Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Summary

Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Abstract

L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.

Introduction

Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et^{ainsi de suite, sont} connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement². Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicame....

Protocol

1. Matériaux et reagents

1. Utilisez des solutions pyrogéniques gratuites et moyennes pour la culture cellulaire( tableau 1).
2. Préparez des solutions pour l’expérience biochimique en utilisant de l’eau ultrapure et utilisez-la sans DNase/RNase.
3. Sélectionnez un FBS approprié pour la culture cellulaire avec un processus de vérification de lot. Étant donné que le lot FBS sélectionné change régulièrement, le catalogue et le numéro de lot de FBS ne peuvent pas être représentés ici.
4. ADN plasmide
   1. Préparer pmeGFP-N1^{5 pour l’expression} monomère eGFP; pmeGFP-C1-TDP25^{6 pour}

Results

Nous avons effectué la mesure fcs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire et SOD1-G85R-GFP dans les cellules vivantes. Dans les deux cas, une amplitude positive et des APF lisses ont pu être acquis. Nous avons montré qu’une partie du GFP-TDP25 exprimée dans les cellules Neuro2a a été récupérée dans la fraction soluble dans l’état indiqué⁶. Dans la fraction soluble du lysate cellulaire, des molécules de fluorescence extrêmement brillantes ont été détectées dans l’enregistrement du taux de nombre de .......

Discussion

En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du sténopé. Des taux extr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % (p/v) Trypsine-1 mmol/L EDTA· ; Solution de 4Na avec rouge de phénol (trypsine-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Plats en plastique de 100 mm	CORNING	430167
Plat à base en verre de 35 mm	IWAKI	3910-035	Pour la mesure de cellules vivantes
Plats en plastique de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Plaque en aluminium	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Grattoir à cellule d’objectif
	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Membrane filtrante en acétate de cellulose (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Chambre de couverture en verre 8 puits	IWAKI	5232-008	Pour
la mesure de la solution Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Milieu basal
Sérum fœtal bovin (FBS)	biosera		Vérification du lot requise
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		Système FCS
Neuroblastome murin Cellules Neuro2a	ATCC	CCL-131	Lignée cellulaire
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	ADN plasmidique pour le transporteur de transfection
Solution de pénicilline-streptomycine (& fois ; 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			ADN plasmidique pour TDP25 marqué avec un eGFP monomère
pmeGFP-N1			ADN plasmidique pour l’expression de monomères eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			plasmidique pour le mutant G85R lié à la SLA de SOD1 marqué avec un cocktail monomère d’inhibiteur de
protéase	Sigma-Aldrich	P8304