Summary
Aqui apresentamos um protocolo passo-a-passo para gerar organoides humanos maduros da retina e utilizá-los em um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para identificar candidatos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Abstract
Os organoides fornecem uma plataforma promissora para estudar o mecanismo e os tratamentos de doenças, diretamente no contexto do tecido humano com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Organoides da retina humana madura são utilizados para rastrear potenciais tratamentos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recentemente, demonstramos que MacTel pode ser causado por níveis elevados de uma espécie lipídica atípica, os desoxiesfingolipídios (deoxySLs). Esses lipídios são tóxicos para a retina e podem conduzir a perda de fotorreceptores que ocorre em pacientes com MacTel. Para rastrear drogas quanto à sua capacidade de prevenir a toxicidade dos fotorreceptores desoxiSL, geramos organoides da retina humana a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes (iPSC) não induzida por MacTel e os amadurecemos até uma idade pós-mitótica, onde eles desenvolvem todas as células derivadas da linhagem neuronal da retina, incluindo fotorreceptores funcionalmente maduros. Os organoides da retina foram tratados com um metabólito deoxySL e a apoptose foi medida dentro da camada fotorreceptora usando imunohistoquímica. Usando este modelo de toxicidade, compostos farmacológicos que previnem a morte dos fotorreceptores induzidos por desoxiSL foram triados. Usando uma abordagem candidata direcionada, determinamos que o fenofibrato, um medicamento comumente prescrito para o tratamento de colesterol e triglicérides elevados, também pode prevenir a toxicidade do desoxiSL nas células da retina.
A triagem de toxicidade identificou com sucesso uma droga aprovada pela FDA que pode prevenir a morte de fotorreceptores. Este é um achado diretamente acionável devido ao modelo altamente relevante para a doença testado. Esta plataforma pode ser facilmente modificada para testar qualquer número de estressores metabólicos e potenciais intervenções farmacológicas para futuras descobertas de tratamento em doenças da retina.
Introduction
A modelagem de doenças humanas em cultura de células e modelos animais tem fornecido ferramentas inestimáveis para a descoberta, modificação e validação de terapêuticas farmacológicas, permitindo que elas avancem de uma droga candidata para uma terapia aprovada. Embora uma combinação de modelos in vitro e in vivo não humanos tenha sido um componente crítico do pipeline de desenvolvimento de fármacos, eles frequentemente falham em prever o desempenho clínico de novos candidatos a fármacos1. Há uma clara necessidade de desenvolvimento de tecnologias que preencham a lacuna entre monoculturas celulares humanas simplistas e ensaios clínicos. Avanços tecnológicos recentes em culturas tridimensionais auto-organizadas de tecidos, organoides, têm melhorado sua fidelidade aos tecidos por eles modelados, tornando-os ferramentas promissoras no pipeline de desenvolvimento pré-clínico de fármacos2.
Uma grande vantagem da cultura de células humanas sobre modelos in vivo não humanos é a capacidade de replicar os meandros específicos do metabolismo humano, que podem variar consideravelmente mesmo entre vertebrados de ordem superior, como humanos e camundongos3. No entanto, essa especificidade pode ser ofuscada pela perda de complexidade tecidual; É o caso do tecido da retina, onde vários tipos celulares estão intrinsecamente entrelaçados e têm uma interação metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que não podem ser replicados em monocultura4. Os organoides humanos, que fornecem um fac-símile de tecidos humanos complexos com a acessibilidade e escalabilidade da cultura celular, têm o potencial de superar as deficiências dessas plataformas de modelagem de doenças.
Organoides da retina derivados de células-tronco têm se mostrado particularmente fiéis na modelagem do complexo tecido da retina neural humana5. Isso tornou o modelo organoide da retina uma tecnologia promissora para o estudo e tratamento das doençasretinianas6,7. Até o momento, grande parte da modelagem da doença em organoides da retina tem se concentrado em doenças retinianas monogênicas, onde organoides da retina são derivados de linhagens iPSC com variantes genéticas causadoras de doenças7. Estas são geralmente mutações altamente penetrantes que se manifestam como fenótipos de desenvolvimento. Menos trabalho tem sido efetivamente feito em doenças do envelhecimento onde mutações genéticas e estressores ambientais afetam o tecido que se desenvolveu normalmente. As doenças neurodegenerativas do envelhecimento podem ter herança genética complexa e contribuições de estressores ambientais que são inerentemente difíceis de modelar usando culturas de células de curto prazo. No entanto, em muitos casos, essas doenças complexas podem coalescer em estressores celulares ou metabólicos comuns que, quando testados em um tecido humano totalmente desenvolvido, podem fornecer informações poderosas sobre as doenças neurodegenerativas do envelhecimento8.
A doença degenerativa macular de início tardio, telangiectasia macular tipo II (MacTel), é um grande exemplo de uma doença neurodegenerativa geneticamente complexa que coalesce em um defeito metabólico comum. MacTel é uma doença degenerativa retiniana incomum do envelhecimento que resulta em perda de fotorreceptores e glia de Müller na mácula, levando a uma perda progressiva da visão central9,10,11,12,13. No MacTel, uma herança genética indeterminada, possivelmente multifatorial, conduz a uma redução comum da serina circulante nos pacientes, resultando em um aumento de uma espécie lipídica neurotóxica denominada desoxiesfingolipídios (deoxiSL)14,15. Para provar que o acúmulo de desoxisSL é tóxico para a retina e validar potenciais terapêuticas farmacêuticas, desenvolvemos este protocolo para avaliar a toxicidade de fotorreceptores em organoides da retina humana14.
Aqui delineamos um protocolo específico para diferenciar organoides da retina humana, estabelecer um ensaio de toxicidade e resgate usando organoides e quantificar os resultados. Fornecemos um exemplo bem-sucedido onde determinamos a toxicidade tecido-específica de um agente suspeito de causar doença, o deoxySL, e validamos o uso de um medicamento genérico seguro, o fenofibrato, para o tratamento potencial da toxicidade retiniana induzida pelo desoxySL. Trabalhos anteriores mostraram que o fenofibrato pode aumentar a degradação do desoxySL e diminuir o deoxySL circulante em pacientes, no entanto, sua eficácia em reduzir a toxicidade retiniana induzida pelo deoxySL não foi testada16,17. Embora apresentemos um exemplo específico, este protocolo pode ser utilizado para avaliar o efeito de qualquer número de estressores metabólicos/ambientais e potenciais drogas terapêuticas sobre o tecido retiniano.
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Protocol
1. Descongelamento, passagem e expansão de iPSCs/ESCs
NOTA: Para todas as etapas de cultivo de células, use as práticas recomendadas para manter uma cultura de células estéril.
- Revestir uma placa de cultura celular de 6 poços com meio de matriz de membrana basal.
- Para preparar 1x deste meio, siga as especificações do produto ou dilua 75 μL de meio de matriz fria com 9 mL de DMEM/F12. Adicionar 1,5 mL de 1x meio recém-preparado por poço em uma placa de 6 poços. Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Aspirar o meio da matriz da membrana basal e enxaguar cada poço com 3 mL de DMEM/F12. Adicionar 2 ml de DMEM/F12 e incubar a 37 °C até à utilização. Use o prato no dia em que estiver preparado.
- Preparar uma solução-mãe de 10 mM de inibidor de rocha (dicloridrato de Y-27632) em PBS e conservar a -20 °C até à utilização.
- Descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs/ESCs em meio DMEM/F12 e centrifugar a 400 x g durante 5 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em meio mTeSR. Placa 1 frasco de células em um poço revestido de 6 poços em meio mTeSR com 10 μM de inibidor de rocha (dicloridrato de Y-27632) e incubar durante a noite na incubadora. No dia seguinte, aspirar a mídia e adicionar de volta apenas mTeSR.
NOTA: Altere a mídia todos os dias até a passagem. - Preparar EDTA 0,5 mM em PBS diluindo 500 μL de EDTA 0,5 M em 500 mL de PBS.
- Células de passagem quando atingem 80-90% de confluência. Dividir células 1:3 ou 1:6 por poço, dependendo da taxa de crescimento das células.
- Para remover as células aderidas da placa, aspirar o meio e incubar com EDTA 0,5 mM em PBS por 5 min à temperatura ambiente. Após a incubação, remova a solução de EDTA e retire as células ejetando com força 1 mL de meio mTeSR para as células com uma pipeta p1000.
- Continue a sugar e ejetar com força o meio e as células mTeSR, até 5x, para remover as células restantes aderidas. Células de placa em uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal fresca, com meio mTeSR. Continue substituindo a mídia diariamente até que as placas atinjam novamente 80-100% de confluência.
- Uma vez que as células tenham se expandido para uma placa completa de 6 poços e tenham atingido 80-100% de confluência, reserve um poço para expandir a linhagem celular para diferenciações subsequentes ou congelar para criopreservação. Use os cinco poços restantes para iniciar o processo de diferenciação fazendo corpos embrionários.
2. Confecção de corpos embrionários (EBs)
NOTA: As receitas de meios de formação e diferenciação de EB são derivadas dos protocolos de Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 e Zhong et al.19.
- Prepare 1x solução Dispase e Neural Induction Media (NIM) conforme descrito abaixo.
- Preparar 10 mg/mL de 5x solução-mãe de Dispase dissolvendo o pó em DMEM/F12. Filtro estéril com filtro de 0,22 μm. Conservar 1 ml de alíquotas a -20 °C até à utilização.
- Usando a solução Dispase 5x, preparar 1 mL/poço de Dispase 2 mg/mL em DMEM/F12. Aquecer a solução a 37 °C durante 30 min.
- Preparar NIM suplementando DMEM/F12 com 1% de suplemento de N2, 1% MEM NEAA, e 2 mg/mL de heparina a 180 U/mg. NIM pode ser armazenado a 4 °C por até um mês.
- Preparar e aquecer 16 mL de mistura 3:1 de solução mTeSR:NIM (12mL:4mL) à temperatura ambiente.
- Remova as células diferenciadas e adicione a solução Dispase quente.
- Remova as células diferenciadoras da cultura de células iPSCs/ESCs. Sob um escopo de dissecção, raspe colônias brancas opacas com uma ponta de pipeta p10. Aspirar o meio mTeSR dos poços de cultura. Isso removerá as touceiras diferenciadas que foram apenas raspadas.
- Adicione imediatamente a solução Dispase pré-aquecida e incube a 37 °C até que a maioria das bordas das colônias celulares comece a se enrolar sob um microscópio. Isso levará de 4 a 8 minutos.
NOTA: O tempo de incubação das células em Dispase terá que ser determinado para cada laboratório. A duração pode diferir entre as linhagens celulares e uma incubação mais longa é necessária para células que foram plaqueadas por 3 dias ou mais. As iPSCs/ESCs de crescimento lento que levam mais de 3 dias para atingir a confluência começarão a aderir com maior força à placa, dificultando a retirada das células. Para células de crescimento lento, tente passar células em 1:2 para expansão em uma placa completa de 6 poços para reduzir o tempo desde o plaqueamento até a confluência.
- Aspirar a solução e adicionar suavemente pelo menos 2 mL de meio DMEM/F12 por poço. Adicione o meio DMEM/F12 lentamente ao lado do poço tomando cuidado para não desalojar as células.
- Aspirar o meio DMEM/F12 e, em seguida, adicionar com força 1 mL fresco de DMEM/F12 diretamente nas células para levantar colônias celulares da placa. Com uma pipeta p1000 sugue repetidamente e ejete com força DMEM/F12 no poço, até 5x, para desalojar o maior número possível de colônias de células.
NOTA: As iPSCs/ESCs diferenciadoras/diferenciadas aderem mais à placa do que as iPSCs/ESCs indiferenciadas. As células que não saem com pipetagem repetida são melhor deixadas para trás. O excesso de pipetagem mata as células e reduz a eficiência da produção de EB. Os aglomerados celulares terão entre 100 e 400 células por aglomerado.
- Aspirar o meio DMEM/F12 e, em seguida, adicionar com força 1 mL fresco de DMEM/F12 diretamente nas células para levantar colônias celulares da placa. Com uma pipeta p1000 sugue repetidamente e ejete com força DMEM/F12 no poço, até 5x, para desalojar o maior número possível de colônias de células.
- Transfira colônias flutuantes para um tubo cônico de 15 mL e lave os poços com um meio DMEM/F12 adicional de 1 mL por poço para coletar as colônias flutuantes restantes.
- Permita que as colônias flutuantes se estabeleçam por gravidade por no máximo 5 min. Uma vez assentado, remova todos, exceto 1-2 mL sobrenadante. Tome cuidado para não agitar a pelota macia na parte inferior.
- Ressuspender o pellet em meio 3:1 mTeSR:NIM pré-aquecido e transferir para um balão T75 de ultrabaixa fixação. Incubar durante a noite para permitir a formação de EBs. Este será considerado o Dia 0 de diferenciação.
- Mudar gradualmente o meio para NIM para iniciar a diferenciação de EBs em progenitores neurais.
- No dia seguinte, remova o meio e substitua por 10 mL de meio 1:1 mTeSR:NIM. Para remover os meios da cultura de EB flutuante, incline o frasco para cima de modo que os EBs se acumulem no canto inferior do frasco. Aspirar o sobrenadante, certificando-se de não aspirar nenhum dos EBs na pastilha na parte inferior.
- No dia seguinte, substituir a mídia por 10 mL de meio 1:3 mTeSR:NIM.
- No dia seguinte, substitua a mídia por um meio NIM completo. Continue a trocar de meio a cada 2 dias com o meio NIM até 7 dias após o tratamento com Dispase.
3. Plating EBs e início da diferenciação neural retiniana
- Uma semana após o tratamento com Dispase, EBs flutuantes em placa em uma placa de 6 poços revestida com meio de matriz de membrana basal com fator de crescimento. Para revestir a placa, consulte o passo 1.1.
- Aspirar o meio gasto das EBs e substituir por 12 mL de NIM.
- Garanta uma distribuição uniforme dos EBs em cada poço, agitando o meio que contém EB para ressuspender os EBs, em seguida, remova rapidamente 1/6 do meio (2 mL) e distribua em um poço. Repita para os poços restantes.
- Antes de incubar, agite suavemente a placa, para frente e para trás e depois de um lado para o outro, para distribuir uniformemente os EBs. Se os EBs se amontoarem no meio, eles não se diferenciarão adequadamente.
NOTA: A densidade de chapeamento é crítica para a diferenciação. Certifique-se de chapear mais de 30 EBs por poço. Se a produção de EBs não foi eficiente, distribua as EBs em menos poços.
- Mude a mídia diariamente com o meio NIM. Mantenha o nível de mídia nos poços em ~3 mL. Ao trocar de meio, remova todos, exceto 1 mL de meio para não secar os EBs chapeados, e adicione 2 mL de meio suavemente ao lado do poço para não levantar as células da placa.
- Nove dias após o plaqueamento das EBs, comece a mudar a mídia de NIM para Retinal Differentiation Media (RDM) ao longo de dois dias.
- Preparar RDM misturando o seguinte: 48% DMEM/F12 (1:1) e 48% DMEM suplementado com 2% B27 suplemento sem vitamina A, 1% MEM NEAA e 1% Pen-Strep. Esterilizar o filtro com filtro de 0,20 μm. O RDM pode ser armazenado a 4 °C por até um mês.
- No primeiro dia, mude a mídia para uma mistura 1:1 de NIM:RDM. No segundo dia, mude a mídia para RDM. Todos os dias subsequentes, alimentar células RDM.
NOTA: Nas próximas semanas, EBs plaqueadas formarão progenitores neurais da retina que começam a gerar EPR visivelmente pigmentado.
4. Fabricação de organoides flutuantes e manutenção de culturas organoides flutuantes
- EBs plaqueadas com fragmentos aos 28 dias após o tratamento inicial com Dispase (21 dias após o plaqueamento com EB) usando um bisturi estéril para cortar uma grade de 1-2 mm2 em EBs plaqueadas. Isso separará as colônias progenitoras da retina em pequenos pedaços para que, mais tarde no desenvolvimento, elas não fiquem muito grandes e necrosem devido à troca insuficiente de nutrientes em seu centro.
- Destacar-se EBs chapeados.
- Para fazer isso, primeiro adicione mais 2 mL de RDM a cada poço. Em seguida, aspirar ~1000 μL de meio dos poços usando uma pipeta p1000. Agora, ejete com força a mídia diretamente em EBs chapeados com a ponta totalmente submersa.
- Repita isso até que todas as células tenham sido retiradas da placa. Mantenha a ponta submersa durante a ejeção do meio e não empurre o êmbolo da pipeta para além da primeira parada para evitar bolhas.
- Ressuspender pedaços de EB desprendidos nascentemente em um frasco plástico estéril de 125 mL de Erlenmeyer e encher o frasco com ~40 mL de mídia RDM. Colocar o balão num agitador orbital colocado numa incubadora normal. Ajuste a velocidade do agitador em 130-140 RPM (ajuste de velocidade 3).
NOTA: Cultivar organoides em um agitador impede que eles grudem juntos enquanto cultivam em uma concentração maior de organoides. Os biorreatores também alcançam os mesmos fins, mas um agitador é mais barato. - Alimentar organoides com uma mudança parcial de meio, substituindo aproximadamente 12 mL de RDM 2-3 vezes por semana, dependendo de quão amarelo o meio fica. Os organoides precoces não exigirão muita alimentação, mas à medida que crescem, exigirão mudanças de mídia mais frequentes com mais mídia.
- Prune organoides a cada duas semanas para remover organoides não-retinais, supercrescidos e moribundos. Isso evita o desperdício de mídia e melhora a saúde dos organoides da retina restantes.
- Transfira as células do frasco para uma placa de 6 poços ou prato de 10 cm usando uma pipeta de 5 mL. Manter organoides que apresentem neuroepitélio estratificado (Figura 1A, asterisco). Estes organoides são transparentes e brancos.
- Classifique e remova organoides da retina mal formados ou crescidos e organoides não retinianos com uma pipeta de 5 mL. Estes serão geralmente opacos e amarelados (Figura 1A). Também remova qualquer coisa que não se pareça com um neuroepitélio estratificado. As primeiras podas serão trabalhosas, mas se tornarão muito mais fáceis a cada vez que os organoides se tornarem maiores e mais homogêneos (Figura 1B).
5. Manter organoides maduros e diferenciá-los para um tecido retiniano pós-mitótico
- No dia 56 (semana 8) após o tratamento inicial com Dispase para formação de EB (28 dias após a cultura de EBs deslocadas em um frasco), mude o meio organoide para RDM+. Isso fornecerá nutrientes extras para organoides totalmente maduros como tecido da retina.
- Preparar taurina 100 mM em PBS. Conservar alíquotas em -20 °C até à utilização.
- Preparar RDM+ suplementando RDM com 10% FBS, 100 μM Taurina, e 2 mM suplemento comercial de glutamina. Esterilizar o filtro com filtro de 0,20 μm.
- Continue a alterar a mídia RDM+ 2-3 vezes por semana.
- Na semana 17-18 (pós-tratamento Dispase) transferir organoides do frasco de Erlenmeyer para uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa usando uma pipeta de 5 mL. Durante a primeira semana continue a podar e separar organoides uns dos outros diariamente até que os organoides não fiquem mais juntos. A densidade ideal é de 10-15 organoides por poço. Mude de mídia 2-3 vezes por semana.
NOTA: Reduza o número de organoides por poço se eles organoides frequentemente aderem uns aos outros ou se a mídia está ficando muito amarela entre as mudanças de mídia. - Espere que os organoides se tornem totalmente pós-mitóticos na semana 185 , quando as células neurais da retina estiverem presentes por toda parte. Na semana 24, verifique a formação de segmentos externos rudimentares na parte externa do organoide. Na semana 26-28, certifique-se de que os segmentos externos sejam espessos na parte externa dos organoides (Figura 1C). Realizar ensaios de toxicidade após a semana 26, quando os organoides tiverem segmentos externos definidos, significando um estado de diferenciação maduro.
NOTA: Use apenas organoides da retina bem diferenciados para o ensaio de toxicidade. A realização de ensaios de toxicidade em organoides com segmentos externos bem definidos permitirá sua identificação.
6. Desoxiesfinganina (desoxiSA) e tratamento medicamentoso
NOTA: Apresentamos aqui um tratamento único de fenofibrato para resgatar a toxicidade do desoxiSA durante o período de 4 dias (Figura 2). A concentração de desoxiSA adicionada aos organoides, a duração do tratamento com desoxiSA nos organoides e o tipo de droga utilizada para resgatar a toxicidade14 podem, no entanto, ser modificados de acordo com as necessidades experimentais para testar a toxicidade e o resgate da toxicidade.
- Preparar 1 mM de solução-mãe de deoxySA em etanol. Conservar a -20 °C durante 1 mês. Alternativamente, uma solução-estoque de deoxySA pode ser preparada em DMSO.
- Realizar uma diluição seriada de deoxySA para determinar uma concentração tóxica apropriada de deoxySA para resgate de drogas.
NOTA: Primeiro determine uma concentração de deoxySA que resultará em morte celular suficiente para medir um efeito de resgate. Se a concentração for muito alta, a resposta tóxica resultará na desintegração do organoide e nenhum resgate será observado. Se a resposta tóxica for muito baixa, será difícil observar um efeito de resgate significativo. A resposta tóxica do deoxySA pode variar de laboratório para laboratório e lote para lote de deoxySA.- Diluir 1 mM de solução estoque de desoxiSA para concentrações de 0,5 μM, 1 μM e 2 μM em 3 mL de RDM+, cada. Adicionar 3 μL de etanol ao RDM+ para preparar um tratamento controle.
- Sob um microscópio de dissecção, use uma sonda estéril para selecionar 4 grupos de organoides com um mínimo de 5 organoides por grupo. Divida os grupos em poços separados de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa. Selecione organoides que tenham aproximadamente o mesmo tamanho e forma.
- Aspirar o máximo possível de RDM+ dos organoides. A cada poço de organoides, adicionar uma concentração de deoxySA em RDM+. Adicione o controle do veículo ao quarto poço de organoides.
- Após dois dias de cultura em desoxiSA ou veículo, substitua o meio por diluições de desoxiSA correspondentes recém-preparadas em RDM+.
- No quarto dia de tratamento, prossiga para a etapa 7 para processar e testar organoides para morte celular. Uma vez selecionada uma concentração de desoxiSA, continue até o passo 6.3 para tratar com fenofibrato.
NOTA: A morte celular alvo no grupo de tratamento deoxySA selecionado é de 5 - 20 células positivas para TUNEL por 10.000 μm2. Os organoides não devem se desintegrar pelo toque de uma sonda ao longo do tratamento.
- Tratar organoides com a dose tóxica selecionada de deoxySA e fenofibrato.
- Preparar uma solução-mãe de 40 mM de fenofibrato em DMSO. Conservar a -20 °C até 1 ano.
- Preparar o meio de tratamento medicamentoso: Em 3 mL de RDM+, diluir 1 mM de solução estoque de desoxiSA para 1 μM de desoxiSA e diluir 40 mM de solução estoque de fenofibrato para 20 μM.
- Preparar o meio de tratamento com desoxiSA: Em 3 ml de RDM+, diluir a solução-mãe de 1 mM de desoxiSA para 1 μM de desoxiSA e adicionar 1,5 μL de DMSO.
- Preparar o meio controle: Em 3 mL de RDM+, adicionar 3 μL de etanol e 1,5 μL de DMSO.
- Sob um microscópio de dissecção, usando uma sonda estéril, selecione três grupos de organoides com um mínimo de cinco organoides por grupo. Divida os grupos em poços separados de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.
- Adicione os tratamentos preparados (desoxiSA, desoxiSA + fenofibrato, ou controle) aos organoides. Após dois dias, trocar o meio nos poços com RDM+ recém-preparado suplementado com as correspondentes soluções deoxySA/fenofibrato/controle.
- No quarto dia de tratamento prossiga para a etapa 7 para processar e dosar organoides para morte celular (Figura 2).
7. Incorporação e criossecção de organoides
- Preparar PFA fresco a 4% adicionando 1 ml de ampola de PFA a 16% a 3 ml de PBS.
- Remova o meio RDM+ dos organoides e enxágue uma vez com PBS. Remova o máximo de PBS possível dos organoides. Adicionar 2 mL de PFA 4% recém-preparado (em PBS) aos organoides e incubar por 15 min à temperatura ambiente.
- Após 15 min de incubação, lave os organoides duas vezes com 2 mL de PBS e, em seguida, lave em PBS por 10 min.
NOTA: Realizar a fixação em um exaustor de fumaça química e descartar a solução de PFA e duas lavagens subsequentes de PBS em um recipiente de resíduos de PFA adequadamente rotulado armazenado no exaustor. - Aspirar todo o PBS e, em seguida, adicionar 20% de sacarose em PBS aos organoides fixos. Certifique-se de que os organoides são misturados na solução de sacarose e não permanecem em uma bolha PBS na parte superior. Mantenha os organoides na solução de sacarose até afundar no fundo da solução de sacarose, ou seja, ~1 h à temperatura ambiente. Os organoides fixos podem ser armazenados em solução de sacarose durante a noite a 4 °C.
- Incorpore os organoides em solução de OCT em um molde de criossecção. Vários organoides por condição podem ser incorporados em um molde. Oriente os organoides garantindo que suas melhores regiões da retina serão seccionadas transversalmente no criostato, e o meio dos organoides estão todos aproximadamente no mesmo plano. Congelar os organoides incorporados a -20 °C. Os organoides embutidos podem ser armazenados a -80 °C por anos.
NOTA: Os organoides são difíceis de ver na OCT congelada; orientar os aglomerados de EPR para o lado do molde que ficará voltado para a lâmina para facilitar a identificação organoide. - Organoides de criossecção em seções de 10-14 μm de espessura e seções aderentes a lâminas tratadas com poli-L lisina. Durante a criossecção, verifique repetidamente as lâminas sob um microscópio para identificar seções que contêm o meio dos organoides. Coletar apenas os cortes médios dos organoides onde todas as camadas estão uniformemente representadas (Figura 2A-C, Figura 3). Uma vez seccionadas, as lâminas podem ser armazenadas em uma caixa de slides a -80 °C por anos.
NOTA: As fatias retiradas nas extremidades do organoide irão sobre-amostrar os fotorreceptores mais externos e não são apropriadas para quantificação. Organoides de tamanho médio fornecerão 10-15 cortes do meio do organoide, o que representa uma seção transversal das camadas estratificadas da retina.
8. Coloração TUNEL para células apoptóticas
- Descongelar lâminas congeladas por 30 min a 37 °C. A colocação imediata de corrediças a 37 °C evita a condensação. Amostras de tecido embebidas em água pura podem distorcer o tecido. A incubação a 37 °C também melhora a adesão do tecido à lâmina de vidro.
- Crie uma borda contínua na lâmina de vidro ao redor das seções de tecido usando uma caneta hidrofóbica. Isso proporcionará uma borda e garantirá fixação adequada e incubações de anticorpos com pequeno volume de soluções. Adicione aproximadamente 100-200 μL (o volume preencherá a região com bordas hidrofóbicas sem transbordar) de PFA 4% recém-preparado por 20 min. Realize a fixação em um exaustor de fumaça química e descarte a solução de PFA em recipiente de resíduos de PFA adequadamente rotulado armazenado no exaustor.
- Enxágue as lâminas uma vez em PBS e lave em PBS por 25 min à temperatura ambiente.
- Prepare a mistura TUNEL. Descongele os frascos violeta e azul do kit de detecção de morte celular in situ. Remover 100 μL de solução para frasco para injetáveis violeta (pode utilizar para um controlo negativo) e combinar os restantes 450 μL de solução do frasco para injetáveis violeta com 50 μL de solução do frasco para injetáveis azul. Misture bem e mantenha no escuro. Cada conjunto de frascos para injetáveis (500 μL no total) pode manchar 5-10 lâminas.
- Permeabilizar fatias de tecido.
- Preparar solução de permeabilização: PBS com 0,1% de TritonX-100 e 0,1% de citrato de sódio
- Remova o PBS das lâminas de amostra e, em seguida, adicione a Solução de Permeabilização às amostras. Incubar durante 2 minutos em bloco de gelo ou a 4 °C. Em seguida, enxágue uma vez em PBS e lave em PBS por 10 min.
- Remova o PBS e seque o máximo de solução possível usando o canto de um tecido dobrado. Adicionar 50-100 μL de mistura preparada TUNEL às amostras, dependendo do tamanho da área desenhada pela caneta hidrofóbica. Cubra com tampa de vidro e incube a 37 °C durante 1 h no escuro.
NOTA: Todas as incubações e lavagens para as etapas seguintes devem ser feitas no escuro para evitar o clareamento de fluoróforos. Use uma caixa escura ou cubra as corrediças com papel alumínio para bloquear a luz. - Rotular os fotorreceptores. Enxágue uma vez com PBS e lave por 20 min em PBS. Remova o PBS e, em seguida, adicione o anticorpo primário Recoverin (coelho anti-Recoverin) diluído 1:500 em PBS com 0,1% de Tween e 5% de soro de burro. Incubar a 4 °C durante a noite.
- Depois de remover o anticorpo primário, enxaguar uma vez em PBS e, em seguida, lavar em PBS por 20 min. Adicionar anticorpo secundário, anti-coelho de burro com um fluoróforo laranja ou vermelho, diluído 1:1.000 em PBS com Tween a 0,1% e soro de burro a 5% e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Enxágue uma vez com PBS e lave por 20 min em PBS. Adicione DAPI a 1:1000 em PBS, incube em temperatura ambiente por 10 min.
- Enxágue uma vez com PBS e lave por 20 min em PBS. Remova o PBS e adicione o meio de montagem. Adicione a tampa, sele com esmalte e deixe secar no escuro. As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C em um recipiente escuro por até 1 semana.
NOTA: Para obter a melhor qualidade de imagem, tire imagens no dia seguinte.
9. Imagem de cortes organoides e quantificação de óbito.
NOTA: A aquisição de imagens requer um microscópio confocal com capacidade para distinguir entre três canais de fluoróforo. Este experimento usa canais verdes (Alexa Fluor 488), laranja (Alexa Fluor 555) e UV (DAPI). Qualquer combinação de fluoróforos pode ser usada para garantir que as emissões não sangrem para os outros canais.
- Localizar cortes da retina para aquisição de imagens e quantificação. Sob uma pequena magnificação do microscópio (5x ou 10x) use a coloração Recoverin, que marca o citoplasma dos fotorreceptores, e a coloração DAPI, que marca os núcleos de todas as células, para localizar uma região do organoide fatiada que esteja intacta, bem formada, e em um plano que apareça um corte transversal representativo do organoide (Figura 2 e Figura 3 ). Encontre uma seção que tenha uma camada nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenha pelo menos algumas células de espessura e uma camada separada e distinta de núcleos que não tenham coloração de Recoverin (Figura 2 e Figura 3).
- Enquadrar a imagem. Aumentar a ampliação do microscópio para uma objetiva de 20x e enquadrar a lâmina para preencher a imagem com o máximo possível da camada fotorreceptora (Figura 3).
- Defina o plano Z. Se estiver usando um microscópio que imageia pilhas Z, defina os limites superior e inferior do intervalo Z para obter imagens de toda a profundidade da fatia. Use a mesma espessura de pilha Z para todas as imagens em um conjunto experimental para que a mesma quantidade de tecido seja ensaiada em todas as amostras. Se não estiver usando um microscópio que fotografa pilhas Z, foque a imagem no meio da fatia.
- Imagem de todos os três canais de fluoróforos em uma aquisição Z-stack. Todos os três canais são necessários para identificar positivamente uma célula moribunda. Imagem de uma área por organoide.
- Salve o conjunto de imagens em um formato de arquivo que preserve a proporção de área por pixel.
10. Quantificação de células moribundas
- Abra pilhas de imagens no software FIJI (Image J). Na janela Opções de importação de bioformatos , verifique se nenhuma caixa na seção "dividir em janelas separadas" está selecionada. A rolagem entre canais de imagem alinhados é fundamental para identificar adequadamente as células.
- Nivele o conjunto de imagens Z-stack clicando em Image > Stacks e selecione 'Z project' no menu suspenso. Isso criará uma nova imagem para quantificação. Se os organoides não foram fotografados na série Z, pule esta etapa.
- Selecione o canal de imagem que mostra a coloração do Recoverin (vermelho, neste exemplo). Clique na ferramenta de seleção de polígonos na barra de ferramentas e contorne uma região contínua de fotorreceptores na imagem (Figura 3A). Clique em Analisar > Definir Medidas. Na janela pop-up Definir medidas , selecione a caixa ao lado de Área, clique em Analisar e selecione Medir para medir a área (ou pressione "m" como atalho) dos fotorreceptores para contar as células moribundas. A medida da área aparecerá em uma janela pop-up de medições.
- Contar os núcleos positivos para TUNEL na região fotorreceptora previamente selecionada (Figura 3B,C). Clique com o botão direito do mouse na ferramenta de ponto na barra de ferramentas e selecione a ferramenta multiponto. Somente no canal TUNEL, clique na coloração positiva TUNEL que se sobrepõe a um núcleo DAPI positivo e na coloração Recoverin. Alterne entre os canais para validar células positivas.
- Divida o número de células positivas para TUNEL pela área para obter um valor normalizado para a morte celular em fotorreceptores por organoide (Figura 2D,E).
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Representative Results
Os organoides da retina foram gerados a partir de uma linha iPSC não-controle MacTel. Após os organoides atingirem 26 semanas de cultura, eles foram selecionados e divididos em grupos experimentais. Os organoides foram tratados com concentrações variáveis de deoxySA para determinar se a desoxiSA é tóxica para fotorreceptores. Quatro concentrações de deoxySA foram testadas, de 0 a 1 μM (Figura 2) e organoides foram tratados por 8 dias, com trocas de meios a cada dois dias. A morte celular em resposta à desoxiSA é concentração-dependente e detectável em até 50 nM de desoxiSA (Figura 2D). A maior concentração testada, 1 μM de desoxiSA, proporcionou um efeito robusto, mantendo a integridade do organoide retiniano (Figura 2B,D). Uma concentração maior de 5 μM de desoxiSA causou desintegração dos organoides em poucos dias (dados não mostrados). Os resultados da resposta à dose de deoxySA determinaram a concentração ótima de deoxySA para futuros experimentos de toxicidade. A dose de 1 μM de desoxiSA resultou em morte celular substancial sem toxicidade por saturação, como foi observado em 5 μM.
Para testar a capacidade do fenofibrato de resgatar a morte celular induzida por desoxiSA, organoides da retina foram tratados com 1 μM de desoxiSA, 1 μM de desoxiSA mais 20 μM de fenofibrato ou um controle de veículo sem tratamento (Figura 2A-C,E). O tratamento com fenofibrato 20 μM preveniu a toxicidade induzida pelo desoxiSA nos fotorreceptores dos organoides da retina, reduzindo significativamente a morte celular em aproximadamente 80% após 4 dias de tratamento (Figura 2A-C,E)16. Drogas adicionais que alteram os lipídios foram testadas usando o mesmo protocolo, incluindo fumonosina-B1, que mostrou um resgate completo da toxicidade da desoxiSA. Espécies lipídicas relacionadas também foram testadas para identificar o metabólito específico do esfingolipide a jusante que leva à morte de células fotorreceptoras14.
Figura 1: Imagens representativas de campo brilhante de organoides sob microscópio de luz invertida . (A) Organoides com 4 semanas de idade aos 2 dias após o descolamento mostram camadas retinianas apropriadas (branco*) ou desenvolvimento organoide não retiniano. (B) Desenvolvimento de organoides na semana 13. (C) Organoides da retina na semana 28 com camadas retinianas claras e segmentos externos bem formados projetando-se da camada fotorreceptora externa (barra branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens confocais representativas da morte celular. Imagens confocais representativas da morte celular (TUNEL, verde) dentro da camada fotorreceptora (Recoverin, vermelho) do organoide da retina após 4 dias de tratamento com meio controle (A), 1 μM deoxySA (B) ou 1 μM deoxySA com 20 μM fenofibrato (C). (D) Quantificação da morte celular em fotorreceptores humanos após tratamento de tecido organoide da retina com concentrações variáveis de deoxySA. (E) Quantificação da morte celular em fotorreceptores humanos após tratamento de tecido organoide da retina com meio controle (n=6), 1 μM deoxySA (n=22), 1 μM deoxySA + 20 μM fenofibrato (n=21). *p<0.05, ***p<0.001 com ANOVA unidirecional e teste post hoc de Tukey. Dados derivados do New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. e Wallace. M., et al. Serina e metabolismo lipídico na doença macular e neuropatia periférica, 381(15), 1422-1433, Copyright © (2019) Massachusetts Medical Society. Reimpresso com permissão. 14Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Capturas de tela mostrando uma imagem confocal de um organoide seccionado e corado tratado com 1 μM de desoxiSA visualizado usando o software FIJI. Os canais fluorescentes foram divididos em α-Recoverin (A, vermelho), TUNEL (B, verde) e DAPI (C, azul). (A) A área do fotorreceptor foi delineada usando a ferramenta de polígono selecionada na barra de ferramentas (canto superior esquerdo). (B,C) Contagem de células usando a ferramenta multiponto, selecionada na barra de ferramentas, de células positivas para TUNEL (B, verde) e positivas para DAPI (C, azul) dentro da camada fotorreceptora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Variações do protocolo de diferenciação
Desde a invenção das taças ópticas autoformadoras pelo grupo de YoshikiSasai20, muitos laboratórios desenvolveram protocolos para gerar organoides da retina que podem variar em quase todas as etapas5,18,19,21. Uma lista exaustiva de protocolos pode ser encontrada em Capowski et al.22. O protocolo de diferenciação que fornecemos aqui é um protocolo simples e de baixa intervenção que fornece um bom ponto de partida para qualquer laboratório que tente diferenciar organoides maduros da retina. Os usuários são encorajados a explorar e adotar variações neste protocolo. Passos comuns para a variação do protocolo são a produção e diferenciação precoce de EBs e o uso de fatores de diferenciação como BMP4, DKK-1 ou ácido retinóico para melhorar a eficiência 5,19,23.
Cultivar organoides em um agitador durante grande parte do desenvolvimento em estágio final tem sido um passo eficaz para aumentar a eficiência da diferenciação e reduzir o tempo gasto manipulando organoides. Os biorreatores atingem os mesmos fins24, no entanto, o uso de um agitador com frascos descartáveis de Erlenmyer é mais econômico e pode ser feito com equipamentos comuns de laboratório. A principal vantagem de manter os organoides em suspensão mobilizada é que elimina a necessidade de separar organoides que grudam juntos na placa enquanto estão crescendo. As culturas em suspensão também facilitam uma maior troca de nutrientes, de modo que os organoides tendem a crescer mais do que aqueles em uma placa padrão parada. Por essa razão, é bom começar fragmentando os EBs chapeados o menor possível na etapa 4.1.
Como a obtenção de organoides retinianos maduros requer a diferenciação de uma única cultura por quase 6 meses, a realização de ensaios de toxicidade em organoides da retina pode parecer demorada em comparação com o uso de uma monocultura 2D. No entanto, os ensaios de toxicidade são realizados em uma única linha de controle, e as diferenciações podem ser estabelecidas rotineiramente. Após um investimento inicial de 6 meses, um fornecimento regular de organoides para realizar experimentos adicionais e modificações de protocolo estará à disposição sem demora. Iniciar 2-3 rodadas de diferenciação organoide retiniana a cada 1-2 meses fornece amplo tecido para conjuntos complexos e completos de experimentos.
Os organoides fornecem um modelo versátil para testes direcionados de drogas.
Este protocolo descreve um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para testar a eficácia de drogas que alteram os lipídios no resgate da morte celular induzida por desoxiSL. Embora esta seja uma aplicação específica que mostra um resgate farmacológico para um agente causador de doença no MacTel, este protocolo pode ser utilizado para testar qualquer número de insultos (por exemplo, deficiência de nutrientes, condições hipóxicas, toxicidade luminosa) e resgates farmacológicos. Portanto, pode ser adaptado para modelar outras doenças da retina. Em nosso próprio trabalho, mostramos que, usando esse mesmo protocolo e substituindo várias espécies relacionadas de esfingolipídios e drogas que bloqueiam diretamente o metabolismo esfingolipídico, também fomos capazes de fornecer informações sobre o mecanismo da doença de MacTel, determinando o metabólito tóxico específico a jusante do esfingolipide que leva à morte celular fotorreceptora14 . Ao contrário da modelagem de doenças em nível de mutações genéticas, que requerem o estabelecimento de linhagens iPSC variantes, o uso de organoides para modelar condições metabólicas tóxicas e estressores ambientais permite o uso de uma linha de iPSC de controle comum como um modelo dinâmico com fonte de tecido abundante e prontamente disponível.
Os modelos organoides humanos são particularmente vantajosos quando se estudam doenças metabólicas na retina, onde diferentes tipos celulares têm uma interação metabólica simbiótica única que não pode ser replicada em uma monoculturade células fotorreceptoras-símil4. Este complexo modelo metabólico nos permitiu descobrir a eficácia da droga fenofibrato na prevenção dos efeitos tóxicos dos desoxiSLs diretamente em humanos. Em modelos murinos de desoxiSLselevados 14 (dados não publicados) e em modelos de cultura de células de fibroblastos embrionários de camundongos do metabolismo do desoxiSL, o fenofibrato mostrou-se ineficaz16. Testar drogas no contexto de modelos complexos de tecidos humanos nos permitirá identificar tratamentos eficazes e descartar tratamentos ineficazes que, de outra forma, teriam sido perdidos se dependêssemos apenas de camundongos ou monoculturas simplistas.
Desenvolvimento futuro para triagem de medicamentos
Neste protocolo quantificamos a apoptose em fotorreceptores, o tipo celular mais abundante. No entanto, utilizando qualquer um dos anticorpos comprovados que marcam especificamente os outros tipos de células da retina, este protocolo é modificável para determinar a morte celular em qualquer tipo de célula da retina, ou subtipo celular (por exemplo, cone vs bastonete). A desvantagem de quantificar a apoptose usando a coloração TUNEL em cortes de tecido é que é uma técnica de baixo rendimento para quantificar a morte celular, limitando a aplicação deste ensaio à triagem de pequenas listas de drogas candidatas. Uma tela maior de bibliotecas de drogas não direcionadas não seria viável usando uma abordagem IHC. Desenvolvimentos futuros nesse protocolo para facilitar maiores rastreios de drogas exigiriam a integração de um marcador de morte celular mais facilmente quantificável. Enquanto estes estão disponíveis, a irregularidade dos organoides da retina em tamanho, presença ou ausência de apêndices teciduais não-retinianos, e variabilidade na qualidade da camada fotorreceptora torna difícil normalizar os resultados entre organoides. Esperamos que desenvolvimentos futuros para aumentar o rendimento de modelos de doenças organoides humanas para examinar grandes bibliotecas de medicamentos melhorem enormemente nossa capacidade de descobrir, modificar e validar medicamentos que avançarão de ensaios pré-clínicos para terapêuticas aprovadas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Apoiado pelo Lowy Medical Research Institute. Gostaríamos de agradecer à família Lowy por seu apoio ao projeto MacTel. Gostaríamos de agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke por sua contribuição intelectual e assistência na preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
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