Summary
Denna artikel visar beredningen av ett skräddarsytt bildframställning fönster kompletteras med infusion kanyl och dess implantation på CA1 regionen hippocampus hos möss.
Abstract
Att avbilda neuronala aktiviteter vid encellig upplösning hos vakna beteendedjur är ett mycket kraftfullt tillvägagångssätt för undersökning av neurala kretsfunktioner i systemneurovetenskap. Hög absorbans och spridning av ljus i däggdjursvävnad begränsar dock intravital avbildning mestadels till ytliga hjärnregioner, vilket lämnar djuphjärnområden, såsom hippocampus, utom räckhåll för optisk mikroskopi. I den här videon visar vi förberedelse och implantation av det skräddarsydda bildfönstret för att möjliggöra kronisk in vivo-avbildning av regionen dorsala hippocampal CA1 i huvud-fixerade beteende möss. Det skräddarsydda fönstret kompletteras med en infusionskanyl som möjliggör riktad leverans av virusvektorer och läkemedel till bildområdet. Genom att kombinera detta preparat med bredfältsavbildning utförde vi en långsiktig registrering av neuronal aktivitet med hjälp av en fluorescerande kalciumindikator från stora delmängder av nervceller i beter sig möss under flera veckor. Vi visade också tillämpligheten av denna förberedelse för spänning imaging med en-spike upplösning. Högpresterande genetiskt kodade indikatorer på neuronal aktivitet och vetenskapliga CMOS kameror tillät återkommande visualisering av subcellulära morfologiska detaljer av enskilda nervceller med hög temporal upplösning. Vi diskuterar också fördelarna och potentiella begränsningarna med den beskrivna metoden och dess kompatibilitet med andra bildtekniker.
Introduction
Hippocampus är en viktig hjärnregion som ansvarar för lärande och minne1 samt för rumslig navigering2. Hippocampal atrofi är associerad med neurologiska och psykiatriska störningar som involverar minnesförlust och kognitivnedgång 3,4,5. Hos möss är hippocampus en mycket väletablerad modell för att studera rumsligt, kontextuellt och associativt lärande och minnesbildning på celluläraoch nätverksnivåer 4,5. De mekanistiska studierna av lärande och minne kräver longitudinella förhör av neuronal struktur och funktion i att bete sig möss. Fluorescensavbildning i kombination med genetiskt kodadesonder 6 ger oöverträffade funktioner för att registrera membranspänningsdynamik7,8, kalciumtransienter9, och strukturellaförändringar 10 över stora delmängder av nervceller intravitally. Optisk åtkomst till hippocampus hos möss hindras dock av cortex, som kan nå över 1 mm i tjocklek. Här beskrev vi en procedur för montering av en skräddarsydd bildbehandlingsenhet och dess kroniska implantation i mushuvudet för långsiktig optisk åtkomst till CA1-underregionen i dorsala hippocampus i att bete möss. Infusionskanyl integrerad i bildimplantatet möjliggör administrering av virus eller läkemedel direkt på nervcellerna inom synfältet. Den beskrivna beredningen i kombination med bredfältsmikroskopi möjliggör återkommande avbildning av de stora delmängderna av nervceller i beter sig möss under långa tidsperioder. Vi använde detta preparat för att uttrycka kalcium och spänning genetiskt kodade indikatorer i hippocampal CA1 regionen via riktad injektion av rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) för neuronal aktivitet inspelningar vid encellig upplösning. Vi utförde också longitudinella kalcium imaging av motsvarande neuronal delmängder med hög spatiotemporal upplösning i beter djur. Dessutom är denna förberedelse kompatibel med multifotonmikroskopi och mikroskopi, vilket ytterligare utökar verktygslådan för bildteknik för att studera neuronala nätverk på cellulära och subcellulära nivåer hos betande möss. Vi beskrev kritiska steg och felsökning av protokollet. Vi diskuterade också möjliga fallgropar och begränsningar av metoden.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Westlake University.
1. Implantatmontering
OBS: Monteringen av bildimplantatet är tekniskt enkel och kräver endast kommersiellt tillgängliga föremål(figur 1, se även Materialförteckning). Huvudplattorna kan tillverkas i den lokala verkstaden med rostfria eller titanplattor. Vi föreslår att du förbereder ett lager av helt monterade implantat innan du påbörjar operationerna. När in vivo-experiment är klara kan implantaten återvinnas och återanvändas flera gånger. I vissa fall kan det bara kräva att infusionskanan sätts tillbaka genom lödning eller byte av täckglas.
- Förbered alla sex viktiga hårdvarukomponenter för montering och installation av bildimplantat (figur 1).
Bild 1:Sex viktiga hårdvarukomponenter för montering och installationav bildimplantatet. B)Guide kanyl. (C)Bild kanyl. D)Glaskåpa. E)Huvudplatta. F)Inre kanyl. Skalbar: 5 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Slå på svetsmaskinen och värm upp den till önskad temperatur.
OBS: Temperaturen beror på vilken svetsform som används. - Polera avbildningskanylens sidoyta med fint sandpapper för att ta bort oxidationsskiktet och därmed underlätta starkare lödning.
- Justera positionen för avbildningskanylen och injektionskanylen (styr kanyl med insatt provdocka cannula) med hjälp av händerna (Figur 2A,B).
- Använd en spruta med en nål, applicera en liten mängd lämplig typ av flöde på anslutningsplatsen mellan avbildning och injicering av kanyler i 5 sekunder och ta sedan bort droppen.
OBS: För denna beredning använde vi ett kommersiellt tillgängligt flöde som anges av tillverkaren för lödning av rostfria delar eftersom avbildnings- och infusionskanyler är gjorda av rostfritt stål. När det gäller andra material som används för att tillverka kanyler bör slutanvändaren välja flöde som kan svetsa det valda materialet. - Smält lödform och applicera den på anslutningsplatsen som behandlats med flöde (figur 2).
OBS: Undvik överflödig lödform, eftersom det kommer att kräva onödig större kraniotomi under operationen.
Figur 2:Schematisk montering av injektionskanyl, bestående av styrbalk med insatt provdocka kanyl, med avbildningskanylen. A)Vinkeln mellan injektionskanylen och avbildningskanylen ska vara proximat 45 grader. B) Spetsen på injektionskanylen ska vara precis på kanten av avbildningskanylen. C)En lämplig storlek på svetsformen som används för lödning av avbildning och injektionskanyler (röd linje anger konturen av tenndroppar). (D) Olämplig storlek på svetsformen som bör undvikas under implantatberedningen (röd linje indikerar konturen av tenndroppar). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Vänta tills lödformen har svalnat. Vanligtvis tar det flera sekunder.
- Kontrollera att injektionsbaleln inte blockeras genom att föra in provdockans kanyl från båda riktningarna.
- Applicera UV-härdande optiskt lim på undersidan av avbildningskanylen med en tandpetare eller 26 G sprutnål.
- Använd en fin pincett för att försiktigt placera ett täckglas av motsvarande storlek som avbildningskanylen.
OBS: Glasets placering måste göras exakt på avbildningskanylen utan att glaset rör sig för mycket när det har vidrört det optiska limet. Annars blir glaset smutsigt, vilket minskar kvaliteten på avbildningen. - Härda limmet i minst en timme med 350-400 nm UV-belysning från en vanlig handhållen UV-lampa.
OBS: Det använda limet måste vara optiskt genomskinligt. Annars kommer det att minska kvaliteten på bildfönstret.
VARNING: Undvik hud- och ögonexponering genom att bära UV-skyddande glasögon, handskar och en labbrock. - Tvätta kanylen i 70% etanol, lufttorka och förvara i en steril behållare fram till operationen.
OBS: Det är mycket viktigt att hålla täckglaset så rent och intakt som möjligt. Det använda optiska limet är kemiskt stabilt i 70% etanol.
2. Fönsterimplantation
- Förberedelsesteg före operationen
- Sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav.
- Förbered 1x PBS och 70% etanol i två separata petriskålar.
- Valfritt: Desinficera operationsområdet med UV-ljus i minst 20 minuter innan du påbörjar det kirurgiska ingreppet.
OBS: Om du arbetar under så sterila förhållanden som möjligt kommer det att resultera i framgångsrika och långvariga (så länge som 6 månader) glastäckta kraniefönster. Kontaminering kan i de flesta fall leda till minskad fönstertransparens eller allvarlig inflammation.
- Kirurgiskt ingrepp
- Sterilisera operationsområdet med 70% etanol precis före operationen.
- Väg djuret och administrera en förkirurgisk dos av smärtstillande subkutant enligt IACUC-godkända djurprotokollet.
- Söv en mus med isofluran (4% för induktion, 1,5-2% för underhåll, 0,3-0,5 L/min luftflöde). Använd en tail-pinch och tå-pinch teknik för att säkerställa att djuret är helt nedsövt. Observera vitala tecken på djuret, såsom andning, SpO2, och hjärtfrekvens under procedurens varaktighet.
- Använd en trimmer eller depilatorisk kräm för att ta bort pälsen från nacken upp till ögonen.
- Placera musen i en stereotaxisk ram över en värmedyna för operation (med 37 °C). Fäst huvudet med öronstänger. Tryck huvudet något i alla riktningar för att se till att huvudet är ordentligt fastsatt.
- Applicera ögonsalva för att förhindra att djurets ögon torkar ut under operationen.
- Sterilisera operationsstället med betadin följt av 70% etanol tre gånger innan du gör ett snitt.
- Ta bort huden över toppen av skallen, börja med ett horisontellt snitt längs huvudets botten, följt av två skär i rostral riktning, nästan nå ögonlocken, sedan två sneda snitt som konvergerar vid mittlinjen.
- Med två sterila bomullspinne, dra tillbaka anslutningsvävnaden, liksom muskulaturen i nacken, till skallens kanter.
OBS: Försök att undvika att skada blodkärlen (särskilt de som är dolda i muskeln) under manipulering. - Applicera en droppe lidokainlösning (~ 0,1 ml) på ytan av bukhinnan i 2 minuter för att undvika överdriven smärta. Valfritt för att minska hjärnan från svullnad efter att ha tagit bort skallen, 0,1 ml 1% dexametason kan injiceras subkutant.
- Skrapa försiktigt hela det exponerade området i skallen med en skalpell för att skapa en torr och grov yta som gör att lim och tandcement kan klibba bättre och därmed resultera i kronisk implantation.
- Placera spetsen på nålen monterad på stereotaxiska stationen på knäxen, ställ in alla tre koordinaterna (AP: Främre-Bakre; ML: Medial-Lateral; DV: Dorsal-Ventral) som 0.
- Placera nålens spets på lambdan och se om AP-koordinaten är 0 för att bekräfta att huvudpositionen är vertikal, samt om ML-koordinaten är 0 för att bekräfta att huvudet är placerat horisontellt. Om inte, justera motsvarande rattar på stereotaxic-stationen tills AP- och ML-koordinaterna båda är inom 0,1 mm.
- Flytta nålens spets för att hitta motsvarande punkter för kraniotomi och markera deras positioner på skallen med hjälp av en fin markör. När det gäller implantation för hippocampus finns det 4 punkter med följande koordinater (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) och (AP: -2,18, ML: -3,5)11, samt (AP: -4,0, ML: -2,0) för injektionskanans mest kaudala punkt.
OBS: Markören som används i detta steg måste steriliseras med UV-belysning i minst en timme före operationen. Koordinaterna som visas här är för 6-8 veckor gamla C57BL/6J möss. Koordinaterna kan skilja sig åt på grund av olika åldrar eller stammar av möss. - Rita en cirkel baserad på fyra markerade punkter, liksom konturen av injektionskanaelområdet på cirkelns kaudala sida (figur 3).
- Använd en pneumatisk borr med en hastighet av 10 000 varv/min för att försiktigt "rita" längs konturen som är markerad på skallen.
- Borra skallen tills ett mycket tunt lager ben är kvar, vilket vanligtvis börjar vicka under mild beröring i mitten.
- Applicera en droppe steril 1x PBS i mitten av kraniotomin, lyft benluckan från skallen med mycket tunna spetstångar eller två 26 G-nålar som närmar sig från motsatta sidor.
OBS: PBS hjälper till att ta bort skallen och förhindra eventuell blödning av duran12. - Applicera PBS, följt av mild aspiration genom en 26G trubbig nål flera gånger för att rengöra ytan på duran.
- Ta försiktigt bort duran, antingen genom aspiration eller med oftalmisk sax. Applicera skonsam sug (~-60kPa) för att brinna cortex, liksom corpus callosum ovanför hippocampus.
OBS: Cortex är ofta mer gul än corpus callosum, och corpus callosum är vanligtvis vitare än hippocampus. Corpus callosum är vanligtvis lätt att skilja genom neuronala fibrer som går i vertikala och horisontella riktningar när de observeras uppifrån (Figur 3).
Figur 3: Stereotaxiska koordinater för hippocampusplats ochhjärnans ablationsprocess. B)Fullständigt kraniotomiområde. (C-E) Representativa bilder som förvärvats under operationen (vänster) och deras schematiska diagram (höger) som anger de olika färgerna och riktningarna på neurala fibrer i (A) Cortex (B) Corpus Callosum och (C) Hippocampus synliga under cortexablation. Skalstreck: 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Blödning vid denna tidpunkt kommer att påverka synligheten av hjärnvävnaden i kraniotomin. Applicera 1x PBS, följt av mild sugning, samtidigt som du aspirerar cortex för att bli av med blodet.
OBS: Kontinuerlig blödning är oundviklig under detta steg, och i viss utsträckning är kontinuerlig blödning ett tecken på normalt blodtryck. Till skillnad från cortex imaging fönster implantation, närvaron av blod under det optiska fönstret är acceptabelt eftersom det kommer att rensas flera dagar efter operationen. Införandet av avbildningskanylen i den skapade håligheten så snart som möjligt efter att cortex har tant är optimal. - Om kraniotomin är större med <0,5 mm än avbildningskanylen, rädda installationen av kanylen i viss utsträckning genom att använda extra Kwik Sil-tätning innan du fixar implantatet med SuperBond.
- Om craniotomy är mindre med <0,5 mm än imaging cannula, rädda det kirurgiska ingreppet i viss utsträckning genom att trimma kanten av craniotomy med en fin pincett eller ett par oftalmiska sax eftersom det återstående benet vid kanten av craniotomy är tunnare än skallen själv som ett resultat av borrning.
OBS: Kraniotomier som överskrider intervallet över 0,5 mm kan inte räddas. Motsvarande åtgärder i dessa fall bör följa avslutningsförfarandet enligt djurprotokollet.
- Sätt försiktigt in implantatet i kraniotomin.
- Tryck hårt ovanpå implantatet med den L-formade nålen för att placera implantatets optiska fönster så nära hippocampus exponerade yta som möjligt. Applicera upprepade pbs på skallen runt implantatet följt av sug för att ta bort blod så mycket som möjligt under implantatinsättning. Applicera sedan ett tunt lager Kwik Sil mellan implantatet och skallen för att förhindra att tandcement tränger in under skallen (Figur 4).
- Se till att placeringen av implantatens optiska fönster är rätt mot hippocampus för att undvika blod eller annan vätskeackumulering under.
OBS: Den kritiska punkten är att se till att täckglaset på avbildningskanylen placeras direkt mot hippocampus, vilket kan kräva ett försiktigt tryck ovanpå kanylen under installationen och tätningsprocessen. Huruvida den övre sidan av avbildningskanylen är parallell med skallen är inte avgörande för den slutliga optiska åtkomsten så länge det optiska fönstret placeras mot hippocampus. - Enligt den genomsnittliga tjockleken på cortex ovanför CA1-området, håll den övre ytan av avbildningskanylen ovanför skallytan med ~ 0,5 mm för att underlätta fastsättning av kanylen i skallen (Figur 4).
- Se till att placeringen av implantatens optiska fönster är rätt mot hippocampus för att undvika blod eller annan vätskeackumulering under.
- När Kwik Sil är härdad, som vanligtvis inte tar mer än ~ 1 min, applicera Super-Bond C&B jämnt på skallens yta, Kwik-Sils yta och implantatens övre yta.
- När Super-Bond C&B har härdats, applicera tandprotesbasharts ovanför Super-Bond C&B, liksom huden runt snittet som gjordes i början av operationen.
Obs: Alternativa typer av cement är tillgängliga från flera leverantörer. Följ motsvarande tillverkares instruktioner. - När protesens basharts har härdats, placera huvudplattan på hartset runt implantatet och gör det koncentriskt med avbildningskanylen. Applicera mer protesbasharts runt och ovanför huvudplattan för att fixera dess position. Låt det bota i flera minuter.
- Undvik att bygga upp ett tjockt lager cement runt kanylen för att säkerställa bättre åtkomst till bildfönstret med objektivlinsen (figur 4).
Figur 4: Schematiskt diagram över fönsterimplantation i (A) koronal och (B) sagittal vy. a)Huvudplatta. b)Tandprotesbasharts. c)Superbond. d)Kwik-Sil. e)Kanyl för bildbehandling. f)Injektionsbalk; g)Lödform. (C): Mus med det installerade implantatet efter operationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Späd protesbashartset för att minska dess viskositet, vilket gör det möjligt att fylla de varningar som är svåra att nå med en applikator.
- Placera försiktigt en isolerad gummitejp ovanför fönstret för att skydda fönstret från eventuell förorening från djursängkläder.
- När operationen är klar, injicera antiinflammatoriskt läkemedel subkutant för att förhindra ett inflammatoriskt svar.
- Placera djuret i en varm bur tills det återhämtar sig från anestesi.
- Kontrollera musens hälsostatus för 72 timmar efter operationen genom att observera allmänt beteende. Antiinflammatoriska läkemedel och smärtstillande injiceras subkutant i två-tre dagar efter operationen var 24: e timme för att frigöra smärta och minska det inflammatoriska svaret.
OBS: Alternativa övervakningsförfaranden, läkemedel och doser är möjliga för postoperativ vård, se IUCAC-godkända djurprotokollet för det exakta förfarandet. - Kontrollera fönstret 5-7 dagar efter operationen för att observera vaskulatur under fönstret. Vid ett tydligt fönster är djuret redo för virusinjektion.
3. Virusinjektion
OBS: Virusinjektion sker vanligtvis inom 5-7 dagar efter operationen. Före virusinjektionen måste det bekräftas att bildfönstret är klart, och det är möjligt att observera hjärnvaskulatur (Figur 5). I vissa fall kan det ta upp till 14-16 dagar att rensa fönstret, vilket också är acceptabelt om ingen hjärninflammation upptäcks.
Figur 5: Representativ bild av optiskt fönster (A) före och (B) efter virusinjektion kompletterad med FastGreen-färgämne. Pilen anger samma vaskulaturstruktur. Skalstreck: 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Tillsätt snabbgrön färgblandare lösning till viruslösning, utspädd till önskad titer, i förhållandet 1:9 i ett PCR-rör.
OBS: Snabbt grönt färgämne tillsätts för att underlätta visualisering av viruslösning under injektionen. - Anslut polyetenslangen med sprutan och fyll sedan slangen igen med mineralolja med hjälp av en sprutpump.
- Anslut den inre kanylen till den andra änden av slangen, infusera och dra tillbaka mineraloljan några gånger för att se till att den inre kanylen inte är igensatt.
- Söv djuret med isofluran (4% för induktion, 1,5-2% för underhåll, 0,3-0,5 L/min luftflöde), fixera huvudet i en stereotaxisk ram över en värmeplatta (bibehålla 37 °C), applicera ögonsalva.
- Dra ut 600 nL av viruslösningen, ta bort provdockans kanyl och sätt in den inre kanylen som är ansluten till injektionssprutan i styrballen, ingjut viruset med en hastighet av totalt 50 nL/min i 10 minuter.
OBS: Kontrollera om färgämnet är synligt genom fönstret med hjälp av ett stereomikroskop för att bekräfta lyckad virusinjektion (figur 5). - Efter injektionen, håll den inre kanylen ansluten i 10 minuter så att viruset kan spridas under fönstret.
- Ta försiktigt bort den inre kanylen från styrbaleln och recap den med en dummy kanyl.
- Placera djuret i en varm bur tills det återhämtar sig från anestesin.
OBS: Vanligtvis är möss redo för avbildning om 10-20 dagar efter virusinjektion. Uttrycksnivå och tid beror på virus serotyp och promotor som används för att driva genuttryck.
4. Avbildning av vakna möss under bredfältsmikroskop.
OBS: Den förberedda huvudplattan ger extraordinär stabilitet i bildimplantatet och möjliggör därmed longitudinell avbildning i vakna och beter sig möss med minimala rörelseartefakter.
- Inducera musen med 4% isofluran i några minuter, fäst huvudplattan på huvudplåten och fäst sedan huvudpffeln på löpbandet.
OBS: Huvudför gaffeln och löpbandet är anpassade för huvudplattan som används i denna studie, se Stödmaterial för motsvarande cad-filer. Induktion av mus före huvudfixering är valfritt eftersom det är möjligt att vana djur för detta förfarande. - Flytta löpbandet under mikroskopsteget och placera det optiska fönstret under objektiv lins.
- Använd en objektivlins med låg förstoring för att hitta det bästa synfältet (FOV) för funktionell avbildning och växla sedan till en högre NA-objektiv för att spela in neuronala aktiviteter med encellsupplösning.
OBS: Om injektionsbaleln fortfarande är ett hinder för objektivet att uppnå sitt arbetsavstånd, använd en trådklippare för att skära av injektionsbaleln från huvudplattan.
Representative Results
In vivo-avbildning av neuronal aktivitet med hjälp av en genetiskt kodad kalciumindikator. I genomsnitt startar in vivo imaging 3-4 veckor efter implantation om en tillräcklig nivå av transgene uttryck uppnås. Vid denna tid är cerebral ödem och blödning vanligtvis helt löst, och hjärnan vaskulatur kan lätt observeras genom det optiska fönstret. Här använde vi den beskrivna förberedelsen för att utföra upprepade inspelningar av neuronal aktivitet i regionen dorsala hippocampal CA1 i beter sig möss under fluorescens wide-field mikroskop. För att registrera neuronal aktivitet använde vi en ljus genetiskt kodad kalciumindikator, kallad NCaMP713, som uppvisar liknande kalciumkänslighet och temporal upplösning som GCaMP6s14. För att uttrycka NCaMP7-indikatorn i hippocampus injicerade vi rAAV/ DJ-CAG-NCaMP7-viruset med hjälp av en infusionskanyl och initierade longitudavbildning vid 14 dagar efter injektionen. För att spela in neuronal aktivitet använde vi en 10x NA 0,3 luftmålslins och Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som tillät avbildning vid ~ 1,5x1,5 mm FOV vid upp till 100 Hz frekvens. Grön fluorescens var upphetsad av en kommersiellt tillgänglig 470 nm LED med hjälp av en standard GFP-filteruppsättning. Det genomsnittliga bilddjupet som uppnås i grön kanal är ca 50-120 μm, vilket gör det möjligt att registrera neuronal aktivitet främst i stratum oriens och stratum pyramidale. Bilddjup i nära infraröda kanaler kan vara upp till 200 μm når de djupare lagren av hippocampus8. Den genomsnittliga inspelningstiden per FOV var 6-12 min, även om mycket längre bildsessioner är möjliga eftersom NCaMP7 kännetecknas av extremt hög fotostabilitet och ingen påvisbar fototoxicitet observerades (figur 6).
Figur 6: Registrering av neuronal aktivitet i hippocampalneuroner med hjälp av en grön fluorescens genetiskt kodad kalciumindikator. (A) En utvald FOV avbildad under ett bredfälts fluorescensmikroskop i grön kanal. b)De 15 rois som motsvarar de enskilda nervceller som visas i A och väljs med hjälp av standardavvikelseprojektionen för hela registreringen. (C) Representativa fluorescensspår av de 15 utvalda nervcellerna i B. (D) En representativ zoom-in-vy av 2 kalciumspår som visas i motsvarande färgrutor som visas i C. Skalstreck, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att erhålla fluorescensspår segmenterades de regioner av intresse (ROIs) som motsvarar neuronala somas manuellt och analyserades av ImageJ programvara. Före bildanalys rörelsekorrigering krävdes inte vanliga efterregistreringsförfaranden hos vakna djur eftersom de förvärvade datamängderna inte uppvisade rörelseartefakter på grund av den höga stabiliteten hos bildimplantatet. En representativ optisk inspelning av neuronala aktiviteter från hippocampus i en vaken beteendemus presenteras i figur 6. 15 ROIs som motsvarar neuronala somas valdes manuellt från samma FOV som visas i figur 6B, och fluorescensspåren med en studie inom varje ROI visas i figur 6C. Figur 6D visar två representativa delar av fluorescensspår från två olika ROI. Vi utförde 4 på varandra följande bildsessioner för samma FOV med 3-dagars intervaller. Det var möjligt att identifiera och avbilda samma nervceller i vissa FOV i minst två veckor (de längre bildbehandlingssessionerna utfördes inte för denna studie, men samma preparat har använts för upp till 6 månaders avbildningsstudie på mösstidigare 7; Figur 7). I denna studie använde vi AAV / DJ-CAG vektor, som drev ett starkt uttryck för genen av intresse även 21 dagar efter virusleverans (Kompletterande figur 1). Det kontinuerliga uttrycket komplicerade långsiktig identifiering av samma nervceller på grund av ökad fluorescens bakgrund och utseende av nya nervceller uttrycker kalcium indikatorn. Därför bör val av AAV serotyp och promotor för att driva mål gen uttryck vara en av de viktiga övervägandena under experimentell design i synnerhet om longitudinell imaging av samma delmängd av nervceller krävs. Bildframställningskvaliteten tillät att lösa proximala dendriter samt visualisera blodkärl.
Bild 7:Bildsekvensen av fyra olika FOV:er från hippocampalområdet spårades under 12 dagar. Djuret implanterades med fönstret på dag 0 och injicerades med rAAV / DJ-CAG-NCaMP7-viruset på dag 7. Pilspetsar indikerar att neuronen spåras inom FOV. Skalstänger: 80 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
In vivo imaging av neuronal aktivitet med hjälp av en genetiskt kodad spänningssensor.
I denna studie använde vi också en ny genetiskt kodad spänningssensor, kallad SomArchon7, vilket möjliggör spänningsavbildning med encellig enpikupplösning hos beteendedjur7,8. För att uttrycka SomArchon injicerade vi rAAV / DJ-CAG-SomArchon virus med hjälp av en infusion kanyl och utförde spänningsavbildning i en huvud-fast beter mus flera dagar efter injektion. För att spela in neuronal aktivitet använde vi en 40x NA 0,8 objektiv och Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som gjorde det möjligt för oss att avbilda 150x40 μm FOV med upp till 830 Hz förvärvshastighet. GFP-proteinet, som en del av SomArchon konstruerar för att underlätta visualisering av uttryck i spektrumet, kan enkelt avbildas i den gröna kanalen (LED-excitation vid 470/20 nm, utsläpp 525/50 nm) för att lokalisera celler av intresse för spänningsavbildning. Optisk spänning inspelningar utfördes i den nära infraröda kanalen (laser excitation 637 nm vid 3,4 W/mm2, emission 665 nm långpass) med 4 x 4 binning vid 830 Hz förvärvshastighet. Vi registrerade spontan aktivitet av en hippocampal neuron i en vaken mus med genomsnittlig SNR på 7 per åtgärd potential (Figur 8).
Figur 8:Registrering av neuronal aktivitet i hippocampal nervceller med hjälp av en nära infraröd fluorescens genetiskt kodad spänningsindikator SomArchon. (A) Ett valt FOV-avbildat under fluorescensmikroskop med brett fält i den nära infraröda kanalen. (B) Fluorescensspårning för en studie av neuronen i A. (C) En representativ inzoomning av spänningsspåret i motsvarande ruta som visas i B. Skalstreck: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
histologi
Efter funktionella imaging studie görs, post-mortem analys används för att bekräfta korrekt placering av implantatet, området för virusuttryck och lokalisering av ett protein av intresse för avbildade nervceller. För histologisk verifiering av virusuttryck och placering av implantatet undersöktes koronarsektioner av den fasta PFA hjärnan under ett fluorescens brett fältmikroskop (Figur 9A, C). Ett konfokalt mikroskop användes för att förvärva högupplösta bilder av enskilda nervceller som uttrycker kalciumindikatorn, liksom spänningsindikatorn(figur 9B,D). DAPI färgning användes för att visualisera den övergripande morfologin i hjärnskivan. Dessutom kan hjärnskivorna bedömas med hjälp av immunohistokemi för att verifiera astroglios eller gliosis orsakad av fönsterimplantation och virusuttryck. Våra tidigare studier visade att förfarandet inte inducerar märkbar gliosis7.
Figur 9: Histologisk verifiering av detoptiska fönsterpositionen och virusuttrycket. (A) En representativ fluorescerande bild av den koronarsektions hjärnskiva som visar placeringen av det optiska fönstret från en NCaMP-uttryckande mus. Skalstång: 1 mm. (B) En representativ konfokal bild av nervceller som uttrycker NCaMP7 indikatorerna. Skalstång: 25 μm. (C) En representativ fluorescensbild av koronalsektionens hjärnskiva som visar placeringen av det optiska fönstret från en SomArchon-uttryckande mus. Skalbar: 1 mm. (D) En representativ konfokal bild av nervceller som uttrycker SomArchon indikatorerna. Skalbar: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Kvantantitiv analys av relativ fluorescensintensitet tillsammans med uttryckstid. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här beskriver vi en metod för långsiktig avbildning av hippocampus CA1-regionen i att bete möss. Metoden är baserad på kronisk implantation av ett skräddarsyt bildfönster, vilket också möjliggör riktad administrering av virus eller läkemedel direkt till nervceller av intresse. Detta protokoll består av fyra huvuddelar: i) montering av bildimplantat; ii) Installation av bildimplantat. iii) Virusinjektion via bildimplantat. iv) funktionell avbildning hos möss som beter sig. Nedan beskriver och diskuterar vi kritiska steg i protokollet, felsökning, ändringar och begränsningar av metoden. Vi diskuterar också metodens betydelse och dess potentiella alternativa tillämpningar.
Det finns flera kritiska steg i det beskrivna protokollet som är ganska viktiga för framgångsrik kirurgi: (i) förberedelse av ett högkvalitativt bildimplantat; ii) Sterila kirurgiska tillstånd. iii) cortexens strävan; iv) Exakt placering av bildimplantatet. v) Virusinjektion. Som steg 1,6 anger skulle överskott av lödform kräva en större kraniotomi och därmed öka risken för inflammation. Det är också mycket viktigt att använda en lämplig mängd av det självhäftande optiska limet när täckglaset fästs på avbildningskanylen, vilket anges i steg 1.11, eftersom en otillräcklig mängd kan leda till läckage av cerebrospinalvätska i avbildningskanylen och göra den ogenomskinlig. Å andra sidan kan överskott av optiskt lim resultera i minskad transparens i glasfönstret. Eventuell kontaminering av bildimplantatet kan orsaka en aktiv spridning av bindväv under det optiska fönstret och/eller allvarlig inflammation, vilket leder till tidig avslutning av experimentet. Därför är bildimplantatmontering och förberedelse före operationen nästan lika viktigt som själva kirurgiska ingreppet.
Under operationen ablated den del av cortex under craniotomy av mild strävan, vilket resulterar i oundviklig blödning. Blod på operationsstället minskar avsevärt synligheten för hjärnvävnaden som måste avlägsnas. Detta komplicerar den exakta bedömningen av det önskade djupet av vävnad ablation. Noggrann spolning av operationsstället med PBS varje gång innan sug för att avlägsna nästa del av vävnaden ger bättre kontroll över djupet. Hjärnvävnaden bör alltid avlägsnas i små portioner steg för steg som bekräftar djupet av ablated vävnad innan du fortsätter med mer sug. Finare kontroll av sug kan också uppnås med en tunnare trubbig nål. Vi föreslår att du använder en 26 G nål, men mindre än 26 G diameter är mer benägna att täppa till. Dessutom krävs det vanligtvis mycket övning för att bestämma det exakta aspirationsdjupet som krävs för varje djur, eftersom färgen på cortex, corpus callosum och hippocampus kan variera från mus till mus (Figur 3).
Införing och fastsättning av bildimplantatet bör göras mycket exakt för att säkerställa att bildfönstrets dorsala yta placeras närmast möjligt till hippocampus dorsala yta. Storleken på den beredda kraniotomin bör nära matcha implantatet och tillåta dess införande utan betydande motstånd. Samtidigt bör det inte finnas något synligt mellanrum mellan skallen och implantatet för att säkerställa korrekt tätning och undvika exponering av hjärnvävnad. Skonsamt och stabilt tryck ska appliceras på toppen av implantatet under tätningen till skallen. Det är nästan oundvikligt att ha blod under bildfönstret under implantatinstallationen. Om det kirurgiska ingreppet görs ordentligt, bör fönstret rensas ut om 3-7 dagar, och hjärnans vaskulatur blir tydligt synlig. Det är också viktigt att se till att viruset injiceras ordentligt under fönstret. Vid misslyckat uttryck kan virus injiceras flera gånger.
Den stora komplikationen vi stött på i vissa fall är minskad synlighet av bildfönstret. Det finns flera möjliga orsaker till dålig bildkvalitet: i) pågående inflammation; ii) utväxt av bindväv på glaset; iii) stort gap mellan fönstret och hippocampus. Inflammation orsakas vanligtvis av kontaminering under operationen eller av inte korrekt steriliserat bildimplantat. Vi föreslår autoklavering av de kirurgiska instrumenten före och efter varje operation, desinficera operationsområdet precis före ingreppet och bära ren personlig skyddsutrustning under operationen. Bildimplantat ska rengöras efter montering, steriliseras och förvaras under sterila förhållanden. Utväxten av bindväv på glaset av bildimplantat kan bero på mekanisk förorening på glasets yta eller överdrivet trauma av hjärnvävnaden under cortexablation. Efter montering av implantatet är det viktigt att bekräfta att glasytan är ren och slät. Dessutom måste alla bitar av skadad hjärnvävnad försiktigt avlägsnas innan avbildningsimplantat sätts in i kraniotomin. I vissa fall resulterar gapet mellan glasfönstret och hippocampus i ackumulering av cerebrospinalvätska, vilket minskar kvaliteten på avbildning. Därför är det under implantatinstallationen viktigt att sätta in det hela vägen för att säkerställa god kontakt mellan hippocampus och glasfönster. Ibland är det svårt att identifiera den exakta orsaken till ogenomskinligt bildfönster. Vi föreslår att utföra post-mortem analys för att avslöja villkor under det optiska fönstret och på motsvarande sätt justera efterföljande operationer.
Metoden har flera grundläggande och tekniska begränsningar som bör beaktas före och under in vivo-avbildning. En av de största begränsningarna är cortexablation. En del av den visuella och sensoriska cortexen avlägsnas under operationen. Medan det är svårt att exakt utvärdera effekten av cortexablation, eftersom borttagen hjärnvävnad inte direkt projicerar på hippocampus, visade flera studier ingen märkbar försämring av hippocampal-beroende lärande eller andra relevanta hippocampus funktioner15,16. De optiska begränsningarna bör också beaktas, särskilt när höga NA-objektiva linser används. Till exempel använde vi i denna studie en 1,75 mm lång kanyl med en 1,9 mm innerdiameter. Geometrin i denna kanyl kommer inte att bevara hela NA av luftmål med NA mer än ~ 0,5 eller vattenmål med NA mer än ~ 0,6 eftersom det kommer att klippa lite ljus. En annan begränsning, vanlig för alla hjärnavbildningsimplantat, är att en del av hjärnan exponeras, vilket främjar värmeförlust17,18. Fysiologisk hjärntemperatur kan dock enkelt återställas under avbildning genom perfusion av en varm buffert.
Den beskrivna metoden kan enkelt modifieras eller justeras för andra applikationer. Till exempel kan preparatet anpassas för avbildning av striatum7. Eftersom striatum ligger något djupare än hippocampus, bör den längre bildskanylen användas för montering av bildimplantat. Vi föreslår att du använder 2,0 mm bild cannula. Craniotomys koordinater bör justeras på motsvarande sätt (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Dessutom tillåter virusinjektion via infusionskanyl att uppnå uttrycket av en transgen i ett tunt lager av nervceller när du använder AAV-serotyp med begränsad spridning19,20. Det är särskilt fördelaktigt för en-foton imaging på grund av minskad out-of-focus fluorescens från djupare lager och, som ett resultat, förbättrad encellig upplösning imaging. Dessutom kan injektionskanyl också användas vid funktionell avbildning för administrering av läkemedel eller andra kemikalier direkt på nervcellerna i FOV (figur 5B). Övergripande infusion kanyl lägger till användbara funktioner till bildimplantatet, förbättra bildframställning kvalitet på grund av det riktade virala uttrycket och möjliggör farmakologisk stimulering av nervceller i FOV. Den använda huvudplattan ger extraordinär stabilitet i bildimplantat som minimerar rörelseartefakter även i aktivt rörliga djur på ett löpband. Huvudplattan är liten och lätt, vilket orsakar minimalt obehag för djur och förblir stabil i flera månader efter installationen. Bildimplantatet är också kompatibelt med multifoton imaging15,16,21 och kan kombineras med mikroskop22,23. Ett liknande bildimplantat användes också för multiphoton imaging av de djupare hippocampus strukturerna, inklusive stratum radiatum, stratum lagounose och dentate gyrus16,24,25,26,27. Att rikta in sig på de djupare hippocampusstrukturerna med AAV via infusionskanyl kan dock kräva ytterligare optimering av AAV-serotypen och volym19.
Vi tror att det beskrivna protokollet kommer att underlätta studier som syftar till att undersöka neuronal aktivitet med hög spatiotemporal upplösning i hippocampus av beter sig möss med enkla och prisvärda one-photon imaging inställningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i Molecular BioEngineering Group vid Westlake University för all hjälp och användbar diskussion. Vi tackar också Jinze Li och Jie-Min Jia från Westlake University för hjälpen med att filma det kirurgiska ingreppet.
Detta arbete stöddes av start-up finansiering från Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant och National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 all to K.D.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
| Denture Base Resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
| Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
| Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
| Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
| Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
| Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
| Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
| Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
| UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
References
- Leutgeb, S., et al. Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).
- Henneman, W. J. P., et al. Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease. Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).
- Camicioli, R., et al. Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy. Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).
- Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience. Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).
- Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
- Fan, L. Z., et al. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1. Cell. 180 (3), 521-535 (2020).
- Shemesh, O. A., et al. Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
- Villa, K. L., et al. Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo. Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Subach, O. M., et al. Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Roche, M., et al. In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation. eLife. 8, 47324 (2019).
- Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus. Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).
- Attardo, A., et al. Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Castello-Waldow, T. P., et al. Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations. PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).
