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Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Nous présentons un protocole pour le développement et l’utilisation d’un modèle de stress oxydatif en traitant les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes avec H2O2, en analysant la morphologie cellulaire, la viabilité, la densité, le glutathion et le niveau UCP-2. C’est un modèle utile pour étudier l’effet antioxydant des protéines sécrétées par les cellules transfectées par transposon pour traiter la dégénérescence neurorétinienne.

Abstract

Le stress oxydatif joue un rôle essentiel dans plusieurs maladies dégénératives, y compris la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une pathologie qui touche environ 30 millions de patients dans le monde. Il entraîne une diminution des facteurs neuroprotecteurs synthétisés par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), par exemple le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), suivis de la perte de cellules RPE et éventuellement de la mort des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Nous émettons l’hypothèse que la reconstitution de l’environnement rétinien neuroprotecteur et neurogène par la transplantation sous-rétinienne de cellules EPR transfectées surexprimant le PEDF et le GM-CSF a le potentiel de prévenir la dégénérescence rétinienne en atténuant les effets du stress oxydatif, en inhibant l’inflammation et en soutenant la survie cellulaire. En utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB100X),les cellules RPE humaines ont été transfectées avec les gènes PEDF et GM-CSF et ont montré une intégration génétique stable, une expression génique à long terme et une sécrétion de protéines à l’aide de la qPCR, du transfert western, de l’ELISA et de l’immunofluorescence. Pour confirmer la fonctionnalité et la puissance du PEDF et du GM-CSF sécrétés par les cellules RPE transfectées, nous avons développé un test in vitro pour quantifier la réduction du stress oxydatif induit parH2O2sur les cellules RPE en culture. La protection cellulaire a été évaluée en analysant la morphologie cellulaire, la densité, le niveau intracellulaire de glutathion, l’expression du gène UCP2 et la viabilité cellulaire. Les cellules EPR transfectées surexprimant le PEDF et/ou le GM-CSF et les cellules non transfectées mais prétraitées avec du PEDF et/ou du GM-CSF (disponibles dans le commerce ou purifiées à partir de cellules transfectées) ont montré une protection cellulaire antioxydante significative par rapport aux témoins non traités. Le présent modèleH2O2est une approche simple et efficace pour évaluer l’effet antioxydant de facteurs qui peuvent être efficaces pour traiter la DMLA ou des maladies neurodégénératives similaires.

Introduction

Le modèle décrit ici offre une approche utile pour évaluer l’efficacité des agents biopharmaceutiques pour réduire le stress oxydatif dans les cellules. Nous avons utilisé le modèle pour étudier les effets protecteurs du PEDF et du GM-CSF sur le stress oxydatif médié parH2O2sur les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, qui sont exposées à des niveaux élevés d’O2et de lumière visible, et la phagocytose des membranes du segment externe des photorécepteurs, générant des niveaux significatifs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)1, 2. Ils sont considérés comme un contributeur majeur à la pathogenèse de la dégénérescence maculaire avasculaire liée à l’âge (AMMA)3,4,5,6,7,8. En outre, il y a une diminution des facteurs neuroprotecteurs synthétisés par l’EPR, en particulier le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF) conduisant au dysfonctionnement et à la perte de cellules RPE, suivis de la mort des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC)3,4,5 . La DMLA est une maladie complexe qui résulte de l’interaction entre des facteurs métaboliques, fonctionnels, génétiques et environnementaux4. Le manque de traitements pour la MAA est la principale cause de cécité chez les patients âgés de plus de 60 ans dans les pays industrialisés9,10. La reconstitution de l’environnement rétinien neuroprotecteur et neurogène par la transplantation sous-rétinienne de cellules RPE génétiquement modifiées surexprimant le PEDF et le GM-CSF a le potentiel de prévenir la dégénérescence rétinienne en atténuant les effets du stress oxydatif, en inhibant l’inflammation et en soutenant la survie cellulaire11,12,13,14,15,16 . Même s’il existe plusieurs méthodologies pour délivrer des gènes aux cellules, nous avons choisi le système de transposon hyperactif non viral de la Belle au bois dormant pour délivrer les gènes PEDF et GM-CSF aux cellules RPE en raison de son profil de sécurité, de l’intégration des gènes dans le génome des cellules hôtes et de sa propension à intégrer les gènes délivrés dans des sites non transcriptionnellement actifs comme nous l’avons montré précédemment17, 18,19.

Le stress oxydatif cellulaire peut être induit dans les cellules cultivées in vitro par plusieurs agents oxydatifs, dont le peroxyde d’hydrogène(H2O2),le 4-hydroynonenal (HNE), le tertbutylhydroperoxyde (tBH), les tensions élevées en oxygène et la lumière visible (spectre complet ou irradiation UV)20,21. Les tensions élevées d’oxygène et la lumière nécessitent un équipement et des conditions spéciales, ce qui limite la transférabilité à d’autres systèmes. Des agents tels queH2O2,HNE et tBH induisent des changements moléculaires et cellulaires de stress oxydatif qui se chevauchent. Nous avons choisi H2O2 pour tester l’activité antioxydante du PEDF et du GM-CSF parce qu’il est pratique et biologiquement pertinent puisqu’il est produit par les cellules RPE comme intermédiaire réactif de l’oxygène lors de la phagocytose du segment externe des photorécepteurs22 et qu’il se trouve dans les tissus oculaires in vivo23. Étant donné que l’oxydation du glutathion peut être partiellement responsable de la production deH2O2dans l’œil, nous avons analysé les niveaux de GSH / glutathion dans nos études, qui sont liés au stress oxydatif induit par H2O2et à la capacité de régénération des cellules21,22. L’analyse des niveaux de glutathion est particulièrement pertinente car elle participe aux mécanismes de protection anti-oxydatifs dans l’œil24. L’exposition àH2O2 est fréquemment utilisée comme modèle pour examiner la susceptibilité au stress oxydatif et l’activité antioxydante des cellules RPE1,25,26,27,28,29,30, et, en outre, elle montre des similitudes avec les dommages causés par le stress oxydatif induit par la lumière, une source « physiologique » de stress oxydatif21.

Pour évaluer la fonctionnalité et l’efficacité des facteurs neuroprotecteurs, nous avons développé un modèle in vitro qui permet à l’analyse de quantifier l’effet antioxydant des facteurs de croissance exprimés par les cellules génétiquement modifiées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. Ici, nous montrons que les cellules RPE transfectées avec les gènes du PEDF et du GM-CSF sont plus résistantes aux effets nocifs deH2O2 que ne le sont les cellules témoins non transfectées, comme en témoignent la morphologie cellulaire, la densité, la viabilité, le niveau intracellulaire de glutathion et l’expression du gène UCP2, qui code pour la protéine de découplage mitochondrial 2 dont il a été démontré qu’elle réduit les espèces réactives de l’oxygène (ROS)31.

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Protocol

Les procédures de collecte et d’utilisation des yeux humains ont été approuvées par la Commission éthique cantonale pour la recherche (n° 2016-01726).

1. Isolement cellulaire et conditions de culture

  1. Lignée cellulaire humaine ARPE-19
    1. Culture 5 x 105 cellules ARPE-19, une lignée cellulaire RPE humaine, dans le mélange medium/nutritif F-12 (DMEM/Ham’s F-12) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 80 U/mL de pénicilline, 80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B (milieu complet) à 37 °C dans une atmosphère humide de 5 % deCO2 et 95 % d’air dans une fiole T75 (pour les autres densités cellulaires, voir le tableau 1).
    2. Changez le support trois fois par semaine.
    3. Une fois que les cellules sont cultivées à environ 90% de confluence (évalué qualitativement), aspirez le milieu et lavez les cellules avec 1x PBS stérile.
    4. Incuber les cellules avec une solution d’EDTA à 5 % de trypsine-2 % pendant 7 à 10 min à 37 °C (pour les volumes, voir tableau 1). Surveillez visuellement le détachement.
    5. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant un milieu complet contenant 10% de FBS (pour les volumes, voir tableau 1).
    6. Transfecter les cellules (voir l’étape 2. du protocole), sous-cultiver les cellules dans un rapport de 1:10 (une fois par semaine) ou semer dans une plaque de 96 puits comme détaillé ci-dessous (voir les étapes 3.3 et 3.4 du protocole).
Moyen (mL)
Superficie (cm²) Densité d’ensemencement pour les cellules ARPE-19 (cellules/puits) Application Pour la culture cellulaire Pour arrêter la trypsine Volume de trypsine (mL)
Flacon T75 75 5,00,000 Croissance cellulaire ARPE-19 10 7 3
6 Plaque de puits 9.6 1,00,000 Ensemencement de cellules ARPE-19 transfectées 3 1 0.5
Plaque de puits 24 2 50,000 Ensemencement de cellules hRPE transfectées 1 0.8 0.2
96 Plaque de puits 0.32 5 000 pour des expériences de stress oxydatif avec des cellules transfectées (Fig. 1) Expériences sur le stress oxydatif 0.2
3 000 pour les expériences de stress oxydatif avec des cellules non transfectées plus des protéines (Fig. 1)

Tableau 1 : Volumes de culture cellulaire. Volumes de milieux recommandés pour les plaques de culture cellulaire et les flacons pour la culture d’ARPE-19 et de cellules RPE humaines primaires.

  1. Cellules RPE humaines primaires
    1. Isolez les cellules RPE humaines primaires telles que décrites par Thumann et al.17, et les cellules de culture dans un milieu complet complété par 20% fbS.
    2. Changez le support deux fois par semaine. Une fois que les cellules atteignent la confluence (surveillée visuellement), réduisez le FBS à 1% pour éviter la prolifération.
    3. Transfecter les cellules (voir l’étape 2 du protocole) ou semer dans une plaque de 96 puits comme détaillé ci-dessous (voir les étapes 3.3 et 3.4 du protocole).
      NOTE : Les données présentées ici ont été recueillies à partir de la culture de cellules EPR obtenues à partir des yeux de quatre donneurs humains. Le tableau 2 détaille les données démographiques des donateurs de la Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Les yeux ont été énucléés 12,7 ± 5,7 h (moyenne ± SD) après avoir obtenu le consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki.
Non âge genre mort à la conservation (heures) décès à l’isolement culture culture Symbole dans le graphique
(jours) avant la transfection (jours) après transfection (jours)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
méchant 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tableau 2 : Données démographiques des donneurs humains de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.

2. Électroporation de l’ARPE-19 et des cellules RPE humaines primaires

  1. Trypsiniser les cellules ARPE-19 ou les cellules RPE humaines primaires comme décrit aux étapes 1.1.3-1.1.5 du protocole.
  2. Effectuer l’électroporation avec le kit de transfection disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux).
    1. Pour la transfection des cellules ARPE-19, se référer à Johnen et al.32 et pour l’hRPE primaire à Thumann et al.17. Brièvement, remettez en suspension 1 x 105 cellules ARPE-19 ou 5 x 104 cellules primaires hRPE dans 11 μL de tampon R et ajoutez 2 μL de mélange plasmidique contenant 0,03 μg pSB100X transposase33 et 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His ou pT2-CMV-GMCSF-His transposon (ratio transposase:transposon 1:16). Pour les cellules à double transfectation PEDF et GM-CSF, utilisez un rapport de 1:16:16 (0,03 μg pSB100X,0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His et 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Utilisez les paramètres d’électroporation suivants : deux impulsions de 1 350 V pendant 20 ms (largeur d’impulsion) pour les cellules ARPE-19 ; deux impulsions de 1 100 V pendant 20 ms pour les cellules primaires.
  3. Semence 1 x 105 ARPE-19 transfecté ou 5 x 104 cellules primaires hRPE transfectées dans des plaques de 6 et 24 puits, respectivement, dans un milieu complété par 10% FBS sans antibiotiques ni antimycotiques. Ajouter la pénicilline (80 U/mL), la streptomycine (80 μg/mL) et l’amphotéricine B (2,5 μg/mL) avec le premier échange moyen 3 jours après la transfection.
  4. Déterminer la croissance cellulaire par une surveillance microscopique hebdomadaire des cellules. L’efficacité de la transfection est surveillée par l’analyse de l’expression des gènes par RT-PCR, et la sécrétion de protéines par ELISA et WB (méthodes expliquées dans Supplementary Material).
    REMARQUE: L’efficacité de la transfection peut être évaluée pour la première fois une fois que les cellules atteignent la confluence, c’est-à-dire à environ 7 jours et 4 semaines après la transfection pour les cellules ARPE-19 et les cellules hRPE primaires, respectivement.
  5. Ensemencez des cellules dans une plaque de 96 puits comme détaillé ci-dessous (voir l’étape 3.5 du protocole).

3. Induction du stress oxydatif (traitement H2O2) et neuroprotection (traitement PEDF et/ou GM-CSF)

  1. Préparation du milieu conditionné de cellules ARPE-19 transfectées
    1. Utiliser des cellules ARPE-19 transfectées avec les gènes PEDF, GM-CSF, ou les deux (voir l’étape 2 du protocole); cellules de culture pendant 28 jours, comme décrit à l’étape 1.1 du protocole.
    2. 28 jours après la transfection, trypsiniser les cellules (voir les étapes 1.1.3-1.1.5 du protocole), compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer34,35et ensemencer 5 x10 5 cellules dans des flacons T75 en milieu complet comme décrit à l’étape 1.1.1 du protocole. Échangez le milieu lorsque la culture cellulaire est confluente à environ 80% (environ après 1 semaine; vérifié qualitativement). Recueillir le milieu après 24 h.
    3. Conserver le milieu à -20 °C jusqu’à utilisation.
      NOTE: Une concentration suffisante de PEDF recombinant et de GM-CSF dans le milieu conditionné a été vérifiée par WB et quantifiée par ELISA comme décrit dans Matériel supplémentaire.
  2. Purification du PEDF et du GM-CSF à partir d’un milieu conditionné de cellules ARPE-19 transfectées
    1. Centrifuger le milieu collecté à partir de l’étape 3.1.2 à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    2. Utilisez le superflow Ni-NTA (voir tableau des matériaux)selon les protocoles du fabricant pour purifier les protéines marquées His comme décrit ci-dessous.
      1. Pipette 30 μL de mélange Ni-NTA dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 2 600 x g pendant 30 s et jeter le flux. Lavez la pastille deux fois avec 200 μL de tampon d’incubation 1x.
      2. Centrifuger à 2 600 x g pendant 30 s et jeter le débit. Ajouter 40 μL de tampon d’incubation 4x et remettre en suspension.
      3. Ajouter 900 μL de milieu conditionné centrifugé et incuber à 70 tr/min (agitateur orbital) pendant 1 h à RT. Centrifuger à 2 600 x g pendant 1 min et jeter l’écoulement.
      4. Lavez la pastille deux fois avec 175 μL de tampon d’incubation 1x. Centrifuger à 2 600 x g pendant 30 s et jeter le débit.
      5. Pour éluer les protéines PEDF et GM-CSF marquées par His, ajoutez 20 μL de tampon elution et incubez à 70 tr/min (agitateur orbital) pendant 20 min à RT. Centrifuger à 2 600 x g pendant 30 s. Conservez le surnageant contenant du PEDF recombinant ou du GM-CSF.
    3. Quantifier la protéine totale à l’aide du kit d’analyse des protéines BCA disponible dans le commerce (voir la table des matériaux)conformément aux instructions du fabricant.
    4. Conserver la solution protéique à -20 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: Le tampon d’incubation (4x) contient 200 mM de NaH2PO4,1,2 M de NaCl et 40 mM d’imidazol; Le tampon d’élution contient 50 mM de NaH2PO4,300 mM de NaCl et 250 mM d’imidazol.
  3. Traitement des cellules ARPE-19/hRPE primaires non transfectées avec un milieu conditionné plusH2O2 (Figure 1A)
    1. Ensemencez 3 000 cellules ARPE-19 non transfectées (à partir de l’étape 1.1.6 du protocole) ou de hRPE primaire (à partir de l’étape 1.2.3 du protocole) par puits dans une plaque de 96 puits et une culture dans 200 μL de milieu conditionné à partir de cellules ARPE-19 transfectées.
    2. Cultiver les cellules pendant 10 jours à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air. Changez le milieu conditionné tous les jours. Exposer les cellules à 350 μMH2O2 pendant 24 h.
    3. Évaluer les dommages causés par le stress oxydatif et déterminer l’effet antioxydant du PEDF et du GM-CSF par quantification des niveaux de glutathion (voir l’étape 4.1 du protocole), la microscopie (voir l’étape 4.2 du protocole) et le test de cytotoxicité (voir l’étape 4.2 du protocole).
      REMARQUE: La durée de l’expérience est de 12 jours. Des plaques de micropuits à fond plat transparent sont utilisées pour évaluer la luminescence ainsi que la morphologie cellulaire. Pour effectuer simultanément le test de cytotoxicité et de glutathion, deux plaques doivent être ensemencées avec des cellules le même jour.
  4. Traitement des cellules ARPE-19/hRPE primaires non transfectées avec des facteurs de croissance PEDF et GM-CSF plus H2O2 (Figure 1B)
    1. Semer 3 000 cellules ARPE-19 non transfectées (à partir de l’étape 1.1.6 du protocole) ou hRPE primaires (à partir de l’étape 1.2.3 du protocole) par puits (plaques de 96 puits avec un fond plat clair) dans 200 μL de milieu de culture complet contenant 500 ng/mL de PEDF recombinant et/ou 50 ng/mL de GMcombinant-CSF, purifiés à partir du milieu de cellules ARPE-19 transfectées ou disponibles dans le commerce. Cellules de culture pendant 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air. Renouvelez quotidiennement le milieu, y compris les facteurs de croissance PEDF et GM-CSF.
      REMARQUE: Ajoutez les facteurs de croissance frais au milieu.
    2. Après 48 h de traitement des cellules avec les facteurs de croissance, prélever le milieu et ajouter le milieu complet contenant 350 μMH2O2 plus 500 ng/mL PEDF et/ou 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Évaluer les dommages causés par le stress oxydatif et déterminer l’effet antioxydant du PEDF et du GM-CSF par quantification des niveaux de glutathion (voir l’étape 4.1 du protocole), la microscopie (voir l’étape 4.2 du protocole) et le test de cytotoxicité (voir l’étape 4.2 du protocole).
      REMARQUE: La durée de l’expérience est de 3 jours.
  5. Traitement des cellules ARPE-19/hRPE primaire transfectées avec H2O2 (Figure 1C)
    1. Vérifier l’expression génique suffisante et la sécrétion protéique des cellules transfectées par WB et ELISA comme décrit dans le matériel supplémentaire.
    2. Retirer le milieu des puits contenant les cellules transfectées (voir l’étape 2 du protocole).
    3. Trypsiniser les cellules comme décrit aux étapes 1.1.3-1.1.5 du protocole. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer34,35.
    4. Ensemencez 5 000 cellules/puits transfectés dans une plaque de 96 puits dans 200 μL de milieu complet. Cellules de culture pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air. Après 24 h, exposer les cellules à 350 μMH2O2 pendant 24 h.
    5. Évaluer les dommages causés par le stress oxydatif et déterminer l’effet antioxydant du PEDF et du GM-CSF par quantification des niveaux de glutathion (voir l’étape 4.1 du protocole), la microscopie (voir l’étape 4.2 du protocole), le test de cytotoxicité (voir l’étape 4.2 du protocole) et la détermination de l’expression du gène UCP2 (voir l’étape 4.3 du protocole).
      REMARQUE: La durée de l’expérience est de 2 jours.

Figure 1
Figure 1: Chronologie du test H2O2 dans les trois différentes approches expérimentales. 3 000 cellules non transfectées traitées avec le milieu conditionné/protéines recombinantes ou 5 000 cellules transfectées ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits pour un traitement avecH2O2. Pour déterminer l’effet du milieu conditionné, les cellules ont été cultivées dans un milieu de culture à 100% pendant 10 jours consécutifs, changeant de milieu tous les jours. Pour déterminer l’effet des facteurs de croissance recombinants, les cellules ont été cultivées en ajoutant la quantité appropriée de facteurs de croissance chaque jour pendant 3 jours consécutifs. Notez que les cellules non transfectées ont été ensemencées à 3 000 cellules par puits pour éviter la prolifération pendant la durée de culture plus longue par rapport aux cellules transfectées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Analyse du niveau de stress oxydatif et de la capacité antioxydante

  1. Dosage du glutathion
    1. Mesurez les niveaux de glutathion (GSH) à l’aide de la trousse disponible dans le commerce (voir la table des matériaux)en suivant les instructions du fabricant. En bref, préparer et le volume approprié de 1x mélange de réactif (réactif de 100 μL / puits): substrat de luciférine-NT et glutathion S-transférase dilué 1:100 dans le tampon de réaction.
      REMARQUE: Une plaque de 96 puits nécessite 10 mL de mélange de réactif 1x, qui est préparé en ajoutant 100 μL de substrat de luciférine-NT et 100 μL de glutathion S-transférase à 10 mL de tampon de réaction. Préparez le mélange de réactif 1x immédiatement avant utilisation. Ne conservez pas le mélange de réactifs préparé pour une utilisation ultérieure.
    2. Préparez le réactif de détection de la luciférine en transférant une bouteille de tampon de reconstitution au réactif de détection de la luciférine lyophilisé.
    3. Préparer une courbe étalon à l’aide d’une solution étalon de glutathion (GSH) (5 mM). Diluer 5 mM de solution de GSH 1:100 avec dH2O (ajouter 10 μL de solution de GSH de 5 mM à 990 μL de dH2O). Effectuer 7 dilutions série 1:1 dans 500 μL de dH2O. Transférer 10 μL de chaque étalon dilué vers un puits approprié en double exemplaire.
      REMARQUE: La concentration finale de glutathion variera de 0,039 μM à 5 μM.
    4. Préparer le blanc (1x mélange de réactifs) et transférer 10 μL (doublons) dans les puits appropriés.
    5. Retirer les cellules traitéesenH2 O2de l’incubateur.
      NOTE: Documenter la morphologie des cellules traitées par H2O2par microscopie à fond clair (40x).
      Lorsque les cellules sont oxydées, elles semblent plus arrondies et moins répandues.
    6. Aspirez soigneusement le milieu de culture. Ajouter 100 μL de mélange préparé de 1x réactif à chaque puits. Mélanger les cellules avec le réactif pendant 15 s à 500 tr/min sur un agitateur orbital.
    7. Incuber la plaque à RT pendant 30 min. Ajouter 100 μL de réactif de détection de la luciférine reconstitué à chaque puits.
    8. Mélanger la solution pendant 15 s à 500 tr/min sur un agitateur orbital. Incuber la plaque pendant 15 min à RT.
    9. Déterminez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques à l’aide d’un programme préinstallé ADP-Glo.
      REMARQUE: Placez la plaque à l’intérieur du lecteur de plaque sans le couvercle.
      1. Cliquez sur Modifier la mise en page et choisissez les paramètres suivants dans Paramètres de base: Plaque Costar 96 puits; optique supérieure; délai de positionnement: 0,1; heure de début de la mesure: 0,0; temps d’intervalle de mesure: 1,0; temps pour normaliser les résultats: 0,0; le gain est ajusté automatiquement par l’appareil. Définissez des blancs, des normes et des échantillons. Cliquez sur Démarrer la mesure.
      2. Exportez les données sous forme de fichier Excel. Calculer la concentration de GSH dans chaque échantillon par interpolation de la courbe standard.
  2. Test de cytotoxicité et analyse microscopique
    1. Aspirer le milieu des cellules et ajouter 100 μL de milieu complet contenant 1% de FBS à chaque puits. Renvoyer les cellules à l’incubateur.
      REMARQUE: 1% FBS est utilisé parce que des pourcentages plus élevés de FBS peuvent interférer avec la mesure de la luminescence, donc 1% FBS est utilisé dans ce cas.
    2. Mesurez la viabilité des cellules à l’aide de la trousse d’analyse de cytotoxicité disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)en suivant les instructions du fabricant. En bref, préparez le mélange de réactifs en ajoutant le tampon de dosage au substrat lyophilisé. Préparez le réactif de lyse en ajoutant 33 μL de digitonine à 5 mL de tampon d’essai (pour une plaque de 96 puits). Bien mélanger en pipetant de haut en bas pour assurer l’homogénéité.
      REMARQUE: Pour des résultats optimaux, utilisez un mélange de réactif fraîchement préparé. Utiliser dans les 12 h s’il est conservé à TA. Le mélange de réactifs peut être conservé à 4 °C jusqu’à 7 jours et peut être conservé dans des aliquotes à usage unique jusqu’à 4 mois à -70 °C. La congélation et la décongélation doivent être évitées. Le réactif de lyse peut être conservé à 4 °C jusqu’à 7 jours.
    3. Préparez une courbe standard avec des cellules ARPE-19 non traitées.
      1. Trypsiniser les cellules comme décrit aux étapes 1.1.3-1.1.5 du protocole et compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer34,35. Centrifuger les cellules à 120 g pendant 10 min à RT. Aspirer le surnageant et remettre la pastille de cellule dans le milieu F12 de DMEM/Ham contenant 1 % de FBS jusqu’à une concentration finale de 1 x 105 cellules/mL.
      2. Préparer 7 dilutions série 1:1 dans un milieu de 200 μL contenant 1 % de FBS. Transférer 100 μL de chaque étalon vers les puits appropriés (doublons). Ajouter 50 μL de mélange de réactifs à tous les puits.
    4. Mélanger les cellules avec le réactif pendant 15 s à 500 tr/min sur un agitateur orbital. Incuber la plaque pendant 15 min à RT. Mesurer la luminescence à l’aide du lecteur de plaque comme décrit à l’étape 4.1.9 du protocole. Ajouter 50 μL du réactif de lyse et incuber pendant 15 min. Mesurer la luminescence à l’aide du lecteur de plaques comme décrit à l’étape 4.1.9 du protocole.
    5. Calculer le pourcentage de cellules viables: (100 - % de cellules mortes) et le pourcentage de cellules mortes = [1ère mesure de luminescence ((cellules mortes dans l’échantillon))/ 2ème mesure de luminescence (toutes les cellules mortes après traitement à la digitonine)] x 100.
  3. Analyse d’expression UCP2 par RT-qPCR
    1. Trypsiniser les cellules transfectées comme décrit ci-dessus (étapes 1.1.3-1.1.5 du protocole).
    2. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer34,35.
    3. Ensemencez 5 000 cellules/puits ARPE-19 transfectés dans des plaques de 96 puits.
    4. Après 24 h de culture, traiter les cellules avec 350 μMH2O2 pendant 24 h.
    5. Isoler l’ARN total à l’aide d’un kit commercial pour isoler l’ARN d’un faible nombre de cellules (voir tableau des matériaux)en suivant les instructions du fabricant.
    6. Effectuer une PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) comme décrit dans Matériel supplémentaire. En bref, générez de l’ADNc par rétrotranscription à l’aide d’un mélange disponible dans le commerce contenant une transcriptase inverse M-MLV optimisée (voir Table des matériaux).
    7. Pour la qPCR, utilisez un cocktail de réaction prêt à l’emploi contenant tous les composants (y compris SYBR Green) à l’exception des amorces (voir le tableau S1 du matériel supplémentaire)et du modèle d’ADN. Utilisez les conditions de thermocyclage suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, 40 cycles avec dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 60 °C pendant 30 s et allongement à 72 °C pendant 32 s.
    8. Utilisez la méthode 2^(-ΔΔCT) pour l’analyse36.
  4. Préparation du lysat cellulaire pour l’analyse SDS-PAGE et WB de pAkt (Ser473)
    1. Semence 3 x 105 cellules/puits ARPE-19 transfectés par GM-CSF dans des plaques de 6 puits (≥21 jours après la transfection) pour déterminer si gm-CSF protège les cellules RPE contre les dommages causés parH2O2 par l’activation de la voie de survie Akt15.
    2. Après 24 h de culture, les cellules sont exposées à 350 μM H2O2 pendant 24 h.
    3. Mélanger 1 mL de tampon RIPA avec 10 μL de cocktail d’inhibiteurs de la protéase phosphatase, 10 μL de 0,5 M d’EDTA et 25 μL d’urée de 8 M (volumes utilisés pour un puits).
    4. Aspirer soigneusement le milieu et laver les cellules avec 1x PBS.
    5. Ajoutez tout le volume de mélange tampon RIPA aux cellules.
    6. Pipette de haut en bas.
    7. Recueillir le lysat dans des tubes de 1,5 mL.
    8. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
    9. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    10. Déterminer les niveaux de pAkt dans 15 μL de lysat cellulaire non dilué par WB comme décrit dans Matériel supplémentaire.

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Representative Results

Induction du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines
L’ARPE-19 et les cellules primaires hRPE ont été traitées avec des concentrations variables deH2O2 pendant 24 h et le niveau intracellulaire du glutathion antioxydant a été quantifié (Figure 2A,B). H2O2 à 50 μM et 100 μM n’a pas affecté la production de glutathion, alors qu’à 350 μM, il y avait une diminution significative du glutathion dans les cellules ARPE-19 et les cellules hRPE primaires. L’analyse de la cytotoxicité a montré que 350 μM est la concentration la plus faible deH2O2 qui provoque une diminution significative de la viabilité cellulaire (Figure 2C). Morphologiquement, les cellules ARPE-19 traitées avecH2O2 apparaissent moins étalées et plus arrondies, caractéristiques qui deviennent plus évidentes avec l’augmentation de la concentration de H2O2 (Figure 3). L’effet était moins important pour les cellules transfectées peDF et GM-CSF traitées avecH2O2 (Figure 3). Pour démontrer l’effet dunombre de cellules sur le stress oxydatif médié parH2O2, 5 000 et 10 000 cellules ARPE-19 par puits ont été ensemencées dans une plaque blanche de 96 puits; le lendemain, les cellules ont été traitées avec 350 μMH2O2 pendant 24 h et les niveaux de glutathion ont été déterminés. La figure 4 montre que le niveau de glutathion n’a diminué que dans les puits (n = 3) ensemencés avec 5 000 cellules. Pour les expériences visant à déterminerl’effet des antioxydants des ROS générés parH2 O2,il est essentiel de considérer le nombre de cellules; pour le protocole spécifique présenté dans le présent rapport, 3 000 à 5 000 cellules/puits (plaques de 96 puits) traitées pendant 24 h avec 350 μMH2O2 sont appropriées pour montrer des dommages cellulaires importants tout en conservant la capacité de récupération imitant une réponse subaiguë aux dommages cellulaires induits par le stress oxydatif.

Figure 2
Figure 2: Niveau de stress oxydatif mis en évidence comme le niveau de glutathion et la viabilité cellulaire, dans les cellules RPE humaines traitées avecH2O2. (A) LES CELLULES ARPE-19 exposées à plusieurs concentrations de H2O2 ont montré une diminution significative des niveaux de glutathion (entre parenthèses) à 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) et 700 μM (0,002 μM) par rapport aux cellulesH2O2-non traitées (2,9 μM) (p < 0,0001 pour 350, 500, et 700 μM H2O2). (B) Les cellules RPE humaines primaires ont montré une diminution des niveaux de glutathion; cependant, l’effet était moins important que pour ARPE-19 mais toujours statistiquement significatif par rapport aux témoins à 350, 500 et 700 μM H2O2. 350 μM était la concentration la plus faible de H2O2 qui a produit des dommages oxydatifs significatifs, comme le montre la diminution des niveaux de glutathion par rapport aux cellules témoins non traitées (p = 0,0022). Les niveaux de glutathion ont diminué avec l’augmentation des concentrations de H2O2 (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) L’analyse de cytotoxicité a montré que 350 μM H2O2 était la concentration la plus faible qui produisait une diminution significative du pourcentage de cellules viables (p < 0,0001 pour 350, 500 et 700 μM). Les données sont présentées comme moyennes ± ET (n = 3 répétitions) et les différences significatives sont indiquées par (*); des calculs post-hoc de l’ANOVA ont été effectués à l’aide du test de comparaison multiple de Tukey comparant C- avec les groupes de traitement H2O2. C- :H2O2 cellules non traitées. Ce chiffre a été modifié à partir de Bascuas et al.37. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Morphologie des cellules ARPE-19 non transfectées et transfectées en PEDF ou GM-CSF traitées avecH2O2. Les cellules traitées avec des concentrations croissantes deH2O2 montrent moins de cellules dans les puits de culture et présentent une morphologie plus arrondie et moins répandue, un signe connu de stress cellulaire. Notez que pour les cellules transfectées par PEDF ou GM-CSF, le stress cellulaire est moins important et se développe de manière similaire aux cellules témoins non traitées. C- : cellules témoins non traitées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Influence du nombrede cellules sur l’effet du stress oxydatif induit parH2O2. 5 000 et 10 000 cellules/puits ARPE-19 ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec 350 μMH2O2 pendant 24 h. Des différences significatives dans les niveaux de glutathion ont été observées dans les puits ensemencés avec 5 000 cellules (p = 0,031, t-test) mais pas dans les puits ensemencés avec 10 000 cellules. C- : cellules non traitées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse de l’effet antioxydant du PEDF et du GM-CSF délivré par les cellules RPE humaines transfectées SB100Xdans des conditions de stress oxydatif
En tant que témoins positifs, ARPE-19 et les cellules RPE humaines primaires ont été traitées avec 5, 50 ou 500 ng / mL de PEDF ou de GM-CSF disponibles dans le commerce pendant 2 jours avant et pendant le traitement H2O 2de24 h. Les cellules ARPE-19 traitées avec 500 ng/mL de PEDF ou 50 ng/mL de GM-CSF ont produit significativement plus de glutathion que les témoins non traités dans des conditions oxydatives(H2O2-traités)(Figure 5A); le PEDF et le GM-CSF comparables purifiés à partir de milieux de culture de cellules ARPE-19 transfectées ont montré un effet similaire(figure 5B). Dans les cellules primaires hRPE, l’ajout de 500 ng/mL de PEDF, de 50 ng/mL de GM-CSF ou de 500 ng/mL de PEDF plus 50 ng/mL de GM-CSF, qu’il soit commercial ou purifié à partir de milieux conditionnés par des cellules ARPE-19 transfectées par peDF ou GM-CSF, a réduit les dommages cellulaires reflétés par une augmentation significative des niveaux de glutathion(Figure 5C). Les cellules primaires d’EPEh traitées pendant 10 jours avec un milieu conditionné à partir de cellules ARPE-19 transfectées ont également montré des niveaux de glutathion plus élevés que les cellules témoins (Figure 5D). Sur la base de ces résultats, d’autres expériences ont été menées avec 500 ng/mL pour le PEDF et 50 ng/mL pour le GM-CSF.

Les cellules ARPE-19 et hRPE primaires ont été transfectées avec les gènes codant pour le PEDF et/ou le GM-CSF à l’aide du système de transposon De la Belle au bois dormant combiné à l’électroporation. Après la transfection et l’analyse de l’expression génique par RT-qPCR, WB, ELISA et immunohistochimie (voir Matériel supplémentaire, Figure S1et Figure S2),les cellules ARPE-19 transfectées exposées à 350 μM H 2 O2pendant24 h ont montré des niveaux de glutathion significativement plus élevés que les cellules traitées H2O2non transfectées (Figure 6A ). Pour les cellules hRPE primaires, il y a une augmentation significative des niveaux de glutathion dans les cellules transfectées de PEDF par rapport aux cellules non transfectées traitées avec H2O2 lorsque tous les donneurs ont été inclus dans l’analyse. De plus, les donneurs 2 et 3 montrent une augmentation significative des niveaux de glutathion pour tous les groupes transfectés (PEDF, GM-CSF, PEDF et GM-CSF) (données non présentées).

L’étude de l’expression du gène UCP2 a complété l’analyse par examen du stress oxydatif mitochondrial. Une série de preuves de concept a été réalisée dans des cellules ARPE-19 transfectées traitées avec 350 μM H2O2 pendant 24 h. Comme le montre la figure 7,dans les cellules ARPE-19 transfectées, les niveaux d’expression du gène UCP2 après le traitement H2O2 sont augmentés, mais l’augmentation n’est pas statistiquement significative. La figure 8 montre un WB d’Akt phosphorylé (pAkt) provenant d’un lysat de cellules transfectées GM-CSF exposées àH2O2; les données normalisées ne montrent qu’une légère diminution par rapport au témoin non traité, ce qui indique que le GM-CSF peut protéger les cellules contre les dommages causés par le stress oxydatif.

Figure 5
Figure 5: Niveau de glutathion comme marqueur de la capacité antioxydante du PEDF et du GM-CSF. (A) Le traitement des cellules ARPE-19 avec 500 ng/mL PEDF ou 50 ng/mL GM-CSF pendant 3 jours avant et pendant 24 h H2O2 exposition a augmenté le niveau de glutathion de 0,83 μM (C) à 1,83 μM (PEDF) et 1,3 μM (GM-CSF), p = 0,026 et p = 0,031, respectivement. À une concentration de 5 ng/mL, aucune augmentation du glutathion n’a été observée; la différence dans le niveau de glutathion entre 50 et 500 ng/mL n’était pas significative pour le PEDF ou le GM-CSF. (B) Le PEDF (500 ng/mL) et le GM-CSF (50 ng/mL) purifiés à partir de milieux conditionnés de cellules ARPE-19 transfectées ont montré un effet similaire au PEDF ou au GM-CSF disponibles dans le commerce (p = 0,018, ANOVA). (C) L’ajout de 500 ng/mL de PEDF, de 50 ng/mL de GM-CSF ou de 500 ng/mL de PEDF plus 50 ng/mL de GM-CSF pendant 3 jours avant et pendant 24 h H2de traitement au milieu de culture de cellules primaires d’EPHR a considérablement augmenté les niveaux de glutathion dans les cellules traitées au PEDF (2,6 μM [commercial], 2,5 μM [purifié]), GM-CSF (2,9 μM [commercial], 3,3 μM [purifié]), et PEDF plus GM-CSF (3,0 μM [commercial], 2,9 μM [purifié]) par rapport aux cellules non traitées (1,9 μM) (p = 0,006, test de Kruskal-Wallis). (D) Une augmentation significative des taux de glutathion a été observée pour les cellules hRPE cultivées pendant 10 jours dans un milieu conditionné à partir de cellules ARPE-19 transfectées de PEDF, GM-CSF ou PEDF-GM-CSF avant que les cellules ne soient traitées avecH2O2 (p = 0,003, test de Kruskal-Wallis) (données montrées pour un donneur). Les données sont exprimées en moyenne ± ET (n = 3 réplications). Les différences significatives sont indiquées par (*); les calculs post-hoc des analyses de variance ont été effectués en calculant les tests multi-comparaisons de Tukey ou de Dunnett comparant « C » avec les groupes traités PEDF-/GM-CSF. C: cellules traitées uniquement avecH2O2, P: cellules traitées avec PEDF, G: cellules traitées avec GM-CSF, P + G: cellules traitées avec PEDF plus GM-CSF. Ce chiffre a été modifié à partir de Bascuas et al.37. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Niveau de glutathion en tant que marqueur de la capacité antioxydante des cellules EPR humaines transfectées par PEDF et GM-CSF. (A) Les niveaux de glutathion des cellules ARPE-19 transfectées exposées à 350 μM H2O 2 pendant24 h (56 jours après la transfection) étaient significativement plus élevés que ceux des cellules non transfectées (1,9 μM), soit 3,0 μM pour les cellules transfectées peDF et GM-CSF, et 3,4 μM pour les cellules à double transfection (p = 0,0001, ANOVA). Les données sont exprimées en moyenne ± ET (n = 3 réplications). (B) Le diagramme à points montre les valeurs moyennes de glutathion pour quatre donneurs différents (C: 0,77 μM; P : 1,45 μM; G : 1,16 μM; P+G : 1,2 μM), qui diffère significativement entre les cellules non transfectées et transfectées par PEDF (p = 0,028, des calculs post-hoc de l’ANOVA ont été effectués à l’aide des tests multi-comparaisons de Tukey comparant « C » avec les groupes traités PEDF-/GM-CSF). Lorsque les donneurs sont analysés séparément, les donneurs N°2 et N°3 (voir le tableau 2 pour le symbole dans le graphique) montrent des différences significatives pour tous les groupes transfectés par rapport au témoin non transfecté (les significations ne sont pas indiquées) traités avec H2O2. C: cellules non transfectées, P: cellules transfectées PEDF, G: cellules transfectées GM-CSF, P + G: cellules transfectées PEDF et GM-CSF. Ce chiffre a été modifié à partir de Bascuas et al.37. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Expression du gène UCP2 dans les cellules ARPE-19 transfectées traitées parH2O2. Étant donné que l’expression du gène UCP2 peut être utilisée pour examiner les dommages oxydatifs mitochondriaux, nous avons examiné l’effet de la surexpression du PEDF et du GM-CSF par les cellules ARPE-19 transfectées. Les cellules ARPE-19 transfectées traitées avecH2O2, bien que non statistiquement significatives, montrent une augmentation de l’expression du gène UCP2 par rapport au contrôle non transfecté indiquant une réduction du stress oxydatif, l’augmentation du pli était de 1,57 pour le PEDF-, de 1,51 pour le GM-CSF- et de 2,36 pour les cellules transfectées PEDF- plus GM-CSF par rapport au témoin non transfecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Western Blot d’Akt phosphorylé (Ser473) à partir d’un lysat cellulaire de cellules ARPE-19 transfectées par GM-CSF. La BM a démontré que le GM-CSF améliore la phosphorylation d’Akt dans les cultures non traitées et traitées parH2O2(UT: 3.32; H2O2: 2,69). Les valeurs sont normalisées en cellules non transfectées non traitées parH2O2(C/UT). C: non transfectées, G: cellules GM-CSF transfectées, UT: cellules non traitées avecH2O2, H2O2: cellules traitées avec H2O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau S1 : Séquences de paires d’amorces et temps/température de recuit utilisés pour la RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 

Figure S1 : Analyse de l’expression génique du PEDF et du GM-CSF dans les cellules hRPE transfectées. La RT-qPCR a vérifié que les cellules hRPE primaires transfectées présentaient une augmentation significative de l’expression génique du PEDF (p = 0,003, test de Kruskal-Wallis) et du GM-CSF (p = 0,013, test de Kruskal-Wallis) par rapport aux cellules non transfectées. La méthode 2^(-ΔΔCT) a été utilisée dans ce cas36. Les données sont exprimées en moyenne ± ET (n = 4 donneurs). Chaque point représente la moyenne de trois répétitions. Ce chiffre a été modifié à partir de Bascuas et al.37. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2 : Sécrétion de protéines dans les cellules primaires transfectées hRPE et ARPE-19. (A) La quantification des protéines sécrétées par ELISA a montré que les cellules hRPE transfectées sécrétaient significativement plus de PEDF et de GM-CSF que les cellules non transfectées (p = 0,014 pour le PEDF, et p = 0,006 pour le GM-CSF, test de Kruskal-Wallis). Les données sont présentées comme moyennes ± et de développement durable (n = 4 donneurs). Chaque point représente la moyenne de trois répétitions. (B) La double coloration PEDF-GM-CSF a confirmé la co-sécrétion de PEDF et de GM-CSF dans des cellules ARPE-19 à double transfectation (figure fusionnée). Ce chiffre a été modifié à partir de Bascuas et al.37. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Matériel supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le protocole présenté ici offre une approche pour analyser la fonction antioxydante et protectrice du PEDF et du GM-CSF produits par les cellules transfectées, qui peuvent être appliquées aux cellules transfectées avec n’importe quel gène bénéfique putatif. Dans les stratégies thérapeutiques géniques qui ont pour objectif de délivrer des protéines aux tissus en transplantant des cellules génétiquement modifiées, il est essentiel d’obtenir des informations sur le niveau d’expression des protéines, la longévité d’expression et l’efficacité de la protéine exprimée dans un modèle de la maladie. Dans notre laboratoire, le protocole présenté ici a été utile pour définir l’efficacité du PEDF et du GM-CSF sur le stress oxydatif, qui a été supposé être un élément important dans la pathogenèse de l’aAMD6,7. Plus précisément, nous avons utilisé le protocole pour définir l’effet antioxydant des cellules primaires hRPE transfectées par PEDF/GM-CSF médiées par SB100X. Plusieurs chercheurs ont montré queH2O2 induit des symptômes significatifs de stress oxydatif mais permet toujours la régénération cellulaire28,29,38, similaire aux résultats de nos expériences qui ont montré que 350 μM pendant 24 h induit un stress oxydatif efficace dans les cellules ARPE-19 humaines et les cellules RPE primaires qui peuvent être utilisées pour analyser l’effet protecteur du PEDF et du GM-CSF. H2O2 comme agent oxydatif a été choisi pour l’étude en raison de sa présence physiologique dans l’œil et des mécanismes de défense correspondants, par exemple, le métabolisme du glutathion20,21. Notre laboratoire a examiné d’autres modèles de stress oxydatif tels que le traitement des cellules avec tBH, qui initie la peroxydation lipidique en présence d’ions métalliques redox-actifs1; cependant, le stress oxydatif était négligeable. Dans les expériences présentées ici, les cellules ont été traitées avecH2O 2 pendant24 h parce que nous avons constaté que des temps de traitement plus courts de 2 à 6 h sont suffisants pour induire des changements dans l’expression des gènes20, mais que les conséquences ultérieures, par exemple la prolifération cellulaire, la viabilité cellulaire et les niveaux de glutathion, pourraient ne pas être encore visibles. Sinon, la petite taille des puits, nécessaire aux essais de cytotoxicité et de glutathion, conduit rapidement à un puits de culture confluente; cela pourrait conduire à une inhibition du contact et à un masquage de l’effet de l’agent oxydatif. Par conséquent, une longue incubation avecH2O2 ne semble pas utile, bien que la dégénérescence observée dans l’aAMD soit causée par un stress oxydatif chronique6,7.

Une limitation des expériences présentées ici est que le nombre de cellules ensemencées influence l’effet oxydatif de H2 O2,c’est-à-dire que, pour le même traitement H2O2, des différences significatives dans les niveaux de glutathion entreH2O2-traités et non traités ont été observées lorsque 5 000 cellules mais pas lorsque 10 000 cellules ont été ensemencées (Figure 4 ). Le protocole que nous présentons nécessite l’ensemencement d’un faible nombre de cellules, c’est-à-dire 3 000 lorsque les cellules sont cultivées pendant 3 jours et 5 000 lorsque les cellules sont cultivées pendant 2 jours(Figure 1). Une autre limitation est que la concentration deH2O2 s’épuise avec le temps; Kaczara et al.39 ont montré un épuisement deH2O2 en quelques heures dans des cultures cellulaires ARPE-19, ce qui affecte le développement de modèles de stress oxydatif chronique. Ces chercheurs ont proposé une méthode alternative pour le traitement soutenu de H2O2, en particulier la génération continue de H2O2 à partir du glucose dans le milieu en utilisant la glucose oxydase, mais une concentration normalisée de H2O2 ne peut être garantie. D’autre part, le protocole que nous avons établi avec l’administration de l’agent oxydant en une seule impulsion, a l’avantage d’être plus rapide et plus simple à réaliser par rapport aux modèles chroniques danslesquelsle traitementH2O2 doit être répété pendant plusieurs jours38.

La capacité des cellules à contrer les dommages oxydatifs est déterminée par l’équilibre entre la production de ROS et la capacité de générer des antioxydants. Dans la cellule, le tripeptide glutathion (GSH) est l’agent réducteur prédominant, qui peut être oxydé en disulfure de glutathion (GSSG) et régénéré par la glutathion réductase en utilisant NADPH40. Dans les cellules saines, plus de 90% du pool total de glutathion est présent sous forme réduite. Lorsque les cellules sont exposées à un niveau accru de stress oxydatif, le GSSG s’accumule et le rapport GSSG/ GSH augmente. Par conséquent, la surveillance de l’état redox du glutathion dans les échantillons biologiques est essentielle pour l’évaluation de l’état de désintoxication des cellules et des tissus des radicaux libres générés pendant le stress oxydatif et les lésions cellulaires. Le protocole détaillé ici pour la quantification du glutathion est suffisamment sensible pour détecter l’effet antioxydant du PEDF et du GM-CSF exprimé par les cellules RPE génétiquement modifiées.

Puisque le stress oxydatif affecte les activités mitochondriales40,il est particulièrement intéressant que le contrôle des niveaux de ROS par le PEDF soit lié à la régulation de la protéine de découplage mitochondrial 2 (UCP2), et que le PEDF atténue les effets du stress oxydatif en augmentant l’expression del’UCP211,41. La fonction principale de l’UCP2 est de contrôler les ROS dérivés des mitochondries et d’agir comme un capteur du stress oxydatif mitochondrial41,42. Ici, en plus d’examiner l’effet du PEDF et du GM-CSF sur les niveaux de glutathion, nous avons l’expression génique de l’UCP2 qui a tendance à augmenter(Figure 7); des études supplémentaires sont nécessaires pour établir le rôle du PEDF et du GM-CSF sur l’expression du gène UCP2.

Dans l’ensemble, le présent modèle H2O2offre une approche complète pour étudier l’effet bénéfique des thérapies géniques à base de transposons qui visent à fournir des gènes thérapeutiques antioxydants aux cellules du patient pour traiter la maladie neurodégénérative comme la DMLA.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Gregg Sealy et Alain Conti pour l’excellente assistance technique et le professeur Zsuzsanna Izsvák du Centre Max-Delbrück à Berlin pour avoir aimablement fourni les plasmides pSB100X et pT2-CAGGS-Venus. Ces travaux ont été soutenus par le Fonds national suisse de la recherche scientifique et la Commission européenne dans le cadre du septième programme-cadre. Z.I a été financé par le Conseil européen de la recherche, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Médecine numéro 166 thérapie génique oculaire dégénérescence maculaire liée à l’âge dommages causés par le stress oxydatif transposon de la Belle au bois dormant, administration de gènes non viraux cellules EPR PEDF GM-CSF
Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de <em>la belle endormie</em>
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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