzen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Überstand durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin.
HINWEIS: Es ist auch möglich, die Zellen in kollagenvorbeschichtete 48- und 96-Well-Platten zu säen, aber beim Austausch der Medien mehr Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um eine Ablösung der Adipozyten zu vermeiden.
5. Funktionsanalyse transfizierter 3T3-L1-Adipozyten
- Ziel der Studie ist ein Knockdown von 24-48 h bzw. 48-96 h nach siRNA- oder miR-Mimikabgabe für mRNA bzw. Protein.
- Führen Sie funktionelle Analysen von transfizierten Adipozyten durch, um Die Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Adipokinsekretion, Lipolyse und Lipogenese zu untersuchen.
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Representative Results
Mit dem hier beschriebenen Verfahren der Umgekehrttransfektion zur Modulation der Expression von Proteinen oder Mikro-RNAs in 3T3-L1-Adipozyten wurde gezeigt, dass die Adipozyten ihre Morphologie nach der Transfektion bewahren (Abbildung 1B, C). Tatsächlich waren die Adipozyten 2 Tage nach der Transfektion gut verteilt und an der Platte befestigt und präsentierten multilokuläre Lipidtröpfchen, die für reife 3T3-L1-Adipozyten charakteristisch sind. Der Lipidgehalt unterschied sich nicht zwischen den transfizierten und nicht transfizierten Adipozyten (Abbildung 1D,E). Darüber hinaus war die mRNA-Expression von Differenzierungsmarkern wie Peroxisomen-Proliferator-aktiviertem Rezeptor gamma 2(Pparγ2), Adiponectin (Adipoq),Glukosetransporter 4 oder gelöster Trägerfamilie 2 Mitglied 4(Slc2a4),Insulinrezeptorsubstrat 1 (Irs1), Perilipin-1 (Plin1) in transfizierten Zellen im Vergleich zu denen in nicht transfizierten Adipozyten unverändert ( Abbildung1F). Dieses Reverse-Transfektionsprotokoll ist effizient, da >70% der Adipozyten transfiziert wurden (Abbildung 1G,H).
Perilipin-1 ist ein Adipozyten-spezifisches Protein, von dem bekannt ist, dass es die Bildung von Lipidtröpfchen fördert und die Lipolyse hemmt. Hier wurden 3T3-L1-Adipozyten mit scrambled siRNA (si-SCR) oder siRNA gegen Plin1 (si-PLIN1) transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion mit si-PLIN1 war der mRNA-Spiegel von Plin1 um 70% gesunken (Abbildung 2A) und der Proteinspiegel um 63% (Abbildung 2B, C). Die PLIN1-Expression wurde auch 4 Tage nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert und es wurde festgestellt, dass sie im Vergleich zu ihrer Expression in Kontrolladipozyten um 92% abgenommen hat (Abbildung 2D-F), was die Wirksamkeit sowohl des Transfektionsprotokolls als auch des si-PLIN1 zeigt.
Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um eine umgekehrte Transfektion von Adipozyten mit mikro-RNA-imitierenden (miR imitierten) Oligonukleotiden durchzuführen, um die Expression von miR-34a hochzuregulieren (Abbildung 3A). Die Überexpression von miR-34a führte zu einer Abnahme der VAMP2-Proteinexpression um 50% (Abbildung 3B, C), ein bestätigtes Ziel von miR-34a11,12. Schließlich zeigt diese Studie, dass die Umgekehrttransfektion von 3T3-L1-Adipozyten ihre Funktion und Reaktionsfähigkeit auf Insulinstimulation bewahrt. Tatsächlich führte der Knockdown von Plin1 in 3T3-L1-Adipozyten zu einer Zunahme der Basallipolyse (Abbildung 4A). Darüber hinaus führte die Überexpression von miR-34a in 3T3-L1-Adipozyten zur Hemmung der insulininduzierten Proteinkinase-B-Phosphorylierung (Abbildung 4B, C) und der Glukoseaufnahme ( Abbildung4D).
Abbildung 1: Differenzierung von 3T3-L1-Fibroblasten in reife Adipozyten. (A) 3T3-L1 Fibroblasten wurden mit einer Dichte von 3 x 105 Zellen pro 100 mm Schale ausgesät. Repräsentatives 10x Hellfeldbild von 3T3-L1 Fibroblasten 2 Tage später. (B) Zwei Tage nach der Konfluenz (Tag 0) wurden die 3T3-L1-Fibroblasten mit einem Differenzierungscocktail-Mix für 4 Tage (bis Tag 4) in Adipozyten differenziert. Repräsentatives 10-faches Hellfeldbild von 3T3-L1-Fibroblasten, differenziert in Adipozyten (Tag 7). Adipozyten mit multilokulären Lipidtröpfchen sind leicht zu erkennen. (C) Die 3T3-L1-Adipozyten wurden am 7. Tag mit si-SCR transfiziert. Repräsentative 10x Hellfeldbilder von transfizierten 3T3-L1 Adipozyten (Tag 9). Die Morphologie der transfizierten Adipozyten ist vergleichbar mit der der nicht transfizierten Adipozyten, was bedeutet, dass die Transfektionsmethode schonend und nicht toxisch für die Adipozyten ist. Skalenbalken: 50 μm. (D–E) Die 3T3-L1-Adipozyten wurden am Tag 7 mit si-SCR transfiziert (obere Panels); nicht transfizierte Adipozyten (untere Panels). Zwei Tage später wurden die Zellen mit Oil Red O inkubiert, um Lipide zu färben. (D) Es werden repräsentative Bilder der gefärbten Zellen in der Platte und repräsentative 10x Hellfeldbilder gezeigt. Skalenbalken: 50 μm. (E) Das in die Zellen eingebaute oil Red O wurde mit 2-Propanol eluiert und mit einem Spektralphotometer quantifiziert. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die Absorption der nicht transfizierten Zellen auf 1 normalisiert wird. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt. (F) Die 3T3-L1-Adipozyten wurden mit si-SCR transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, um die Gesamt-RNA zu isolieren. Die Expression von Adipozyten-Differenzierungsmarkern wurde mittels qRT-PCR gemessen und mit 36B4-RNA-Spiegeln normalisiert. Die Daten repräsentieren die mRNA-Expression in transfizierten Zellen relativ zu der in nicht transfizierten Zellen (normalisiert auf 1, dargestellt durch die gepunktete Linie) und werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt. (G–H) Die 3T3-L1-Adipozyten wurden mit si-SCR- oder fluoreszierstoffstoffmarkierten (FAM)-markierten si-RNA transfiziert und auf Coverlips plattiert. 3T3-L1 Adipozyten wurden 8 h später mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. (G) Repräsentatives Einebenenbild von transfizierten 3T3-L1-Zellen wird gezeigt. (H) Quantifizierung der FAM-positiven Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellen. Die Daten werden als Prozentsatz der Zellen ausgedrückt, die fluoreszierende si-RNA enthalten. Die statistische Analyse wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt, ****p < 0,0001. Abkürzungen: si-SCR = scrambled siRNA; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion; FAM = Fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; si-FAM = FAM-markierte si-RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Protein-Silencing in 3T3-L1-Adipozyten. 3T3-L1-Adipozyten wurden mit verschlüsselter si-RNA (si-SCR) oder si-RNA gegen Plin1 (si-PLIN1) transfiziert. (A) Drei Tage nach der Transfektion wurde die mRNA-Expression von Plin1 mittels qRT-PCR gemessen. Die mRNA-Expression wurde unter Verwendung von 36B4-RNA-Spiegeln normalisiert und in beliebigen Einheiten exprimiert, wobei die si-SCR-behandelten Zellen auf 1 normalisiert wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von vier unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt, **p < 0,01. (B–C) Drei Tage nach der Transfektion wurden Proteinlysate einem Western Blotting mit Antikörpern gegen PLIN1 und HSP90 (Ladekontrolle) unterzogen. Repräsentative Immunoblots werden gezeigt. (C) Die Menge an PLIN1 wurde durch densitometrische Scananalyse quantifiziert und mit der Menge an HSP90 normalisiert. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die si-SCR-behandelten Zellen auf 1 normalisiert werden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von vier unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt, *p < 0,05. (D–F) Die 3T3-L1-Adipozyten wurden mit si-SCR oder si-PLIN1 transfiziert und auf Abdecklippen plattiert. Die Expression von PLIN1 wurde 96 h später mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. (D) Es werden repräsentative Single-Plane-Bilder von 3T3-L1-Adipozyten gezeigt, die mit einem Anti-Perilipin-Antikörper und einem Anti-Kaninchen-Alexa647-konjugierten Antikörper gefärbt sind. Maßstabsbalken = 10 μm. (E) Dreidimensionale (3D) Volumenwiedergabe von 3T3-L1-Adipozyten, die mit kommerzieller Software in 3D segmentiert wurden. Skalenbalken = 10 μm. (F) Die Quantifizierung der PLIN1-Signalintensität relativ zur Gesamtzahl der Zellen. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die si-SCR-behandelten Zellen auf 100% normalisiert werden. Die statistische Analyse wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt, ****p < 0,0001. Abkürzungen: si-SCR = scrambled siRNA; si-PLIN1 = siRNA gegen Plin1; Plin1 = Perilipin-1; HSP90 = Hitzeschockprotein 90; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion; FAM = Fluorescein amidit; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; IB = Immunoblotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mikro-RNA-Überexpression in 3T3-L1-Adipozyten. 3T3-L1-Adipozyten wurden mit Kontroll-Micro-RNA-Mimik (miR-Kontrolle) oder Mikro-RNA-34a-Mimik (miR-34a) transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen für die (A) RNA-Extraktion oder (B) Herstellung von Proteinlysaten geerntet. (A) Die Expression von miR-34a wurde mittels qRT-PCR gemessen. Die miR-Expression wurde unter Verwendung von U6-Small-RNA-Spiegeln normalisiert und in beliebigen Einheiten exprimiert, wobei die mit miR-Kontrolle behandelten Zellen auf 1 normalisiert wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt, *p < 0,05. (B) Proteinlysate wurden einem Western Blotting mit Antikörpern gegen VAMP2 und TUBULIN unterzogen (Belastungskontrolle). Repräsentative Immunoblots von drei unabhängigen Experimenten werden gezeigt. (C) Die Menge an VAMP2 wurde durch densitometrische Scananalyse quantifiziert und unter Verwendung der Menge an TUBULIN normalisiert. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die miR-Kontrollzellen auf 1 normalisiert werden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde durch den Student's t-Testdurchgeführt, *p < 0,05. Abkürzungen: SEM = Standardfehler des Mittelwerts; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion; VAMP2 = Vesikel-assoziiertes Membranprotein 2; IB = Immunoblotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswirkungen der Protein- oder Mikro-RNA-Modulation auf die 3T3-L1-Adipozytenfunktion. (A) 3T3-L1-Adipozyten wurden mit si-SCR oder si-PLIN1 transfiziert. Das Medium wurde 24 h nach der Transfektion gewechselt und 48 h später gesammelt, um die Basallipolyse zu messen. Die Ergebnisse werden als in den Medien freigesetztes Glycerin (μg/ml) und als Mittelwert + REM von vier unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Testdurchgeführt, ***p < 0,001. (B) 3T3-L1-Adipozyten wurden mit miR-Control oder miR-34a transfiziert. Das Medium wurde 24 h nach der Transfektion gewechselt, und dann, 48 h später, wurde das Medium für 6 h auf das Erschöpfungsmedium (DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 1% Penicillin und Streptomycin und 0,5% BSA) gewechselt. Dann wurden die Zellen für 5 min mit 0,5 nM Insulin behandelt. Die Zellen wurden geerntet, um Proteinlysate für das Western Blotting mit Antikörpern gegen Phospho-PKB und PKB (Loading Control) vorzubereiten. Repräsentative Immunoblots von drei unabhängigen Experimenten werden gezeigt. (C) Die Menge an Phospho-PKB wurde durch densitometrische Scananalyse quantifiziert und anhand der Gesamtmenge an PKB normalisiert. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die mit Insulin behandelten miR-Kontrollzellen auf 1 normalisiert werden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Zwei-Wege-ANOVA-Test *p < 0,05 im Vergleich zu mit Insulin behandelten miR-Kontrollzellen durchgeführt. (D) 3T3-L1-Adipozyten wurden mit miR-Control oder miR-34a transfiziert. Das Medium wurde 24 h nach der Transfektion gewechselt, und dann, 48 h später, wurde das Medium für 6 h auf das Erschöpfungsmedium umgestellt. Dann wurden die Zellen 20 Minuten lang mit 0,5 nM Insulin behandelt. Die Aufnahme von(2-3H)Desoxyglucose wurde über 3 min gemessen. Die Daten werden in beliebigen Einheiten ausgedrückt, wobei die basale Glukoseaufnahme in mit miR-Kontrolle behandelten Zellen auf 1 normalisiert wird. Die Ergebnisse werden als Mittelwert + REM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit dem Zwei-Wege-ANOVA-Test *p < 0,05 im Vergleich zu mit Insulin behandelten miR-Kontrollzellen durchgeführt. Abkürzungen: si-SCR = scrambled siRNA; si-PLIN1 = siRNA gegen Plin1; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; PKB = Proteinkinase B; p-PKB = Phosphor-PKB; miR-CTL = miR-Control; DMEM = Dulbeccos modifiziertes Adlermedium; BSA = Rinderserumalbumin; ANOVA = Varianzanalyse; IB = Immunoblotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Pro Vertiefung (12-Well-Platte) | Pro Vertiefung (24-Well-Platte) | |
| Oligonukletide | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Verbessertes minimal essentielles Medium | 20 μL | 10 μL |
| Transfektionsreagenz | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Verbessertes minimal essentielles Medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Gesamtvolumen der Transfektionsmischung | 200 μL | 100 μL |
Tabelle 1: Transfektionsreagenzien, die für 12-Well- und 24-Well-Plattenformate erforderlich sind.
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Discussion
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung und Transfektion reifer Adipozyten vor. Diese Reverse-Transfektionsmethode ist eine einfache, wirtschaftliche und hocheffiziente Methode, um Oligonukleotide wie siRNAs, micro-RNA-Nachahmungen und Anti-Mikro-RNAs in 3T3-L1-Adipozyten zu transfizieren, was eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien ist. Diese Methode hat einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Dieses Protokoll ist nicht effizient für die Transfektion mit Plasmid-DNA, was den Nutzen dieser Technik für Gain-of-Function-Studien einschränkt. Obwohl murine Zelllinien, einschließlich der 3T3-L1-Zelllinie, typischerweise zur Untersuchung der Adipozytenfunktion in vitro verwendet wurden, unterscheiden sich die Mikro-RNA-Expressionsmuster und -aktivitäten im murinen Gewebe oft von denen, die beim Menschen beobachtet wurden; dies ist auch bei Primärzellen und Zelllinien der Fall. Darüber hinaus erfordert das Medium, das für die Differenzierung von 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten verwendet wird, einen unphysiologischen Hormoncocktail (Insulin, Dexamethason, IBMX und Rosiglitazon), und die differenzierten Zellen unterscheiden sich morphologisch von in vivo reifen Adipozyten: Sie präsentieren multiokulare Lipidtröpfchen anstelle eines unilokulären Lipidtröpfchens. Dies könnte einige Unterschiede in der Genexpression und den zellulären Reaktionen zwischen In-vitro- und In-vivo-Studien erklären.
Ein Vorteil der Verwendung dieses Reverse-Transfektionsprotokolls im Vergleich zur Elektroporation ist, dass diese Methode billiger ist. In der Tat sind die Reagenzien kostengünstiger, und die hohe Effizienz der umgekehrten Transfektion verringert die Menge der benötigten Oligonukleotide, und es besteht keine Notwendigkeit für teure Geräte wie einen Elektroporator. Darüber hinaus ist die Verwendung einer niedrigeren Konzentration von siRNA von Vorteil, da sie Off-Target-Effekte vermeidet. Darüber hinaus ist diese Umgekehrttransfektion eine einfache, schnelle, sanfte und unkomplizierte Transfektionsmethode, die weniger Zellen benötigt und im Vergleich zur Elektroporation eine hervorragende Zelllebensfähigkeit und robustere Daten gewährleistet. Obwohl das oben beschriebene Verfahren für die Differenzierung und Rücktransfektion von Maus-3T3-L1-Zellen optimiert wurde, können menschliche Präadipozyten auch in Adipozyten5 differenziert und mit diesem Protokoll leicht einer Umgekehrttransfektion unterzogen werden. Dieser Bericht zeigt, dass Adipozyten nach der Umgekehrttransfektion mit einer neuen Generation eines nicht-liposomalen kationischen amphiphilen Transfektionsreagenz lebensfähig, gesund und auf Insulin ansprechend bleiben. Die Umgekehrttransfektion könnte auch mit anderen gängigen Transfektionsreagenzien durchgeführt werden. Die Mengen an Oligonukleotiden und Transfektionsreagenz müssten jedoch optimiert werden, um eine gute Modulation der Expression und keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung der Rolle von Proteinen und Mikro-RNAs in der Adipozytenfunktion, könnte aber auch verwendet werden, um andere nicht-kodierende RNAs wie lnc-RNAs, Y-RNAs oder eRNAs zu modulieren. Es gibt kritische Schritte im Protokoll, die sich auf die Effizienz des Verfahrens auswirken können. Die Differenzierung von 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten sollte sorgfältig überwacht werden. Es ist wichtig, ein hohes Maß an Differenzierung zu erreichen, um die Proliferation der verbleibenden Fibroblasten nach der Transfektion zu vermeiden, die die Ergebnisse des Experiments verzerren würde. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Durchführung der Transfektion an neu differenzierten reifen Adipozyten; das beste Timing ist 7-8 Tage nach Beginn des Differenzierungsprotokolls, was 3-4 Tagen nach dem Entfernen des Differenzierungscocktails entspricht. Dies gewährleistet eine robuste Transfektionswirksamkeit und begünstigt eine gute Wiederanhaftung der Adipozyten an der Platte. Schließlich sollte die Behandlung von Adipozyten mit Trypsin sorgfältig überwacht werden, um eine Ablösung der Adipozyten zu gewährleisten, ohne die Zellen zu schädigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom INSERM, der Université Côte d'Azur und der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) durch das Programm Investitionen für das zukünftige Exzellenzlabor (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) und die Exzellenzinitiative (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) unterstützt. J.J. wird durch Zuschüsse der Société Francophone du Diabète (SFD), der Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), des Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) und der Fondation Benjamin-Delessert unterstützt. J.G. wird von ANR-18-CE14-0035-01 unterstützt. J-F.T. wird durch den ANR-Zuschuss ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 und einen Zuschuss der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) unterstützt. Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und auch von der GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA) unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
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- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
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