Article de méthode

Nettoyage des tissus à base de CLARTÉ raffiné pour l’organisation tridimensionnelle des fibroblastes dans les cœurs de souris sains et blessés

DOI :

10.3791/62023

⸱

16 mai 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthode raffinée de dégagement de tissu a été développée et appliquée au coeur adulte de souris. Cette méthode a été conçue pour effacer le tissu cardiaque dense et autofluorescent, tout en maintenant la fluorescence étiquetée de fibroblaste attribuée à une stratégie génétique de rapporteur.

Résumé

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La maladie cardio-vasculaire est la cause la plus répandue de mortalité dans le monde entier et est souvent marquée par la fibrose cardiaque accrue qui peut mener à la rigidité ventriculaire accrue avec la fonction cardiaque changée. Cette augmentation de la fibrose ventriculaire cardiaque est due à l’activation des fibroblastes résidents, bien que la façon dont ces cellules fonctionnent dans le cœur à 3 dimensions (3D), à la ligne de base ou après l’activation, ne soit pas bien comprise. Pour examiner comment les fibroblastes contribuent aux maladies cardiaques et leur dynamique dans le cœur 3D, une méthode raffinée de nettoyage et d’imagerie des tissus basée sur CLARITY a été développée qui montre des fibroblastes cardiaques marqués par fluorescence dans tout le cœur de la souris. Les fibroblastes résidents des tissus ont été génétiquement marqués à l’aide de souris rapporteurs florescentes Rosa26-loxP-eGFP croisées avec le fibroblaste cardiaque exprimant la ligne knock-in Tcf21-MerCreMer. Cette technique a été employée pour observer la dynamique de localisation de fibroblaste dans tout le ventricule gauche adulte entier chez les souris saines et dans les modèles de souris fibrotiques de maladie cardiaque. Intéressant, dans un modèle de blessure, on a observé des modèles uniques des fibroblastes cardiaques dans le coeur blessé de souris qui a suivi des bandes des fibres enveloppées dans la direction contractile. Dans les modèles de dommages ischémiques, la mort de fibroblaste s’est produite, suivie du repeuplement de la zone frontière d’infarctus. Collectivement, cette technique de clarification des tissus cardiaques raffinée et ce système d’imagerie numérisé permettent la visualisation 3D des fibroblastes cardiaques dans le cœur sans les limitations de l’échec de pénétration des anticorps ou les problèmes précédents entourant la fluorescence perdue due au traitement des tissus.

Introduction

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Bien que les cardiomyocytes comportent la plus grande fraction de volume dans le coeur, les fibroblastes cardiaques sont plus abondants et sont en critique impliqués en réglant les dispositifs structuraux et réparateurs de ligne de base de cet organe. Les fibroblastes cardiaques sont fortement mobiles, mécaniquement sensibles, et phénotypiquement s’étendant selon l’ampleur de leur activation. Les fibroblastes cardiaques sont nécessaires pour maintenir des niveaux normaux de matrice extracellulaire (ECM), et trop peu ou trop de production d’ECM par ces cellules peut conduire à la maladie1,2,3. Compte tenu de leur importance dans la maladie, les fibroblastes cardiaques sont devenus un sujet de recherche de plus en plus important pour identifier de nouvelles stratégies de traitement, en particulier en essayant de limiter la fibrose excessive4,5,6,7. En cas de blessure, les fibroblastes s’activent et se différencient en un type de cellule plus synthétique connu sous le nom de myofibroblaste, qui peut être prolifératif et sécrète un ECM abondant, ainsi que d’avoir une activité contractile qui aide à remodeler les ventricules.

Alors que les fibroblastes cardiaques ont été largement évalués pour leurs propriétés dans les cultures 2-D6,8,9,10,beaucoup moins est compris de leurs propriétés et dynamiques dans le cœur vivant 3-D, soit à la ligne de base ou avec la stimulation de la maladie. Ici, une méthode raffinée a été décrite pour effacer le tissu du cœur de souris adulte tout en maintenant la fluorescence des fibroblastes marqués avec un système de rapporteur génétique Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Au sein du cœur, Tcf21 est un marqueur relativement spécifique des fibroblastes quiescents4. Une fois que le tamoxifène est administré pour activer la protéine MerCreMer inductible, pratiquement tous les fibroblastes tranquilles exprimeront en permanence la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) du locus Rosa26, ce qui permet leur suivi in vivo.

De nombreux protocoles de nettoyage des tissus bien établis existent, dont certains ont été appliqués au cœur11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux réactifs utilisés dans différents protocoles de nettoyage des tissus se sont avérés étancher les signaux de fluorescenceendogènes 18. De plus, le cœur adulte est difficile à effacer en raison des protéines abondantes contenant un groupe d’hèmes qui génèrent une autofluorescence19. Par conséquent, le but de ce protocole était de préserver la fluorescence de marqueur de fibroblaste avec l’inhibition simultanée de l’autofluorescence d’hème dans le coeur adulte blessé pour la visualisation 3D optimale in vivo12,13,14,16,17,20.

Les études précédentes tentant d’examiner le fibroblaste cardiaque in vivo ont employé des anticorps perfusés pour étiqueter ces cellules, bien que de telles études aient été limitées par la pénétration d’anticorps et la structure vasculaire cardiaque14,16,17,20. Bien que Salamon et al. aient montré un nettoyage tissulaire avec le maintien de la fluorescence neuronale topique dans le cœur néonatal, et que Nehrhoff et al. aient montré le maintien des cellules myéloïdes marquant la fluorescence, le maintien de la fluorescence endogène à travers toute la paroi ventriculaire n’a pas encore été démontré, y compris la visualisation des fibroblastes cardiaques adultes au départ ou après une blessure13,20. Ce protocole d’élimination des tissus affine un mélange de protocoles précédents basés sur la méthode CLARITY (imagerie rigide acrylamide-hybridée clairement échangée par les lipides/ hydrogel tissulaire compatible avec l’hybridation in situ) et le PEGASOS (système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG)). Ce protocole raffiné a permis un examen plus robuste des fibroblastes cardiaques dans le coeur de souris à la ligne de base et de la façon dont ils répondent à différents types de dommages. Le protocole est simple et reproductible et aidera à caractériser le comportement des fibroblastes cardiaques in vivo.

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Protocole

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Toutes les expériences impliquant des souris ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. L’établissement est également certifié AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Des souris ont été euthanasiées par luxation cervicale, et des souris subissant des procédures chirurgicales de survie ont été données le soulagement de douleur (voir ci-dessous). Toutes les méthodes utilisées pour la gestion de la douleur et l’euthanasie sont basées sur les recommandations du groupe d’experts sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association. Toutes les souris étaient logées dans des unités de litière en épis de maïs avec de l’eau et de la nourriture disponibles en tout temps. Des souris ont été logées 4 dans une cage avec le même sexe. Pour la chirurgie ou la clairance tissulaire non blessée, un nombre égal de souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées.

REMARQUE: Des conditions chirurgicales stériles ont été maintenues dans toutes les chirurgies. Le chirurgien s’est changé en gommages propres et en blouse stérile, puis a enfilé des couvre-chaussures et un filet à cheveux. Le chirurgien s’est ensuite frotté les mains avec de la chlorhexidine et a enfilé des gants chirurgicaux stériles. Le chirurgien a été aidé par un technicien qui a sous sédation, rasé, et nettoyé l’emplacement d’incision 3 fois chacun, alternant entre le gluconate de chlorohexidine de 2% et l’isopropanol de 70%. Les souris ont ensuite été amenées chez le chirurgien et une intervention chirurgicale a été effectuée. Entre les animaux, les instruments ont été stérilisés dans un stérilisateur de perles.

1. Recombinaison de la cre

  1. Souris Croisées Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) avec des souris Tcf21-MerCreMer(Figure 1A)6,21.
  2. Lorsque la progéniture de ce croisement atteint l’âge de 6 semaines, administrer une injection intrapéritonéale de 75 mg/kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs. 22 Administrer ce tamoxifène deux fois, à 48 h l’un de l’autre(figure 1B).
  3. Après les injections de tamoxifène, mettez les souris sur un régime de nourriture de tamoxifène (~ 0,4 g/kg de citrate de tamoxifène) pendant une semaine. Après une semaine de tamoxifène chow, ramener les souris à un régime chow autoclavé normal pendant une semaine avant d’effectuer la chirurgie(Figure 1B). Désigner un nombre approprié de souris (3 par condition chirurgicale) pour être des témoins non blessés. Sacrifiez ces souris et passez au processus de nettoyage délimité ci-dessous après une semaine de régime chow normal.
  4. Après le régime de tamoxifène et la recombinaison, effectuez une intervention chirurgicale.

2. Modèles chirurgicaux

  1. Ischémie/ré-perfusion (I/R)23,24
    1. Anesthésier les souris avec 1,5% d’isoflurane de gaz dans l’air de la pièce dans une boîte ventilée; rasez leur poitrine et leur cou avec des tondeuses électriques, puis frottez les zones rasées avec un écouvillon imbibé de gluconate de chlorhexidine à 2%.
    2. Utilisez une pommade lacrymale artificielle pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie en plaçant une pommade sur les yeux des souris sous sédateur.
    3. Effectuer une coupure à mi-cou à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour permettre la visualisation de la trachée. Intubate avec un cathéter de 20 G en plaçant le tube d’intubation dans la trachée et visualiser le cathéter trachéal à travers l’incision de mi-cou. Placez les souris sur un ventilateur sous sédèse avec du gaz isoflurane (1,5%) dans l’air de la pièce.
    4. Faites une incision sous le membre antérieur gauche avec des ciseaux chirurgicaux et coupez les muscles intercostaux entre les côtes 3 et 4. Étalez les côtes ouvertes à l’aide d’un rétracteur.
    5. Placez une petite éponge imbibée de solution saline entre le poumon et le cœur pour éviter d’endommager le poumon.
    6. À l’aide d’une aiguille fishhook (6,5 mm, 3/8 c), attachez l’artère coronaire gauche avec un nœud coulissant libérable en utilisant 8-0 prolène.
    7. Retirez l’éponge à l’aide d’une pince.
    8. Suturer les muscles intercostaux fermés à l’aide de soie tressée 4-0 et d’une suture continue tout en extériorisant la fin du 8-0 nœud coulissant de prolène.
    9. Fermez les incisions de peau à l’aide d’un adhésif topique pour les tissus avec l’extrémité du nœud de glissement occluant dépassant.
    10. Après une heure d’occlusion, tirez l’extrémité extérieure du nœud de glissement pour libérer intérieurement l’occlusion de l’artère coronaire, soulageant l’ischémie et provoquant une ré-perfusion.
    11. Administrer 0,02 mL d’une buprénorphine à libération prolongée de 1 mg/mL par injection sous-cutanée (libération de 72 h) comme analgésique, et placer les souris dans une chambre d’incubation oxygénée à 37 °C, séparée des autres animaux. Surveiller les souris au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’elles aient récupéré de l’anesthésie et soient capables de maintenir une position sternale ou assise. Ramener les souris à leur logement habituel.
    12. Évaluer les animaux pour la douleur et la détresse pendant 48 h après la chirurgie, et surveiller le site d’incision quotidiennement jusqu’à ce qu’il soit complètement guéri.
    13. Observez les souris pour l’hydratation, la nourriture et le bien-être général après la chirurgie jusqu’au sacrifice.
  2. Infarctus du myocarde (IM)25,26,27
    1. Effectuez les étapes 2.1.1 à 2.1.7.
    2. Utilisez une suture continue pour fermer les muscles intercostaux à l’aide de soie tressée 4-0.
    3. Fermez l’incision de la peau à l’aide d’un adhésif topique pour les tissus.
    4. Effectuez les étapes 2.1.11 à 2.1.13.
  3. Angiotensine II/phényléphrine perfusion de pompe micro-osmotique
    1. Préparer Préparer une solution de travail de 10 μg/μL d’angiotensine II et une solution de travail de phényléphrine de 500 μg/μL dans des conditions stériles (c.-à-d. dans une hotte à flux laminaire) en ajoutant 1 mg d’angiotensine II à 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et 250 mg de chlorhydrate de phényléphrine dans 500 μL de PBS.
    2. Calculer la dilution de chaque solution de travail et le volume final à distribuer à la pompe micro-osmotique en fonction du poids de la souris.
      REMARQUE : Par exemple, une souris de 20 g nécessite 20 g x 14 jours x 1,5 μg/jour = 420 μg d’angiotensine, ou 42 μL de solution de travail, ainsi que 20 g x 14 jours x 50 μg/jour = 14000 μg de chlorhydrate de phényléphrine, ou 28 μL de solution de travail.
    3. Pour le poids de chaque souris, diluer le stock de travail du médicament dans du PBS stérile et remplir les pompes micro-osmotiques (0,25 μL/h, 14 jours, environ 100 μL) à l’aide d’une aiguille de 27 G et d’une seringue de 1 mL.
      REMARQUE: Cela générera un débit de 1,5 μg∙g-1∙jour-1 d’angiotensine II et de 50 μg∙g-1∙jour-1 de chlorhydrate de phényléphrine une fois placé chez les souris.
    4. Anesthésier les souris avec 1,5% d’isoflurane inhalation (à effet) dans une chambre ventilée contenant de l’air de pièce.
    5. Placez les souris anesthésiées sur une table chirurgicale stérile en position opine et maintenez l’anesthésie par inhalation de gaz isoflurane (1,5%) à travers un cône de nez.
    6. Utilisez une pommade lacrymale artificielle sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie.
    7. Rasez la fourrure sur la zone d’implantation avec des tondeuses électriques et stérilisez la zone à couper à l’aide d’éthanol et d’un écouvillon stérile. Faites une petite incision (environ 1 cm) avec des ciseaux chirurgicaux dans la couche épidermique de la peau de souris sur le côté latéral droit du dos, sous l’omoplate. Utilisez les côtés ternes d’une paire de ciseaux chirurgicaux pour étirer doucement la peau dans et autour de la zone d’implantation pour insérer la minipompe.
    8. Placez la pompe micro-osmotique dans l’incision et manœuvrez-la physiquement à gauche de la ligne médiane dorsale de la souris en massant manuellement la pompe sous la peau.
    9. Fermez l’incision via une suture continue à l’aide de soie 4-0 avec une aiguille conique.
    10. Après l’implantation à la pompe, administrer de la buprénorphine à libération lente à une dose de 0,1 mg/kg de poids corporel par injection sous-cutanée pour l’analgésie (libération lente de 72 h). Placer les souris dans une chambre d’incubation oxygénée à 37 °C, séparée des autres animaux. Surveillez les souris au moins toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie et puissent maintenir une position sternale ou assise.
    11. Après la récupération de l’anesthésie dans la chambre de réchauffement à 37 °C, replacez les souris dans leurs unités de logement standard.
    12. Surveiller les souris pour la douleur et la détresse pendant 48 h après la chirurgie, et surveiller le site d’incision quotidiennement jusqu’à ce qu’il soit complètement guéri.
    13. Observez les souris pour l’hydratation, la nourriture et le bien-être général après la chirurgie jusqu’au sacrifice.

3. Nettoyage des cœurs de souris adultes à l’aide d’un protocole CLARITY actif modifié

  1. Préparez une zone chirurgicale propre en stérilisant la surface chirurgicale et tous les outils chirurgicaux avec 70% d’éthanol. Préparer une solution de PBS 1x froid et de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS (100 mL chacun). Portez des gants, du sarrau de laboratoire, un masque facial et une protection oculaire.
  2. Préparer le tampon d’héparine en diluant 10 unités d’héparine dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % p/v. Injecter par voie intrapéritonéale à chaque souris 60 μL d’héparine-NaCl à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 27 G.
  3. Cinq minutes après l’injection de solution d’héparine-NaCl, anesthésier les souris en utilisant 1,5% d’inhalation d’isoflurane (à effet) dans une chambre ventilée contenant de l’air de pièce.
  4. Euthanasier les souris par luxation cervicale, dans laquelle l’arrière de la tête est maintenu avec l’extrémité plate et fermée de la pince, tandis que la colonne vertébrale est disloquée en tirant la queue.
  5. Nettoyez la surface ventrale de la souris avec de l’éthanol à 70% sur un coton-tige. Faire une incision transversale de 3 cm à environ 3 cm sous le processus xiphoïde à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  6. Séparez la peau du tissu de la paroi abdominale sous-jacente en dégoulinant l’abdomen jusqu’au processus xiphoïde (maintenez la peau la plus proche de la queue et tirez la peau la plus près de la tête vers le haut vers la cage thoracique). Faire une incision transversale de 2 cm dans le tissu de la paroi abdominale sous-cutanée 3 cm en dessous du processus xiphoïde à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Faites une coupe verticale à partir de cette incision transversale, jusqu’à la ligne médiane et à travers la cage thoracique. Épinglez la cage thoracique en arrière, exposant le cœur.
  7. Utilisez une aiguille de 27 G et une seringue de 10 ml pour injecter du PBS froid dans la veine cave et l’aorte supérieures (toute manipulation positionnelle du cœur doit être faite avec soin avec une pince émoussée pour éviter la perforation) pour dégager le sang du cœur.
    REMARQUE: Une perfusion suffisante peut être notée par contraction de la queue et décoloration des poumons.
  8. Utilisez une aiguille de 27 G et une seringue de 10 ml pour injecter de la PFA froide à 4 % dans la veine cave supérieure et l’aorte pour commencer le processus de fixation.
  9. Exciser les cœurs. Les oreillettes, le ventricule droit et le septum, et le ventricule gauche devraient être séparés utilisant un scalpel de droite-lame. Placer ce tissu dans un tube à centrifuger de 15 mL rempli de PFA à 4 % froid et le placer sur un nutator à 4 °C pendant la nuit.
  10. Lavez le cœur 3 fois pendant 1 h chacune avec 1x PBS froid pour éliminer l’excès de PFA.
  11. Préparer l’hydrogel (appelé A4P0 pour la composition relative d’acrylamide/polyacrylamide) en mélangeant les produits chimiques suivants dans un tube centrifuge de 15 mL : 10 % d’acrylamide à 40 %, 10 % de PBS 1x, 80 % d’eau distillée.
  12. Ajouter la solution à 0,25 % du photoinitiateur (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propane)dichlorhydrate) à la solution d’hydrogel juste avant d’immerger le cœur dans l’hydrogel.
  13. Placez le cœur dans un tube conique contenant l’hydrogel. Envelopper le tube conique dans du papier d’aluminium et incuber pendant une nuit à 4 °C sans perturbation physique.
  14. Après environ 14 h à 4 °C, déplacer le tube conique contenant le cœur vers un bain de perles à 37 °C.
  15. Après 2,5 h dans le bain de perles, retirez soigneusement le cœur de l’hydrogel avec une pince.
  16. Laver les cœurs 3 fois pendant 1 h chacun dans un tube conique de 15 mL contenant 1x PBS à 37 °C sur un nutator.
  17. Placez les cœurs dans le panier de la machine d’électrophorèse active à l’aide d’une pince et placez le couvercle sur le panier. Assurez-vous que le couvercle est bien en place.
  18. Remplissez le réservoir de la chambre d’électrophorèse active avec une solution de nettoyage électrophorétique en versant la solution dans la chambre.
  19. Une fois que la chambre est pleine de solution de compensation électrophorétique, le panier contenant le cœur peut être submergé. Placez le bouchon sur la machine d’électrophorèse en toute sécurité.
  20. Faire fonctionner la machine d’électrophorèse à 1,5 A, 37 °C pendant 1,5 h.
  21. Après 1,5 h d’électrophorèse, vérifiez visuellement les cœurs pour s’assurer qu’il ne reste aucun tissu opaque. Si les régions du tissu sont encore opaques, republiez le cœur dans une solution d’électrophorèse dans la chambre électrophorétique et poursuivez l’électrophorèse pendant 0,5 h à la fois.
    REMARQUE: L’électrophorèse doit être interrompue dès les premiers signes de lésions tissulaires (comme l’effilochage des tissus).
  22. Laver les cœurs dans un tube conique de 15 mL contenant 1x PBS pendant 1 h, 3 fois chacun, à 37 °C sur un nutator.
  23. Submerger les cœurs dans un tube conique de 15 mL contenant N,N,N′,N′-Tétrakis(2-Hydroxypropyl)éthylènediamine , un agent décolorant qui réduit l’autofluorescence de l’hème.
    REMARQUE: Cette solution doit être changée toutes les 24 h jusqu’à ce que les cœurs soient complètement clairs (environ 2 jours).
  24. Laver les cœurs dans un tube conique de 15 mL avec 1x PBS 3 fois pendant 1 h chacun pour éliminer l’excès d’agent décolorant.
  25. Préparer la solution d’appariement de l’indice de réfraction (RIMS) en combinant 30 mL de tampon phosphate 0,02 M, 40 g d’isotherme 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4,6-tri-iodo-N,N'-bis(2,3 dihydroxypropyl) isphtalamide sous agitation (doit être complètement dissous , cela peut prendre jusqu’à une heure), 5 mg d’azide de sodium, 50 μL de Tween20 et 1 g de 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, et ajuster le pH à 7,5.
  26. Équilibrer les coeurs dans RIMS pendant 48 h avant l’imagerie.

4. Imagerie des cœurs dégagés à l’aide d’un microscope confocal à photon unique vertical

REMARQUE : L’appareil d’imagerie se compose de la moitié inférieure d’une boîte de Petri en verre de 10 cm, d’un réservoir inférieur imprimé en 3D, d’une lamelle ronde en verre et d’un réservoir supérieur imprimé en 3D(Figure 1C–E). Les documents imprimés en 3D ont été fabriqués à l’interne par le département d’ingénierie clinique de l’hôpital pour enfants de Cincinnati.

  1. Utilisez de la graisse sous vide pour sceller le réservoir inférieur imprimé en 3D dans une boîte de Petri en verre en plaçant une fine couche de graisse sous vide sur le fond de la pièce imprimée en 3D(Figure 1C).
    NOTA : Le réservoir doit avoir la même hauteur que l’échantillon ionisé (c.-à-d. que l’échantillon ne doit pas être comprimé par la lame de couverture de verre placée dessus, et que l’échantillon ne doit pas non plus pouvoir flotter et se déplacer à l’intérieur du réservoir).
  2. Remplissez le réservoir avec RIMS et retirez toutes les bulles avec une pointe de pipette. Placez soigneusement le cœur dans le RIMS avec la paroi ventriculaire gauche vers le haut, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit introduite dans la solution.
  3. Adhérez à une lamelle de couverture en verre sur la surface inférieure de la pièce supérieure du réservoir imprimée en 3D(figure supplémentaire 1A)à l’aide de graisse sous vide (encore une fois en plaçant une fine couche de graisse sous vide sur la pièce imprimée en 3D et en la plaçant sur le bordereau de couverture)(Figure 1D).
  4. Placez la lamelle de couverture en verre et le réservoir supérieur, la lamelle de couverture côté vers le bas, sur le réservoir inférieur(figure supplémentaire 1B),sans l’introduction de bulles. L’adhérence entre le RIMS et le patin de couverture fournira un joint entre les pièces du réservoir supérieur et inférieur(Figure 1E).
  5. Remplissez le réservoir supérieur avec du glycérol pour une utilisation avec un objectif d’immersion en glycérol 10x.
  6. Utilisez un seul microscope à photons équipé d’une tête de balayage confocale multiphotonique pour imager les cœurs dégagés.
  7. Abaissez l’étage du microscope à photon unique et placez la boîte de Petri contenant l’échantillon au centre de l’étage. Soulevez l’étage et abaissez l’objectif d’immersion de 10x glycérol dans le glycérol dans le réservoir supérieur de l’appareil d’échantillonnage. Assurez-vous que l’échantillon est au point en regardant le bord de l’échantillon à l’aide des oculaires.
  8. Passez de la vue de l’oculaire à la vue de la caméra sur l’ordinateur en cliquant sur le bouton en direct.
    1. Définissez les paramètres X et Y en localisant d’abord la partie la plus large de l’échantillon de tissu, qui devrait se trouver au fond de la boîte de Pétri.
    2. Cliquez sur Acquisition ND et multipoint personnalisé. Créez des multipoints en trouvant d’abord le milieu de l’échantillon de tissu en utilisant le joystick pour balayer de gauche à droite et de haut en bas.
    3. Ensuite, en fonction de la taille du tissu, déterminez la taille du pavage nécessaire (généralement 6 x 5 pour un cœur de souris âgé de 6 à 8 semaines). Pour ce faire, exécutez l’imagerie de test en capturant uniquement les paramètres X et Y (décochez z sous l’onglet Acquisition ND) pour vérifier si toute la longueur et la largeur du tissu ont été capturées.
  9. Pour définir les paramètres z, ouvrez la navigation XYZet cliquez sur les icônes haut et bas jusqu’à ce que vous trouvez le haut et le bas de l’exemple.
    1. Ouvrez le panneau de correction de l’intensité Z et ajustez la fluorescence en haut, au milieu et en bas du tissu pour corriger la densité tissulaire en augmentant ou en diminuant la puissance laser à chaque point z. Définissez-les en cliquant sur la flèche de jeu à droite du panneau Correction de l’intensité Z.
    2. Définissez la taille de l’étape Z dans le panneau Acquisition ND sur 5 μm.
  10. Une fois que les paramètres X, Y et Z du cœur sont délimités et que la correction de l’intensité z est définie, utilisez le microscope vertical automatisé avec un objectif d’immersion en glycérol 10x avec un scanner résonnant et des tubes photomultiplicateurs de phosphure d’arséniure de gallium (PMTs GaAsP) pour imager les cœurs dégagés. Assurez-vous que les onglets XY et Z sont cochés sous Acquisition ND, puis appuyez sur Exécuter la correction Z.
  11. Coudre, démixer et débruiter les images résultantes en ouvrant l’image multipoint dans le logiciel de traitement et en cliquant sur le bouton de point. Sous image, cliquez sur unmixing aveugle, 2 canaux, puis recherchez. et Sous image, cliquez sur denoise.ai, puis cliquez sur le canal fluorescent de choix (c’est-à-dire, GFP).
    REMARQUE: Ce processus se traduit par une image 3D des fibroblastes GFP-positifs dans tout le ventricule gauche.
  12. Utilisez un logiciel d’analyse secondaire pour identifier davantage les modèles et les tendances dans la dispersion des fibroblastes cardiaques. Utilisez la fonction Spots en exécutant le programme de l’Assistant Spots.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les fibroblastes cardiaques sont essentiels pour la fonction de base du coeur aussi bien que pour la réponse aux dommages cardiaques. Des tentatives précédentes de comprendre l’arrangement et la morphologie de ces cellules ont été conduites en grande partie dans des arrangements 2-D. Cependant, une technique raffinée de nettoyage des tissus cardiaques (Figure 2) et d’imagerie 3D a été publiée, ce qui permet la visualisation avancée et plus détaillée des fibroblastes cardiaques. Grâce à cette...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente une méthode raffinée pour le dégagement de tissu qui tient compte de la visualisation des fibroblastes cardiaques in vivo, à la ligne de base et après des dommages, pour caractériser et mieux comprendre des fibroblastes dans le coeur de souris. Ce protocole amélioré répond aux limites des protocoles existants de nettoyage des tissus qui ont tenté d’identifier des types de cellules spécifiques dans le cœur adulte ou néonatal12,13,

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucune divulgation liée au contenu de ce manuscrit.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier le CCHMC Confocal Imaging Core pour son aide et ses conseils dans le développement de ce modèle, ainsi que Matt Batie de Clinical Engineering pour la conception de toutes les pièces imprimées en 3D. Demetria Fischesser a bénéficié d’une subvention de formation des National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) et Jeffery D. Molkentin a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-0 soie tresséeEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40 % Acrylamide SolutionBio-Rad1610140
Angiotensine IISigmaA9525-50G
Pommade Lacrymale ArtificielleCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture adhésif tissulaire topiqueWorld Precision Instruments503763
HéparineSigmaH0777
Imaris Start Logiciel d’analyseOxford InstrumentsN/A
Pompes micro-osmotiquesAlzetModèle 1002
Logiciel d’analyse Nikon ElementsNikonN/A
Microscope droit Nikon A1R HDNikonN/A
Normal autoclaved chowLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophtalamide		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710
Chlorhydrate de phényléphrineSigmaP6126-10G
PhotoinitiateurWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax N° de stock :012429
Sigma AldrichS2002-5Gde chlorure de
sodiumHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifèneSigma AldrichT5648
Tamoxifène alimentaireEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, agent décolorantMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity Chambre de nettoyage électrophorétiqueLogos BiosystemsC30001
Solution de nettoyage électrophorétique X-ClarityLogos BiosystemsC13001
Panier à mouchoirs pour électrophorèse X-ClarityLogos BiosystemsC12001
Porte-corbeille pour électrophorèse pour mouchoirsLogos BiosystemsC12002
Sodium Azide Solution

Références

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Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

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