Applications de l’immobilisation des tissus drosophiles avec caillots de fibrine pour l’imagerie en direct

Résumé

Ce protocole décrit les applications de l’immobilisation de l’échantillon à l’aide de caillots de Fibrine, limitant la dérive et permettant l’ajout et le lavage de réamen pendant l’imagerie en direct. Les échantillons sont transférés à une goutte de Fibrinogen contenant du milieu de culture à la surface d’un coverslip, après quoi la polymérisation est induite par l’ajout de thrombine.

Résumé

Drosophila est un système modèle important pour étudier un large éventail de questions biologiques. Divers organes et tissus de différents stades de développement de la mouche tels que les disques imaginaires, le cerveau larvaire ou les chambres d’oeufs des femelles adultes ou de l’intestin adulte peuvent être extraits et conservés en culture pour l’imagerie par microscopie en accéléré, fournissant des informations précieuses sur la biologie cellulaire et développementale. Ici, nous décrivons en détail notre protocole actuel pour la dissection des cerveaux larvaire de Drosophila, puis présentons notre approche actuelle pour immobiliser et orienter les cerveaux larvaire et d’autres tissus sur un coverslip en verre utilisant des caillots de Fibrine. Cette méthode d’immobilisation ne nécessite que l’ajout de Fibrinogen et Thrombin au milieu culturel. Il convient à l’imagerie par laps de temps à haute résolution sur les microscopes inversés de plusieurs échantillons dans le même plat de culture, minimise la dérive latérale fréquemment causée par les mouvements de l’étape du microscope dans la microscopie de visite à plusieurs points et permet l’ajout et l’enlèvement des réaccènements au cours de l’imagerie. Nous présentons également des macros sur mesure que nous utilisons régulièrement pour corriger la dérive et extraire et traiter des informations quantitatives spécifiques à partir d’analyses time-lapse.

Introduction

Drosophila continue d’être un système modèle important pour étudier un large éventail de questions biologiques et a excellé dans l’avancement des connaissances dans de nombreuses disciplines pendant des décennies. Une caractéristique qui le rend particulièrement remarquable est qu’il est particulièrement bien adapté pour l’imagerie en direct. La capacité de surveiller les processus subcellulaires ou le comportement des cellules et des tissus en temps réel continue de contribuer à générer des concepts clés pertinents à la biologie cellulaire et développementale. De nombreux protocoles réussis ont été développés par différents groupes pour maintenir ces échantillons de Drosophila vivants et sains pour étudier le comportement du spécimen et des molécules fluorescentes vivantes. Les organes et tissus de la mouche tels que les disques imaginaires^1,2,le cerveau larvaire 3 ,^4,5,6,oules chambres d’oeufs des femelles adultes^7,8,9, ou l’intestin adulte¹⁰ par exemple peuvent être extraits et conservés en culture pour l’imagerie avec microscopie time-lapse. L’un des principaux défis de l’imagerie en direct consiste à s’assurer que l’échantillon est maintenu près de la surface de l’imagerie pour une résolution optimale et immobile sans compromettre l’intégrité de l’échantillon qui peut être sensible aux impacts mécaniques. Pour étudier les cellules souches neurales, appelées neuroblastes ou neurones dans le cerveau larvaire de Drosophila, par exemple, il est possible de garder des échantillons près de la surface de l’imagerie en les couvrant de médias de culture dans des chambres d’imagerie^{scellées 11,12,13}. Toutefois, cette approche ne permet pas facilement l’échange de médias limitant ainsi la marge de manœuvre expérimentale. Alternativement, des échantillons peuvent être préparés et placés sur des coverslips traités pour augmenter l’adhérence des cellules et permettre la microscopie de visite multi-point et l’imagerie étendue de cellules vivantes dans les plats ouverts de culture, qui permettent potentiellement l’échange de médias, mais ne fournissent pas des moyens faciles pour empêcher la dérive ou la perte^{d’échantillon pendant l’échange de médias 14,15.}

La méthode du caillot de Fibrin initialement développée pour étudier la méiose chez les spermatocytes^{vivants à mouches-grues 16} est spécifiquement adaptée pour surmonter ces problèmes. Fibrinogen est dissous dans le milieu de culture pertinent, les échantillons placés et orientés dans une goutte de cette solution sur une chambre d’imagerie de surface de verre adéquate avant Thrombin est ajouté, résultant en la formation rapide d’un caillot fibrin insoluble, un maillage fibreux collant qui adhère à la surface du verre et les échantillons tout en assurant l’accès de l’échantillon au milieu de culture. Le milieu peut ensuite être échangé sans perturber la position du caillot ou de l’échantillon. L’échange moyen de culture pendant l’imagerie est, par exemple, souhaitable lorsque des inhibiteurs doivent être ajoutés comme dans la méthode originale ou pour des expériences de lavage ou de chasse au pouls ou lorsque des colorants fluorescents doivent être ajoutés pendant l’imagerie cellulaire vivante tout en maintenant les cellules et les tissus en place. Les caillots de fibrine conviennent à l’imagerie des tissus de Drosophila aussi bien que des^{cellules individuelles 13,17.} Les caillots de fibrine peuvent en outre être utilisés pour aider à orienter les échantillons, qu’en raison de leur forme ou d’autres propriétés ne seraient normalement pas orientées de la manière désirée en modulant la position de l’échantillon dans le caillot de Fibrine et la forme du caillot lui-même.

Ici, nous fournissons une mise à jour sur nos méthodes actuelles d’imagerie à base de caillots fibrine et fournissons des outils pour l’analyse d’image basée sur la segmentation et nous nous concentrons sur l’utilisation de cette méthode pour étudier les divisions neuroblastiques dans le cerveau volant en développement. Nous utilisons régulièrement la méthode du caillot de Fibrine pour suivre plusieurs échantillons dans différents caillots dans le même plat de culture. Cela permet i) l’imagerie d’événements subcellulaires tels que le comportement centrosome ou la localisation de l’ARNm^{en direct 18,19}, ii) la surveillance du comportement des échantillons sur le traitement pharmacologique de différents génotypes dans les mêmes paramètres d’imagerie en utilisant la visite à plusieurs points microscopie²⁰, iii) étudiant les effets de l’inhibition aiguë des enzymes²¹ et iv) minimisant la dérive pour étudier les changements dans l’orientation de la division cellulaire des cellules dans leur environnement physiologique lors de l’ablation laser ciblée²². Bien que les effets indésirables de thrombine et de fibrinogen et du caillot de Fibrine doivent être testés empiriquement pour chaque échantillon, cette méthode est en principe appropriée pour immobiliser n’importe quel type d’échantillon qui doit être analysé par imagerie cellulaire vivante et dans Drosophila a été avec succès utilisé pour étudier de multiples aspects de la biologie des neuroblastes^5,19,20, mais aussi la dynamique des projections cytosensor des cellules souches femelles lignée germinale^{23 et} les changements de polarité sur l’inhibition aiguë aPKC des cellules follicules des chambres d’oeufs femelles Drosophila ²¹.

L’imagerie fluorescente en accéléré entraîne la génération d’ensembles de données 3D complexes résolus dans le temps qui nécessitent des méthodes pour extraire ces informations quantitatives. Ici, nous décrivons notre développement ultérieur de²⁴ macros basées sur l’ImageJ qui peuvent être utilisées pour corriger la dérive dans les hyperstacks et les macros ImageJ sur mesure qui permettent la quantification semi-automatisée de la fluorescence multicanal au cortex cellulaire développé pour quantifier les protéines corticales dans les neuroblastes des cerveaux larvaire de Drosophila ou des neuroblastes individuels dans la culture cellulaire primaire.

Protocole

1. Préparation des reagents

REMARQUE : Toutes les étapes de ce protocole, sauf indication contraire, sont effectuées à température ambiante.

1. Pour préparer une solution de 1x PBS-BSA (0,1% w/v), dissoudre 1 mg d’albumine de sérum bovin (BSA) dans 1 mL de PBS. Pour préparer une solution de stock de Thrombin 1.000 unités·mL^-1, dissoudre 1.000 unités de Thrombin dans 1 mL de PBS-BSA (0.1% w/v). Faire des aliquots de 10 μL et les conserver à -20 °C jusqu’à 4 mois.
2. Pour préparer le milieu de culture pour les cerveaux de Drosophila, dissoudre 1 g de glucose dans 1 L du milieu de Schneider dans des conditions stériles. Filtrer et conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
3. Pour préparer la solution Fibrinogen, dissoudre 10 mg de Fibrinogen dans 1 mL de culture moyenne pendant 20 min à température ambiante ou 5 min à 37 °C.
   REMARQUE : Si un milieu de culture différent de celui préparé à l’étape 1.2 est utilisé et que des caillots fibrins se forment déjà à cette étape, le milieu de culture contient probablement de la thrombine active, qui doit être inactivée à l’avance. Une source probable de Thrombin est le sérum bovin fœtal, qui peut être inactivé en chauffant le sérum à 56 °C pendant 30 min.
4. Pour préparer une solution de revêtement de PBS-BSA (5% w/v), dissoudre 50 mg d’albumine bovine de sérum (BSA) dans 1 mL de 1x PBS.
5. Par exemple, le réagencé utilisé à l’étape 4, préparer une solution de stock de 10 mM NAPP1 en dissolvant 1 mg de NAPP1 dans 315 μL de sulfure de diméthyle.

2. Dissection des cerveaux larvaire de Drosophila

REMARQUE : Effectuez cette étape sous une jumelle de dissection.

1. Utilisez une brosse pour transférer les larves de L3 dans un plat en verre borosilicate de 9 puits contenant du PBS. Remuer pour détacher la plupart des aliments à la mouche des larves et les transférer dans un autre puits contenant un milieu de culture.
2. Utilisez des forceps (p. ex., Dumont #55) pour saisir une larve sur tout son diamètre, au milieu de sa longueur corporelle (voir la figure 1A,B). Tout en tenant la larve, transférez-la dans un autre puits de la plaque de borosilicate contenant 200 μL de milieu de culture frais.
3. Ne relâchez pas la larve. Pour couper la larve en deux sur l’ensemble de son diamètre (figure 1B), soit broyer la zone saisie avec le mouvement latéral des pointes de forceps(figure 1A, panneau supérieur) ou glisser une pointe d’une autre paire de forceps entre les deux pointes de force tenant la larve (Figure 1A, panneau inférieur). Ne coupez pas la larve en deux en tirant sur l’une de ses extrémités, car elle pourrait endommager le cerveau en tirant dessus par les nerfs traversant la longueur du corps (lignes rouges dans la figure 1B).
4. Utilisez des forceps pour tenir la larve par sa cuticule et une autre paire de forceps pour peler la cuticule sans tirer sur le cerveau (Figure 1C). Répétez jusqu’à ce que les nerfs provenant du cerveau soient visibles et que les organes reliant le cerveau aux parties de la bouche puissent être consultés, comme le montre la figure 1D.
5. Utilisez des forceps pour retenir les nerfs provenant du cerveau. Avec l’autre paire de forceps, utilisez l’une ou l’autre des techniques indiquées dans la figure 1A pour couper la connexion entre le cerveau et les parties de la bouche, séparant le cerveau du reste de la cuticule (Figure 1D).
6. Utilisez des forceps pour tenir le cerveau par les axones sortant du cordon nerveux ventral. Arrachez les organes représentés en gris dans la figure 1E en les éloignant doucement du cerveau.
   REMARQUE : Ne tirez pas sur les disques imaginaires des yeux et des antennes (jaune foncé) pour les détacher du cerveau. La connexion entre ces tissus est trop robuste pour être brisée en tirant sans endommager le cerveau.
7. Tout en saisissant les nerfs pour tenir et orienter le cerveau, saisir la connexion entre les disques imaginaux oeil / antenne (jaune foncé) et le cerveau avec l’autre paire de forceps (Figure 1F). Utilisez l’une ou l’autre des techniques indiquées à la figure 1A pour couper cette connexion sans tirer sur le cerveau. Vérifiez si le cerveau est correctement dégagé des autres tissus (figure 1G) et non endommagé (Figure 1H). Jetez le cerveau s’il montre des signes de dommages.
8. Pipette la solution de revêtement avec un P20 dans et hors pour enrober la pointe pipette. Pipette le cerveau avec la pointe enduite avec 3 μL de milieu (Figure 2A ,gauche ) et pipette dans un autre puits contenant 200 μL de milieu de culture propre.
9. Répétez les étapes 2.2-2.8 jusqu’à ce que suffisamment de cerveaux soient disséqués, remplaçant occasionnellement le milieu de culture du puits dans lequel les dissections sont effectuées.

Figure 1 : Dissection du cerveau larvaire de D. melanogaster.  (A) Technique pour couper sans tirer à l’aide de forceps. L’échantillon (vert pâle) peut être coupé en étant broyé entre les extrémités des forceps (panneau supérieur) ou en exécutant une pointe d’une pointe de forceps le long des extrémités d’une paire de forceps tenant l’échantillon (panneau inférieur). (B-F) Étapes pour isoler le cerveau larvaire sans l’endommager (voir texte). Rouge: cerveau. Jaune foncé : disques d’oeil/antenne. Texte bleu : actions à effectuer avec les forceps correspondants. (G) Apparition d’un cerveau isolé sans dommages visibles. D est le côté dorsal et V est le côté ventral sur la vue latérale. (H) Dommages communs causés par la traction excessive du cerveau pendant la dissection. Panneau supérieur : décollement du cordon nerveux ventral. Panneau inférieur : déformation d’un lobe. Postérieur est à gauche et antérieur est juste dans tous les panneaux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Immobilisation sur coverslip avec caillots Fibrin

REMARQUE : Effectuez cette étape sous une jumelle de dissection.

1. Utilisez une pipette P20 avec une pointe enduite comme à l’étape 2.8 pour transférer les cerveaux disséqués dans un autre puits de la plaque de borosilicate contenant 200 μL de milieu de culture + Fibrinogen (Figure 2A).
2. Pipette dans un cerveau avec 9 μL de milieu de culture + Fibrinogen. Avec l’extrémité de la pointe presque toucher le fond de verre de couverture d’un plat de culture cellulaire de 35 mm, pipette sur le contenu (le milieu de la culture et le cerveau) ce qui rend le milieu de la culture toucher le coverslip immédiatement après la sortie de la pointe pipette de sorte que le cerveau et le milieu ne glissent pas sur les côtés de la pointe, potentiellement endommager le cerveau (Figure 2A).
3. Utilisez une pointe d’une paire de forceps ou une paire fermée de forceps pour pousser doucement et positionner le cerveau dans le milieu de la culture + Chute de Fibrinogen.
   REMARQUE : Toucher la goutte à l’aide d’une paire ouverte de forceps peut entraîner le fait que le milieu de la culture est tiré par capillarité entre les pointes des forceps(figure 2B).
4. Si la partie ventrale du cerveau doit être photographiée, induisez la coagulation de Fibrinogen comme suit pour orienter correctement le cerveau dans le caillot (figure 2C).
   1. Poussez le cerveau d’un côté de la chute. Avec une pipette P1 équipée d’une pointe P1, pipette 1 μL de solution Thrombin, toucher le bord de la chute de l’autre côté du cerveau avec la pointe pipette, et pipette sur la Thrombin (Figure 2C, premier dessin).
   2. Attendez 1-2 min pour que le Fibrinogen commence à polymériser, ce qui entraîne la formation d’un précipité nuageux d’un côté de la chute(figure 2C, deuxième dessin). Poussez doucement et « rentrez » le cerveau dans le caillot de Fibrine, en s’assurant que la partie à l’image (par exemple, le côté ventral) est aussi proche que possible de la couverture sans déformer le cerveau (Figure 2C, troisième dessin).
   3. Pipette sur 1 μL de solution Thrombin près du côté du cerveau non rentré dans le caillot de Fibrin. (Figure 2C, quatrième dessin).
   4. Attendez 2-3 min pour que le deuxième caillot de Fibrine se fixe(figure 2C, cinquième dessin). Appuyez sur les bords du caillot pour qu’il adhère plus fortement à la couverture, en prenant soin de ne pas déformer le cerveau(figure 2C,sixième et septième dessins). Si le cerveau semble être trop loin de la couverture, rapprochez-le en appuyant sur le caillot de Fibrine près du cerveau.
5. Si la partie dorsale du cerveau doit être image, induire la coagulation fibrine comme suit (Figure 2D).
   1. Placez le cerveau au centre de la chute, partie dorsale face à la couverture. Avec une pipette P10 équipée d’une pointe fine, pipette 1 μL de solution Thrombin, toucher le bord de la chute sur le côté opposé du cerveau avec la pointe pipette, et pipette sur la Thrombin (Figure 2D, premier dessin).
   2. Attendez 2-3 min pour que le Fibrinogen commence à polymériser, ce qui entraîne la formation d’un précipité nuageux et fibreux(figure 2D,deuxième dessin). Appuyez sur les bords du caillot pour le faire adhérer plus fortement à la couverture, en prenant soin de ne pas déformer le cerveau(Figure 2D, troisième et quatrième dessins).
6. Répétez les étapes 3.1-3.5 si plusieurs échantillons de caillots doivent être immobilisés sur le coverslip.
7. Avec l’extrémité de la pointe positionnée à environ 0,5 cm au-dessus du caillot(s), pipette doucement 390 μL de milieu de culture sans Fibrinogen dropwise sur le dessus du caillot(figure 2B, plat petri droit). N’ajoutez pas le milieu de culture sur les côtés du caillot car il peut le détacher du coverslip.
8. Pour laver le reste de la Thrombine, utilisez une pipette pour enlever 300 μl du milieu de culture et ajouter 300 μl de milieu de culture propre, en vous assurant que les caillots restent complètement immergés. Répéter deux fois pour laver l’excès de Thrombin.

Figure 2 : Immobilisation d’un cerveau larvaire de Drosophila à l’aide de caillots fibrins. (A) À l’aide d’une pointe pipette enduite de BSA, les cerveaux sont transférés du milieu de culture (jaune) dans un milieu de culture + solution fibrinogen (orange), puis pipetted sur le coverslip (bleu clair) d’un plat de culture avec 3,5 μL de milieu de culture + Fibrinogen. La coagulation de Fibrinogen est induite par l’ajout de Thrombin pour immobiliser les cerveaux en position dorsale ou ventrale (voir D et E). Les cerveaux sécurisés dans les caillots sont ensuite couverts dans le milieu de culture sans Fibrinogen et l’excès de thrombine est enlevé en ajoutant et en enlevant le milieu de culture trois fois. (B) La position du cerveau dans la chute du milieu de culture + Fibrinogen (orange) sur le coverslip ne doit être ajustée qu’en le poussant doucement avec le bout d’une paire fermée de forceps, ou une seule pointe de forceps. Toucher la goutte avec sur la paire ouverte de forceps peut entraîner le milieu de la culture se tirer par capillarité entre les extrémités des forceps. (C) Étapes pour positionner le cerveau larvaire pour l’imagerie du côté ventral (voir texte). (D) Étapes pour positionner le cerveau larvaire pour l’imagerie du côté dorsal (voir texte). En (D) et (E), vert: Thrombin. Orange foncé : caillot de Fibrine. Bleu pâle : coverslip. Flèches bleues : bords du caillot à pousser contre le coverslip pour stabiliser le caillot. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Ajout de reagents lors de l’imagerie en direct

1. Pour éviter les changements de température provoquant des changements de concentration, gardez la solution avec les réaccents à ajouter au plat de culture à la même température que le plat de culture lui-même pour l’amener à la même température avant de l’ajouter. Si une chambre de l’environnement est utilisée, laissez la solution au sein de la Chambre.
2. Retirer le couvercle du plat de culture sans déplacer le plat de culture lui-même. Pour faciliter l’enlèvement, placez le couvercle du plat de 35 mm à l’envers sur le plat avant l’imagerie.
3. À l’aide d’une pipette P1000, placez la pointe de la pipette près de la surface du milieu de culture à l’intérieur du plat de culture et relâchez doucement le volume adéquat de solution de réacomptation sur elle pour atteindre la concentration de réagent désirée (p. ex., 400 μL d’une solution de 20 μM NAPP1 sur 400 μL de milieu de culture pour une concentration finale de 10 μM NAPP1) , sans générer de flux forts qui pourraient détacher les caillots.
4. Pour homogénéiser la solution dans le plat de culture, utilisez une pipette P200 pour pipette lentement une petite quantité de la solution dans et hors cinq fois (par exemple, 150 μL pour un volume de 800 μL dans le plat).
5. Remplacez le couvercle sur le plat de culture sans déplacer le plat de culture lui-même et reprendre l’imagerie.

5. Lavage des reagents pendant l’imagerie en direct

1. Avant le lavage, gardez la solution de lavage à la même température que le plat de culture.
2. Retirer le couvercle du plat de culture sans déplacer le plat de culture lui-même.
3. À l’aide d’une pipette P200 ou P1000, retirez lentement un milieu de culture du plat de culture sans exposer le haut du caillot (p. ex., retirer 600 μL de 800 μL de milieu de culture dans le plat).
4. Pour diluer le reagent, avec une pipette P1000, placez la pointe de pipette près de la surface du milieu de culture à l’intérieur du plat de culture et relâchez lentement la solution de lavage (p. ex., ajoutez 1 mL de solution de lavage au milieu de culture de 200 μL laissé dans le plat pour un facteur de dilution de 6).
5. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 jusqu’à ce que le reagent soit dilué au besoin (p. ex., trois autres cycles similaires entraîneront un facteur de dilution de 1 296, ce qui réduira la concentration initiale de 10 μM NAPP1 à 7,7 nM).
6. Remplacez le couvercle sur le plat de culture sans déplacer le plat de culture lui-même et reprendre l’imagerie.

6. Correction du xyz dérivant sur des time-lapses tridimensionnels et/ou multicanaux

1. préparation
   1. Télécharger et installer ImageJ²⁴. Téléchargez les plugins TurboReg²⁵ et MultiStackReg²⁶ et placez-les dans le dossier plugins d’ImageJ.
   2. Téléchargez les macros MultiHyperStackReg (Supplemental coding file 1) et AutoHyperStackReg ImageJ macros (Supplemental coding file 2). Pour installer une macro, placez le fichier .ijm à l’intérieur du dossier plugins d’ImageJ ou ajoutez le contenu du fichier .ijm au fichier ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
   3. Sur ImageJ, ouvrez un film en accéléré comprenant plusieurs tranches et/ou plusieurs canaux (désormais appelés « hyperstack », figure 3A,4A). Si le laps de temps ne comprend qu’une tranche et un canal, l’alignement peut être effectué directement à l’aide de MultiStackReg.
2. Correction de la dérive latérale à l’aide de MultiHyperStackReg
   1. Décidez quel canal et/ou tranche de l’hyperstack doit être utilisé comme référence pour l’alignement. Pour générer une pile de référence d’un canal et d’une tranche (désormais appelée « pile de référence »), cliquez sur Image | Dupliquer..., cocher la case à cocher hyperstack duplicate, taper le numéro de canal pertinent dans Canaux (c): (par exemple, remplacer 1-2 par 1) et/ou le numéro de canal pertinent dans Slices (z): (par exemple, remplacer 1-15 par 8),et s’assurer que frames: (t) inclut tous les cadres (p. ex., 1-50) avant de cliquer sur OK (Figure 3B).
   2. Alternativement à l’étape 6.2.1, si une projection de plusieurs tranches est préférée pour la pile de référence d’un canal et d’une tranche, cliquez sur Image | Piles | Z Project..., sélectionnez les première et dernière tranches et le type de projection, assurez-vous que tous les délais sont cochés et cliquez sur OK. Si le time-lapse a plusieurs canaux soit supprimer les canaux non pertinents (Image | Piles | Supprimer Slice) de la projection résultante ou dupliquer le canal de référence choisi(Image | Duplicata)( Figure 3B).
   3. En option, recadrer la pile de référence pour n’utiliser qu’une seule partie comme référence en sélectionnant l’outil rectangle dans la barre d’outils, en traçant un rectangle sur la région d’intérêt et en cliquant sur Image | Culture.
   4. Pour démarrer MultiStackReg, cliquez sur Plugins | Inscription | MultiStackReg. Dans le menu pop-up Stack 1 :, sélectionnez le nom de la pile d’une seule chaîne et d’une tranche générée dans les étapes précédentes. Dans le menu pop-up Transformation:, sélectionnez Traduction; cochez la case à cocher Enregistrer la transformation du fichier et ignorez tous les autres champs.
      REMARQUE : Autres types de transformation (voir²⁵).
   5. Cliquez sur OK. Sélectionnez un emplacement et un nom pour enregistrer le fichier d’alignement et cliquez sur Enregistrer. Sur la fenêtre de la pile de référence, attendez que les cadres cessent de bouger automatiquement, indiquant que l’enregistrement est terminé (Figure 3B).
   6. Vérifiez sur la pile de référence pour voir si l’alignement est satisfaisant. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes 6.2.1-6.2.5 avec une tranche de référence, un canal et/ou un recadrage différents. Fermez la pile de référence.
   7. Sélectionnez la fenêtre hyperstack et exécutez la macro MultiHyperStackReg. Sélectionnez le fichier de transformation créé à l’étape 6.2.5 et cliquez sur Ouvrir. Attendez que l’alignement soit appliqué à chaque canal et/ou tranche de l’hyperstack, à quel point une nouvelle fenêtre avec le suffixe « _aligned » s’ouvrira(figure 3C).
3. Correction de la dérive de mise au point à l’aide de MultiHyperStackReg
   1. Cliquez sur Image | Propriétés..., copiez la valeur affichée dans Pixel Width. Pour reslice orthogonally l’hyperstack d’un canal avec un espacement d’un pixel, cliquez sur Image | Piles | Reslice [/]..., coller la valeur de largeur des pixels dans l’espacement de sortie: champ numérique; sélectionnez Top in the Start At: popup menu, tick Avoid Interpolation et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Dans le cas où la mémoire doit être libérée sur ImageJ, l’hyperstack peut être fermée après le reslice.
   2. Sélectionnez la nouvelle fenêtre générée par le reslice (désormais appelée « hyperstack resliced », figure 4B). Si l’hyperstack resliced a plusieurs canaux, sélectionnez un canal de référence pour effectuer l’alignement et supprimer les autres canaux en les sélectionnant dans la barre de défilement du canal; cliquez sur Image | Piles | Supprimer Slice, sélectionnez Canal dans le menu supprimer popup courant et cliquez sur OK.
   3. Générer une hyperstack reslicée à tranche unique (désormais appelée « pile de référence reslicée »), soit en dupliquant une seule tranche de l’hyperstack resliced (voir l’étape 6.2.1) soit en projetant plusieurs tranches de l’hyperstack resliced (voir l’étape 6.2.2) (figure 4C).
   4. En option, recadrer la pile de référence resliced pour n’utiliser qu’une seule partie comme référence (voir l’étape 6.2.3).
   5. Effectuez l’enregistrement d’image sur la pile de référence resliced avec MutiStackReg (voir les étapes 6.2.4-6.2.6) (Figure 4C).
   6. Sélectionnez la fenêtre hyperstack resliced et exécutez la macro MultiHyperStackReg. Sélectionnez le fichier de transformation créé à l’étape 6.3.5, cliquez sur Ouvrir et attendez que l’alignement soit appliqué à chaque canal et/ou tranche de l’hyperstack, à partir duquel une nouvelle fenêtre avec le suffixe « _aligned » s’ouvrira (désormais appelée « pile de référence resliced », figure 4D). Fermez l’hyperstack resliced original.
   7. Pour convertir l’hyperstack aligné resliced à la vue xy de l’hyperstack d’origine, cliquez sur Stacks | Reslice [/]..., sélectionnez Top in the Start At: popup menu, tick Avoid Interpolation et cliquez sur OK. Une fois qu’une nouvelle fenêtre avec l’hyperstack fin harmonisé s’ouvre (Figure 4E), fermez l’hyperstack aligné resliced.
4. Pour corriger automatiquement la dérive latérale et la dérive de mise au point, exécutez la macro AutoHyperStackReg. Sélectionnez le canal de référence, le cas échéant, et s’il doit corriger la dérive latérale et/ou de mise au point. Cliquez sur OK.

Figure 3 : Pipeline pour la correction de la dérive latérale avec MultiHyperstackReg. (A) Des dérives latérales et de mise au point peuvent être observées sur une hyperstack contenant plusieurs tranches et points de temps. (B) Une seule tranche, pile de référence de canal unique est généré à partir de l’hyperstack, soit par duplication ou projection Z. La pile de référence est alignée par le plugin MultiStackReg, générant un fichier d’alignement. (C) La macro MultiHyperstackReg est utilisée pour appliquer le fichier d’alignement sur l’hyperstack, résultant en une hyperstack alignée pour laquelle la dérive latérale est corrigée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Pipeline pour la correction de la dérive de mise au point avec MultiHyperstackReg. (A) Des dérives de mise au point peuvent être observées sur une hyperstack contenant plusieurs tranches et points de temps. (B) L’hyperstack est orthogonally resliced du haut, le long de chaque ligne de pixels le long de l’axe Y, sans interpolation. Il en résulte une hyperstack resliced contenant les mêmes informations que l’hyperstack, avec ses coordonnées y et z commutées. La dérive de mise au point (en z) de l’hyperstack d’origine se produit comme une dérive en y sur l’hyperstack resliced. (C) Une seule tranche, pile de référence resliced canal unique est généré à partir de l’hyperstack resliced, soit par duplication ou projection Z. La pile de référence resliced est alignée par le plugin MultiStackReg, générant un fichier d’alignement. (D) La macro MultiHyperstackReg est utilisée pour appliquer le fichier d’alignement sur l’hyperstack resliced, résultant en une hyperstack resliced alignée pour laquelle la dérive de mise au point (en y) est corrigée. (E) Un deuxième reslice orthogonal restaure les coordonnées d’origine de l’hyperstack, qui ne présente plus de dérive de mise au point (en z). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

7. Mesure corticale de signal avec des linescans rotatifs

1. Télécharger la macro Rotating Linescans ImageJ(Fichier de codage supplémentaire 3).
2. Ouvrez un time-lapse dans ImageJ. Placez la barre de défilement des cadres sur le premier cadre et, au cas où le laps de temps contient plusieurs tranches, placez la barre de défilement des tranches à la tranche sur laquelle le signal sera mesuré.
3. Mode de suivi
   1. Sélectionnez l’outil en ligne droite dans la barre d’outils. Tracez une ligne à travers la zone corticale à mesurer (Figure 5A), en s’assurant que la ligne est à peu près perpendiculaire au cortex et que la ligne est assez longue pour traverser le cortex à chaque point de temps suivant (figure 5B, premier et deuxième panneau).
   2. Cliquez deux fois sur l’icône de l’outil de ligne dans la barre d’outils pour ouvrir la fenêtre Largeur de ligne. Augmentez la largeur de la ligne autant que nécessaire tout en gardant l’intersection entre la ligne et le cortex une ligne droite (figure 5B, troisième panneau).
   3. Démarrez la macro Rotating Linescans. Réglez la plage de rotation (figure 5E) à une faible valeur (environ 10°) si l’orientation de la zone corticale à mesurer ne change pas beaucoup d’un point de temps à l’autre. Réglez la mesure autour de la valeur à 0 pixels pour mesurer uniquement le signal sur la ligne où l’intensité maximale du signal est détectée, ou vers des valeurs plus élevées pour mesurer également le signal autour de cette ligne.
      REMARQUE : La mesure autour de la valeur n’affectera la mesure du signal qu’après la détection du cortex et n’affectera pas la détection elle-même.
   4. Sur le menu Find Cortex on Channel: popup, sélectionnez le canal sur lequel la détection sera effectuée. Pour visualiser l’endroit où le cortex a été détecté à chaque point de temps, maintenez la position d’affichage... case à cocher cochée (recommandée). Gardez le Recenter et réorienter... la case à cocher cochée. Cliquez sur OK.
   5. Une fois le fait, les résultats copiés à l’état clipboard est affiché dans l’état de la fenêtre ImageJ, faites défiler le laps de temps pour vérifier si les positions du cortex détecté (superposition jaune) et la zone mesurée (superposition cyan) sont satisfaisantes. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes 7.3.1-7.3.4 avec une position, une longueur ou une largeur de ligne différente et différents paramètres dans la fenêtre d’options Rotating Linescans.
   6. Coller les mesures dans un logiciel de feuille de calcul.
      REMARQUE : Les colonnes correspondent à des canaux dans l’ordre de leur apparition dans le laps de temps et les lignes correspondent à des cadres.
4. Mode non-suivi
   1. Sélectionnez l’outil en ligne droite dans la barre d’outils. Tracez une ligne (indiquée en cyan, figure 5A)à travers la zone corticale à mesurer, en s’assurant que la ligne est à peu près perpendiculaire au cortex et que la ligne est assez longue pour traverser le cortex à chaque point de temps (figure 5C, premier et deuxième panneau).
   2. Double-cliquez sur l’icône de l’outil de ligne dans la barre d’outils pour ouvrir la fenêtre Largeur de ligne. Augmenter la largeur de la ligne autant que nécessaire tout en gardant l’intersection entre la ligne et le cortex une ligne droite (Figure 5C, troisième panneau).
   3. Démarrez la macro Rotating Linescans. Définissez la plage de rotation (figure 5E) en conséquence des changements d’orientation de la zone corticale à mesurer sur l’ensemble du laps de temps. Réglez la mesure autour de la valeur à 0 pixels pour mesurer uniquement le signal sur la ligne où l’intensité maximale du signal est détectée, ou vers des valeurs plus élevées pour mesurer également le signal autour de cette ligne.
      REMARQUE : La mesure autour de la valeur n’affectera la mesure du signal qu’après la détection du cortex et n’affectera pas la détection elle-même.
   4. Sur le menu Find Cortex on Channel: popup, sélectionnez le canal sur lequel la détection sera effectuée. Pour visualiser l’endroit où le cortex a été détecté à chaque point de temps, gardez les positions d’affichage... cochées (recommandées). Untick the Recenter and Reorient... case à cocher. Cliquez sur OK.
5. Une fois terminés, les résultats copiés sur le presse-papiers sont affichés dans l’état de la fenêtre ImageJ, défilent dans le laps de temps pour vérifier si les positions du cortex détecté (superposition jaune) et la zone mesurée (superposition cyan) sont satisfaisantes. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes précédentes avec une position, une longueur ou une largeur de ligne différente et différents paramètres dans la fenêtre d’options Rotating Linescans.
6. Coller les mesures dans un logiciel de feuille de calcul.
   REMARQUE : Les colonnes correspondent à des canaux dans l’ordre de leur apparition dans le laps de temps et les lignes correspondent à des cadres.

Figure 5 : Mesure du signal cortical avec linescan rotatif. (A) Une ligne (cyan) est tracée perpendiculairement au cortex (noir) où le signal sera mesuré. Différentes nuances de gris montrent la position de la cellule changeant sur trois points de temps (t1, t2, t3). (B) Gauche : positionnement correct de la ligne en mode de suivi. Milieu : positionnement incorrect de la ligne en mode de suivi car il n’y a pas de chevauchement avec le cortex au point de temps suivant. Droite : ligne trop large, ce qui fait que l’intersection (ligne orange) entre le cortex et la ligne n’est pas droite. (C) Gauche : positionnement correct de la ligne en mode non-suivi. Milieu : positionnement incorrect de la ligne en mode non-suivi car il n’y a pas de chevauchement avec le cortex à chaque point de temps. Droite : ligne trop large, ce qui fait que l’intersection (ligne orange) entre le cortex et la ligne n’est pas droite. (D) Longueur et largeur de la ligne de balayage. (E) Les linescans sont exécutés dans une gamme d’orientations autour de l’orientation originale indiquée dans (D) définie par le paramètre « plage de rotation », à un intervalle défini par le paramètre « étape de rotation ». (F) Orientation non optimale de la ligne de balayage par rapport au cortex, résultant en un signal faible mesuré le long de la ligne. (G) L’orientation optimale de la ligne est définie comme celle qui entraîne le pic le plus élevé d’intensité du signal mesuré le long de la ligne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Résultats

Immobilisation des tissus de Drosophila avec des caillots fibrins et échange moyen de culture pendant l’imagerie vivante.
Après avoir été disséqués à la suite de la procédure présentée àl’étape 2( figure 1 ) et immobilisés dans des caillots fibrins sur le même coverslip suivant la procédure présentée à l’étape 3 (figure 2), les cerveaux larvaire exprimant bazooka marqué GFP (Baz::GFP), l’orthologue volant de la protéine de polarité Par-3, ont été photographiés pendant 30 min dans l’imagerie confocale multi-position time-lapse. Baz::GFP est combiné avec apkc^as4, un allèle qui permet l’inhibition aiguë de la protéine atypique kinase C (aPKC) grâce à l’ajout de la petite ATP analogique 1-NAPP1²⁰. 1-NAPP1 a donc été ajouté au milieu culturel suivant la procédure présentée à l’étape 4 et l’imagerie en direct a été reprise pendant 2,5 h. Les cerveaux de contrôle portant une version sauvage de la kinase aPKC n’ont pas réagi à l’analogue ATP, tandis que les cerveaux portant en outre une mutation analogue-sensible de l’aPKC (apkc^as4) ont montré une contraction du neuroepithelium et des amas lumineux de Baz dans les neuroblastes et leur progéniture ( figure6, vidéo 1). Les neuroblastes continuent de se diviser tout au long du laps de temps, ce qui indique que le tissu reste sain, et les cerveaux montrent peu de dérive malgré le changement moyen de culture, ce qui indique qu’ils sont bien immobilisés. De même, après avoir été disséqués à la suite de^{la procédure présentée en 27}, ovarioles exprimant Baz::GFP ont été immobilisés dans des caillots de Fibrine sur le même coverslip et photographié pendant 8 min, après quoi l’application de 1-NAPP1 induit la contraction des cellules folliculaires mutantes apkc^as4 mais pas des contrôles (Figure 7, Vidéo 2).

Correction de la dérive latérale et de mise au point à l’aide de MultiHyperstackReg.
Une hyperstack affichant à la fois la dérive latérale et focale(vidéo 3, panneau gauche) a d’abord été corrigée pour la dérive latérale (étape 6.2, figure 3, vidéo 3, panneau central), puis la dérive de mise au point (étape 6.3, figure 4, vidéo 3, panneau droit) à l’aide du plugin MultiStackReg et de la macro MultiHyperstackReg, ce qui a entraîné une réduction substantielle des mouvements observés dans l’hyperstack d’origine.

Mesure corticale de signal utilisant des linescans rotatifs
Un neuroblast exprimant Baz::GFP (vert) et la protéine transmembrane CD4 marquée avec une protéine fluorescente infrarouge (CD4::mIFP, rouge) a été photographié au cours d’une mitose. Le signal CD4::mIFP a été utilisé comme référence pour détecter le cortex à différentes parties du neuroblaste avec des linescans (étape 7, figure 5, figure 8A-C)et le signal Baz::GFP a été mesuré aux positions détectées Figure 8D). Au cours de leur division, les neuroblastes se polarisent transitoirement en établissant des domaines corticals distincts et opposés : le pôle apical et le pôle basal. Baz définit le pôle apical et, de façon constante, le signal Baz::GFP a augmenté au pôle apical du neuroblaste et a diminué au pôle basal pendant la division (figure 8C,D). La position du cortex a été suivie de façon satisfaisante tout au long du laps de temps (Figure 8C, Vidéo 4). Les lignées et génotypes de Drosophila sont référencés dans le tableau supplémentaire 1-2.

Figure 6 : Application d’un analogue atp sur les cerveaux larvaire immobilisés pendant l’imagerie en direct. (A) Imagerie en direct de deux cerveaux larvaire exprimant Baz::GFP immobilisé sur le même coverslip. Le milieu de culture est changé en une concentration de 10 μM de l’ATP analogique 1-NAPP1 à 0 min. Les cerveaux de contrôle ne réagissent pas visiblement à l’analogique ATP tandis que les cerveaux porteurs d’une mutation analogique sensible de l’aPKC (aPKC^AS4) affichent une contraction du neuroepithelium (pointes de flèche) et des amas lumineux de Baz dans les neuroblastes et leur progéniture. Projection d’intensité maximale de 33 tranches pour une profondeur de 23 μM. Barre d’échelle : 20 μM. (B) Grossissement du neuroepithelium. Barre d’échelle : 10 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Application d’un analogue ATP sur les chambres d’œufs immobilisées pendant l’imagerie en direct. Imagerie en direct de deux ovarioles exprimant Baz::GFP immobilisé sur le même coverslip. Le milieu de culture est changé en une concentration de 10 μM de l’ATP analogique 1-NAPP1 à 0 min. Les chambres d’oeufs de contrôle ne réagissent pas visiblement à l’analogue d’ATP tandis que les chambres d’oeuf portant une mutation sensible analogique d’aPKC (aPKC^AS4)affichent une contraction de l’épithélium (pointes de flèche) menant par la suite à la panne apparente des jonctions d’adhérents. Projection d’intensité maximale de 33 tranches pour une profondeur de 27 μM. Barre d’échelle : 20 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Mesure du signal cortical à l’aide de cannes rotatives. (A) Neuroblaste live D. melanogaster exprimant Baz::GFP (vert) et CD4::mIFP (rouge). Lignes de Cyan : lignes de balayage initiales tracées perpendiculairement à diverses zones corticales à mesurer. Barre d’échelle : 5 μM. (B) Identification du cortex (ligne bleue foncée) à l’aide de linescans corticales et de CD4::mIFP (rouge) comme canal de référence. Ligne cyan : zone définie par le paramètre « Mesurer autour » (ici, 2 pixels), où le signal est mesuré après la détection du cortex. Barre d’échelle : 2 μm. (C) Cyan : zones corticales identifiées au cours d’une division de neuroblaste par la méthode des linescans rotatifs à partir des lignes de balayage initiales affichées dans (A), en utilisant CD4::mIFP (rouge) comme canal de référence. Barre d’échelle : 5 μM. Flèche : pôle apical. Pointe de flèche : poteau basal. (D) Mesure de l’intensité du signal Baz::GFP au fil du temps dans les deux zones correspondantes identifiées par les linescans rotatifs affichés dans (C). Pendant la mitose, Baz::GFP s’enrichit transitoirement au pôle apical du neuroblaste et est épuisé du pôle basal opposé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1 : Application de l’échange de médias sur les cerveaux larvaire immobilisés pendant l’imagerie en direct pour ajouter un inhibiteur, présenté à la figure 6, barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Application de l’échange de médias sur les chambres d’œufs immobilisées pendant l’imagerie en direct pour ajouter un inhibiteur, présentée à la figure 7, barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Correction de la dérive latérale et de mise au point à l’aide de MultiHyperStackReg. Imagerie en direct d’un neuroblaste exprimant la sonde membranaire PH::GFP. Xy: plan focal unique. Xz: reslice orthogonal. Gauche : avant correction de la dérive. Milieu : après correction de la dérive latérale. Droite : après correction de la dérive latérale et de mise au point, barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Détection du cortex à l’aide de cliquables rotatifs, présentée à la figure 8, barre d’échelle : 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau supplémentaire 1 : Génotypes de tissus drosophiles photographiés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.

Tableau supplémentaire 2 : Origine des transgènes utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.

Fichier de codage supplémentaire 1: Origine des transgènes utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2: Origine des transgènes utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 3: Origine des transgènes utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’imagerie en direct de cerveaux larvaires entiers du mont D. melanogaster offre l’occasion d’observer les divisions asymétriques des cellules souches neurales dans des conditions proches d’un contexte physiologique. La première partie de notre protocole introduit notre approche sur la dissection des cerveaux larvaire. Comme déjà indiqué¹³, un aspect critique de la préparation est d’éviter d’endommager le cerveau. L’aspect le plus difficile de ceci est de séparer le cerveau des disques imaginaux voisins sans tirer excessivement sur le cerveau. Notre approche de la « coupe sans traction » consiste soit à effectuer un mouvement de broyage avec les extrémités d’une paire de forceps, soit à glisser un bout de forceps le long de deux autres pointes de forceps tenant la connexion entre les tissus (figure 1A) tandis que Lerit et coll. décrivent des mouvements de scie avec une goupille disséquante. Nous conseillons à l’expérimentateur d’essayer toutes les approches et d’adopter la meilleure pour eux-mêmes. Nous suggérons également d’utiliser des pointes de pipette enduites de BSA ou de FCS plutôt que des outils de dissection pour transférer des cerveaux isolés. Le revêtement empêche les tissus de coller au plastique et permet le transfert sûr des tissus tout en les gardant toujours complètement immergés, sans les soumettre à une déformation transitoire possible car ils collent à l’outil de dissection pendant le transfert. Les pointes enduites ont d’autres avantages pour permettre le transfert de plusieurs cerveaux à la fois, ce qui est particulièrement utile lorsqu’il est essentiel de contrôler le temps de résidence des échantillons dans un milieu particulier; ils conviennent au transfert d’autres tissus, même fragiles comme, par exemple, les graisses; ils peuvent accueillir un large éventail de différentes tailles d’échantillon en utilisant de plus grands bouts ou en coupant l’extrémité de la pointe.

Ensuite, ce protocole décrit l’utilisation de la coagulation de Fibrinogen pour immobiliser les cerveaux larvaire sur le coverslip d’un plat de culture. Un cerveau est orienté dans une goutte de milieu de culture + Fibrinogen, après quoi la coagulation est induite par l’ajout de Thrombin. La formation de fibrine est graduelle, fournissant une fenêtre de temps au cours de laquelle l’orientation de l’échantillon peut être affinée, si nécessaire (Figure 2C). Si une légère compression de l’échantillon est nécessaire - ce que nous déconseillons dans le cas des cerveaux larvaire - elle peut également être finement ajustée en appuyant sur le caillot plus ou moins près de l’échantillon pendant les étapes 3.4.4 et 3.5.2. Le principal avantage de cette coagulation fibrinogen par rapport au protocole décrit dans Lerit et coll., dans lequel les cerveaux sont montés entre une membrane perméable au gaz et un coverslip, est la capacité de remplacer le milieu de culture pendant l’imagerie en direct. Un avantage possible de l’utilisation d’une membrane perméable au gaz sur notre protocole pourrait être qu’il fournit une oxygénation optimale des échantillons, qui pourrait être plus limitée avec notre approche que les cerveaux sont séparés de l’air par le caillot et un certain milieu. Pour cette raison, bien que nous n’avons pas évalué l’effet de la quantité de milieu de culture dans le plat de culture, nous suggérons de limiter la quantité de milieu de culture sur le dessus des caillots tout en gardant les caillots complètement immergés.

Comme la manipulation des caillots peut être expérimentalement difficile et longue, nous recommandons que l’expérimentateur pratique d’abord la manipulation des caillots sans échantillons. Moduler le volume de la baisse du milieu de culture + Fibrinogen sur le coverslip, la concentration de Fibrinogen ou le volume et la concentration de Thrombin pourrait aider à rendre la préparation plus facile et pourrait être important lors de l’adaptation du protocole à d’autres types de tissus. Avec suffisamment d’expérience dans la manipulation des caillots, plusieurs cerveaux peuvent être immobilisés dans un caillot si nécessaire, bien qu’il complique le réglage fin de l’orientation. Plusieurs caillots peuvent être formés sur le coverslip, permettant, par exemple, d’images d’échantillons de différents génotypes. Il est également possible d’exposer différents caillots sur le même coverslip à différents médias culturels, bien qu’il faut prendre soin de ne jamais mélanger les gouttes de milieu culturel couvrant les différents caillots. Une fois que les cerveaux larvaire sont immobilisés et prêts pour l’imagerie en direct, nous vous conseillons de suivre les recommandations de Lerit et coll.¹³ pour éviter les photodamages excessifs. Nous ajoutons seulement à ces recommandations non seulement pour maintenir le cerveau à 25 °C pendant l’imagerie en direct avec un incubateur de stade, mais aussi pour préchauffer ce stade pendant au moins 30 minutes avant le début de l’imagerie. Entre nos mains, ne pas le faire se traduit systématiquement par une forte dérive de mise au point.

Il peut être avantageux dans certains contextes d’être en mesure d’effectuer une microscopie corrélée et de fixer et d’immunostain un échantillon après l’imagerie en direct. Cependant, une limitation de l’utilisation de caillots fibrins est qu’il est presque impossible d’isoler mécaniquement un cerveau d’un caillot sans l’endommager. Une manière possible de surmonter cette limitation pourrait être de développer des méthodes pour dégrader des caillots de Fibrin avec Plasmin ou pour induire le démontage de caillot par l’addition d’un peptide imitant les boutons permettant la polymérisation de Fibrin^28. Nous utilisons généralement des caillots fibrins sur des échantillons allant de cellules individuelles à 200 μM de long tissus, mais nous pourrions également immobiliser avec succès dans les caillots et les cerveaux d’image des bourdons adultes de plus de 3 mm de large. La limite supérieure de la taille de l’échantillon qui peut être immobilisée dans les caillots reste à déterminer. De même, bien que nous immobilions habituellement des échantillons immobilisés pendant 4 à 5 h, nous avons réussi à imager des neuroblastes en culture primaire pendant une période d’au plus 3 jours, ce qui indique que le caillot n’interfère pas au moins avec la viabilité à long terme. Au contraire, les caillots peuvent faciliter le remplacement régulier du milieu, une exigence pour l’imagerie à long terme, sans avoir besoin d’appareils tels que les pompes périssaltiques à cette fin. Bien que nous n’avons pas mesuré les paramètres de perméabilité des caillots fibrins, la nature fibreuse des caillots semble pénétrable par des molécules perméables cellulaires. Nous avons constaté que la latrunculine A, Colcemid ou 1-NAPP1, les ligands halo-tag et autres teindres standard utilisés en biologie cellulaire atteignent les cellules du caillot de fibrine sans aucun problème et n’ont jusqu’à présent pas rencontré de molécules qui seraient retenues par le caillot, ce qui, cependant, est une possibilité qui doit être testée empiriquement.

En conclusion, l’utilisation de caillots fibrine fournit un moyen fiable et relativement facile de mettre en œuvre un moyen d’immobiliser les tissus vivants pour l’imagerie vivante. Au-delà de son utilité pour limiter la dérive latérale, la capacité de changer le milieu de culture pendant l’imagerie en direct s’est avérée inestimable pour notre approche de la génétique chimique pour étudier la division cellulaire asymétrique des neuroblastes de D. melanogaster ²¹. Nous prévoyons que cette technique sera bénéfique pour les études dans un large éventail de tissus différents, en particulier si elles impliquent la génétique chimique ou, par exemple, l’auto-étiquetage des protéines²⁹.

Notre macro MultiHyperStackReg s’appuie sur le plugin TurboReg ImageJ, qui aligne les cadres successifs ou les tranches d’une pile, et le plugin MultiStackReg ImageJ, qui permet d’appliquer les transformations à d’autres piles. MultiHyperStackReg permet simplement d’appliquer ces transformations aux hyperstacks (piles d’au moins quatre dimensions). Comme l’utilisation de MultiHyperStackReg, comme nous le décrivons, nécessite beaucoup d’actions et peut prendre beaucoup de temps, nous avons également écrit la macro AutoHyperStackReg, qui effectue automatiquement toutes les étapes décrites dans les étapes 6.2 et 6.3. Toutefois, contrairement à MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg n’a actuellement pas la possibilité de calculer l’alignement d’une pile en fonction d’une sous-région de cette pile, une option que nous avons trouvé est parfois crucial pour un alignement satisfaisant. Une autre limitation d’AutoHyperStackReg est que son utilisation est limitée aux traductions et non aux autres transformations proposées par TurboReg et MultiStackReg, tandis que MultiHyperStackReg peut s’appliquer à une hyperstack tout type de transformation si l’utilisateur en a besoin. Les versions futures implémentent ces fonctions et seront disponibles sur GitHub³⁰. Enfin, notre macro linescan rotative fournit un moyen facile de mesurer rapidement les signaux corticals dans les laps de temps, même si le cortex change sa position ou son orientation au fil du temps. Que son mode de suivi ou son mode de non-suivi soit le mieux adapté à l’analyse dépend de la qualité et de la cohérence du signal cortical. Le mode de suivi est plus facile à utiliser car l’utilisateur n’a pas besoin de considérer où le cortex sera pour chaque point de temps et peut accueillir de grands changements de position et d’orientation au fil du temps. Cependant, il ne convient que si le signal cortical reste assez fort pour être détecté pendant tout le film : l’incapacité de détecter autre chose que le cortex (p. ex., un compartiment cytoplasmique lumineux proche du cortex) peut compromettre la détection pour chaque point de temps suivant (p. ex., le compartiment cytoplasmique s’éloigne du cortex et les lignes corticales peuvent le suivre pendant le reste du laps de temps). Le mode non-suivi n’a pas cet écueil car la détection se limite à la ligne tracée à l’origine par l’utilisateur (par exemple, un compartiment cytoplasmique lumineux peut provoquer l’échec de la détection pendant quelques points de temps, mais comme le compartiment cytoplasmique s’éloigne de la zone de détection, la détection correcte du cortex reprend), mais ne se comporte pas bien si la position du cortex ou l’orientation change beaucoup au fil du temps. La prochaine fonctionnalité (qui sera disponible sur GitHub³⁰) à développer pour le mode de suivi sera la possibilité d’analyser uniquement les points de temps spécifiés et de définir un point de référence (plutôt que le premier point de temps) avant lequel et après quoi la détection sera effectuée, ce qui permettra à l’utilisateur d’éviter au moins les points de temps problématiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sérum bovin à l’albumine,	BSA Merck	5470
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Diméthyl sulfoxyde	Sigma	D2650
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Sérum de bovie fœtal, adapté à la culture cellulaire	Sigma	F7524
Fibrinogène à partir de plasma	humainSigma	F3879
FluoroDish Boîte de culture cellulaire - 35 mm, puits de 23 mm	World Precision Instruments	FD35-100
PP1 Analogique (1NA-PP1)	Merck Millipore	529579
Plaque d’appel en pyrex avec neuf dépressions	Sigma	CLS722085-18EA
Schneider’s Insect Medium	Sigma	S0146
Thrombine à partir de plasma bovin	Merck	T4648