L’explantation de tissu cornéen porcin étudiera l’efficacité des antiviraux du virus de l’herpès simplex-1

Résumé

Nous décrivons l’utilisation d’une cornée porcine pour tester l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux.

Résumé

Les virus et les bactéries peuvent causer une variété de défauts de la surface oculaire et de dégénérescence tels que des plaies et des ulcères par infection cornéenne. Avec une séroprévalence qui varie de 60 à 90% dans le monde, le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1) provoque généralement des lésions muco-cutanées de la région orofaciale qui se manifestent également par des lésions et une cécité associée à l’infection. Bien que les médicaments antiviraux actuels soient efficaces, l’émergence d’une résistance et la persistance d’effets secondaires toxiques nécessitent le développement de nouveaux antiviraux contre cet agent pathogène omniprésent. Bien que l’évaluation in vitro fournisse certaines données fonctionnelles concernant un antiviral émergent, elles ne démontrent pas la complexité du tissu oculaire in vivo. Cependant, les études in vivo sont coûteuses et nécessitent un personnel qualifié, en particulier lorsqu’il s’est employé avec des agents viraux. Par conséquent, les modèles ex vivo sont des étapes efficaces mais peu coûteuses pour les tests antiviraux. Nous discutons ici d’un protocole pour étudier l’infection par le HSV-1 en utilisant des cornées porcines ex vivo et d’une méthode pour les traiter par voie topique en utilisant des médicaments antiviraux existants et nouveaux. Nous démontrons également la méthode pour effectuer un dosage de plaque en utilisant HSV-1. Les méthodes détaillées peuvent être utilisées pour mener des expériences similaires afin d’étudier les infections qui ressemblent à l’agent pathogène HSV-1.

Introduction

Les personnes souffrant d’infections oculaires subissent souvent une perte de vision¹. Avec une séroprévalence élevée dans le monde entier, les personnes infectées par le HSV souffrent d’infections oculaires récurrentes qui entraînent des cicatrices cornéennes, une kératite stromale et une néovascularisation^2,3,4,5. Les infections à HSV ont également montré qu’ils causaient moins fréquemment, une gamme de conditions graves chez les patients immunodéprimés et non traités comme l’encéphalite et la morbidité systémique

Protocole

Tous les tissus porcins utilisés dans cette étude ont été fournis par une organisation privée tierce et aucune manipulation des animaux n’a été effectuée par le personnel de l’Université de l’Illinois à Chicago.

1. Matériaux

1. Réactifs
   1. Utilisez les réactifs suivants pour le dosage de la plaque : méthylcellulose en poudre, milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), sérum bovin fœtal (FBS), pénicilline et streptomycine (P/S) pour le dosage de la plaque.
   2. Utilisez des comprimés de violette cristalline et de l’éthanol (grade de biologie moléculaire) pour préparer une solution de violette cristalline....

Résultats

Pour comprendre l’efficacité des antiviraux expérimentaux, ils doivent être testés de manière approfondie avant d’être envoyés pour des essais cliniques humains in vivo. À cet égard, les groupes témoins positifs, les groupes témoins négatifs et les groupes de test doivent être identifiés. La trifluorothymidine (TFT) a longtemps été utilisée comme traitement préféré pour traiter la kératite herpès par voie topique¹⁶. Utilisés comme témoin positif, les groupes cornéens traités par TFT présentent une.......

Discussion

Des recherches antérieures ont montré que le BX795 joue un rôle prometteur en tant qu’agent antiviral contre l’infection par le HSV-1; en inhibant la kinase 1 (TBK1)¹⁶liant TANK. Le TBK1 et l’autophagie ont tous deux joué un rôle dans l’inhibition de l’infection par le HSV-1, comme l’ont démontré les cellules épithéliales cornéennes humaines. BX795 s’est avéré être le plus efficace possible avec une activité antivirale à une concentration de 10 μM et en utilisant à la fois l’analyse par transfert .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguilles hypodermiques de 30 g.	BD	305128
bouteille en verre de 500 ml.	Thomas Scientific	844027
Antimycosiques et antibiotiques (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot dans des tubes de 5 mL et conserver congelé jusqu’à ce que le
vortex de paillasse	BioDot	BDVM-3200
Armoire de biosécurité avec certification de biosécurité de niveau 2 (BSL-2).	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Écouvillons standard stériles en alginate de calcium.	Puritan	22029501
Grattoir cellulaire - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Violet cristal	Sigma Aldrich	C6158	Conservez la poudre dans un endroit sombre
Dulbecco' Eagle modifié' s medium - DMEM	GIBCO	41966029	Stocker à 4 ° ; C jusqu’à utilisation
Éthanol	Sigma Aldrich	E7023
Sérum fœtal bovin -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquote dans des tubes de 50 mL et conserver congelé jusqu’à utilisation
Pince à épiler à bord plat &ndash ; 2.Harward	Instruments	72-8595
Congélateurs --80 ° ;C. -	Thermofisher Scientific	13 100 790
Boîte de lames neuves.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 pouces carrés pli 12 plis
HSV-1 17GFP	cultivé en	maison-Souche	originale du Dr Patricia Spears, Université Northwestern. GFP exprimant la souche HSV-1 17
Insuline, Transferrine, Sélénium - ITS	GIBCO 41400045		Aliquote dans des tubes de 5 mL et conserver congelé jusqu’à l’utilisation de l’agitateur
magnétique.	Thomas Scientific	H3710-HS
Ciseaux métalliques.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 à 1000 µ ;L.	Thomas Scientific	1159M37
Milieu Essentiel Minimum - MEM	GIBCO	11095080	Stocker à 4 ° ; C jusqu’à l’utilisation
d’OptiMEM  ;	Magasin GIBCO	31985047	à 4 ° ; C jusqu’à l’utilisation de
la pénicilline/streptomycine.	GIBCO	15140148	Aliquote dans des tubes de 5 mL et conserver congelé jusqu’à utilisation
Tampon phosphate salin -PBS	GIBCO	10010072	Conserver à température ambiante
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Commande spéciale sur demande
Couvre-paillasses de procédure - au besoin.	Thermofisher Scientific	S42400
Pipettes sérologiques	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Équipement de pipetage sérologique.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stéréoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Aimant d’agitation.	Thomas Scientific	F37120
Fioles de culture tissulaire, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Incubateurs de culture tissulaire pouvant maintenir 5 % de CO2 et 37 ° ; température C.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Plaques traitées pour la culture tissulaire (6 puits).	Thomas Scientific	T1006
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	GIBCO	25-300-062	Aliquote dans des tubes de 10 mL et conserver congelé jusqu’à utilisation
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586

soit utilisé.