Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Summary

Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Abstract

L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.

Introduction

Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et^{ainsi de suite, sont} connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement². Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicaments) n’ont pas encore été établis. De plus, la façon dont l’agrégation protéique exerce une toxicité reste insaisissable. Par conséquent, pour promouvoir des projets de recherche liés à l’agrégation des protéines, il est important d’introduire des procédures à haut débit pour détecter simplement l’agrégation des protéines. La détection de l’agrégation protéique à l’aide d’anticorps reconnaissant la conformation de l’agrégation protéique et du colorant fluorescent spécifique à l’agrégation a été^{largement utilisée 3}. Cependant, il est difficile de détecter l’agrégation, en particulier dans les cellules vivantes en utilisant de telles procédures classiques.

Le transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) est une procédure de détection de l’agrégation des protéines et des changements structurels. Toutefois, fret est incapable d’analyser la dynamique protéique (p. ex., diffusion et oligomérisation des protéines dans les cellules vivantes)³. Par conséquent, nous introduisons ici un protocole simple pour détecter l’agrégation des protéines dans la solution (par exemple, le lysate cellulaire) et les cellules vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui mesure la propriété de diffusion et la luminosité des molécules fluorescentes avec une seule sensibilité molécule⁴. FCS est une méthode de comptage des photons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSM). À l’aide d’un détecteur de photons hautement sensible et du calcul de la fonction d’autocorrépendance (ACF) de l’heure d’arrivée des photons, le passage à travers le temps et la luminosité des molécules fluorescentes dans le volume de détection est mesuré. La diffusion ralentit avec une augmentation du poids moléculaire; ainsi, l’interaction intermoléculaire peut être estimée à l’aide de FCS. Plus puissamment encore, une augmentation de la luminosité de la molécule fluorescente indique l’homo-oligomérisation des molécules. Par conséquent, FCS est un outil puissant pour détecter une telle agrégation de protéines.

Protocol

1. Matériaux et reagents

1. Utilisez des solutions pyrogéniques gratuites et moyennes pour la culture cellulaire( tableau 1).
2. Préparez des solutions pour l’expérience biochimique en utilisant de l’eau ultrapure et utilisez-la sans DNase/RNase.
3. Sélectionnez un FBS approprié pour la culture cellulaire avec un processus de vérification de lot. Étant donné que le lot FBS sélectionné change régulièrement, le catalogue et le numéro de lot de FBS ne peuvent pas être représentés ici.
4. ADN plasmide
   1. Préparer pmeGFP-N1^{5 pour l’expression} monomère eGFP; pmeGFP-C1-TDP25^{6 pour} l’expression GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R^{7 pour} l’expression SOD1-G85R-GFP; et pCAGGS^{8 en} tant que transporteur.
      REMARQUE : le meGFP est une variante monomère portant la mutation A206K du GFP amélioré (eGFP). TDP25 est un fragment de terminal C associé à la SLA de TDP-43. SOD1-G85R est un mutant associé à la SLA de SOD1.
5. Souche cellulaire
   1. Utilisez des cellules neuroblastome neuro2a murines.
      REMARQUE : Les cellules Neuro2a ont une efficacité élevée en transfection et des protéines exogènes hautement expresses. Pour l’expression TDP25, des souches cellulaires ayant une efficacité d’expression élevée comme les cellules Neuro2a ou HEK293 sont nécessaires. Dans les cellules HeLa, TDP25 n’a pas pu être efficacement exprimé.

2. Culture cellulaire et transfection

1. Préparer un plat en plastique de 100 mm qui pousse les cellules Neuro2a de façon semi-confluente dans un milieu de croissance normal.
   REMARQUE : Il est nécessaire d’incuber à 37 °C pendant environ 48 à 72 heures après l’ensemencement précédent jusqu’à ce que la semi-confluence soit atteinte.
2. Retirer le milieu.
3. Ajouter 0,5 mL de solution trypsine-EDTA dans le plat de culture cellulaire et les incuber à 37 °C pendant 1 min.
4. Ajouter 9,5 mL de milieu de croissance normal dans le plat et suspendre les cellules détachées.
5. En utilisant trypan bleu pour tacher les cellules mortes, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou manuellement. Puis diluer les cellules dans le milieu de la culture (1,0 × 10⁵/mL).
6. Ajouter 2 mL de suspension cellulaire dans un plat en plastique de 35 mm pour la lyse cellulaire ou un plat de base en verre pour la mesure des cellules vivantes.
7. Incuber le plat à 37 °C pendant 1 jour.
8. Commencez les préparatifs suivants 15 minutes avant le jour de la transfection.
9. Préparer deux tubes de 1,5 mL et ajouter 100 μL d’Opti-MEM I à chaque tube.
10. Dans le premier tube, mélanger 1,0 μg d’ADN plasmide (solution A). Dans le deuxième tube, mélanger 2,5 μL de Lipofectamine 2000 (Solution B).
    REMARQUE : Pour maintenir l’efficacité de la transfection, maintenez la quantité totale d’ADN la même. Pour réduire le niveau d’expression de la mesure du SFC dans les cellules vivantes, la fraction de l’ADN plasmide pour l’expression des protéines devrait diminuer (p. ex., 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R et 0,8 μg de mélange pCAGGS). En outre, gardez le même rapport entre le volume de Lipofectamine 2000 et la quantité d’ADN plasmide.
11. Mélanger délicatement la solution A et B en ajoutant un dans l’un ou l’autre tube, puis l’incuber pendant 1 min à température ambiante (solution C).
12. Ajouter la solution C au milieu culturel; et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C.

3. Lyse cellulaire et échange moyen

1. Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope de routine.
2. Retirer le milieu dans le plat.
3. Ajouter 2 mL de PBS à 25 °C pour laver le milieu. Retirez le PBS.
4. Déposer le plat sur une plaque d’aluminium sur la glace concassée.
   REMARQUE : Nous utilisons une plaque d’aluminium de 1 mm d’épaisseur coupée dans un magasin d’outils du dimanche ou disponible dans le commerce comme équipement de laboratoire.
5. Ajouter 200 μL de tampon de lyse à 4 °C. Secouez légèrement le plat afin que le tampon soit réparti uniformément au fond du plat.
6. Racler le plat à l’aide d’un grattoir cellulaire et récupérer le lysate avec des débris cellulaires non résolus dans un nouveau tube de 1,5 mL.
7. Centrifugeuse de la solution à 20 400 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
8. Récupérez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL et gardez-le à 4 °C ou sur la glace.
   REMARQUE : Ne pas congeler le lysate.
9. Pour les mesures des cellules vivantes, remplacez le milieu avant la mesure. Vérifiez l’attachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Confirmer l’expression à l’aide d’un microscope à fluorescence.

4. Étalonnage de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

1. Démarrez le système et exécutez le logiciel d’opération. Allumez l’Argon⁺ laser (458/477/488/514 nm). Stabiliser le système au moins pendant 30 min.
2. Configurer le chemin optique: Splitter faisceau principal: HFT488; Miroir dichroïque: NFT600; Filtre barrière de fluorescence : filtre à bande 505-540 (BP505-540); Détecteur : photodiode d’avalanche (APD)).
3. Réglez la taille du sténopé en entrant la valeur directement (66 μm; 1 unité aéroy).
4. Ajouter la solution Rhodamine 6G (Rh6G) dans un puits de la chambre de verre de couverture sur la scène.
5. Ajouter l’eau ultrapure d’immersion sur l’objectif. N’utilisez pas l’huile d’immersion.
6. Placez la chambre au microscope. Déplacez l’étape à la position appropriée.
7. Concentrez-vous sur la surface supérieure du verre en mesurant la lumière éparse de la surface vitrée. Après avoir abaissé l’objectif vers le bas, tournez le bouton de mise au point dans le sens des aiguilles d’une montre pour régler.
   REMARQUE: Vérifiez la direction de rotation du bouton de mise au point car il est opposé entre ceux fabriqués au Japon et en Allemagne.
8. Soulevez le point focal à 200 μm au-dessus de la surface supérieure du verre pour observer l’intérieur de la solution.
9. Cliquez sur le taux de comptage et surveillez le taux de dénombrement des photons.
10. Augmenter graduellement la valeur des filtres à thon acousto-optique (AOTF) (p. ex., transmission au laser excitation) de sorte que la valeur du taux de comptage est supérieure à 10 kHz.
11. Cliquez sur l’ajustement du sténopé et ouvrez l’assistant d’ajustement du sténopé. Trouvez la position du sténopé avec le plus grand nombre (un pic) de photons dans l’axe x et y.
12. Tournez l’anneau de correction de la lentille objective de sorte que les comptes par molécule (CPM) valeur est la plus élevée.
    REMARQUE : Puisque l’épaisseur du verre de couverture de la chambre spécifiée ici est de 0,12-0,17 mm, l’anneau de correction est à peu près à son minimum ou à quelques tours de celui-ci, où le CPM est à son maximum.
13. Diminuez progressivement la valeur AOTF de sorte que la valeur CPM devient 2-3 kHz.
14. Acquérir la fonction d’autocorréation (ACF) de Rh6G pour 90 s.
15. Une fois la mesure terminée, cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de l’ajustement de la courbe.
16. Sélectionnez un modèle pour une diffusion tridimensionnelle (3D) à un composant avec un état triplet.
    REMARQUE : Le Rh6G est monodisperse et diffus en un seul composant avec un état triplet.
17. Réglez l’heure de départ appropriée en déplaçant la ligne rouge. Cliquez sur Fit All et vérifiez l’écart d’ajustement. Après avoir effectué le raccord de courbe, assurez-vous que le temps de diffusion (DT) et le paramètre de structure (SP) sont à peu près dans la gamme de 20-30 μs et 4-8, respectivement.
18. Rappelez-vous la valeur des paramètres structurels. Utilisez la valeur SP pour l’analyse du raccord de courbe de tous les APF mesurés le même jour, dans les mêmes conditions optiques, et en utilisant le même type de plat de base en verre ou de verre de couverture chambé placé sur la scène du microscope.

5. Mesure fcs dans le lysate cellulaire

1. Préparer les lysates cellulaires (voir ci-dessus).
2. Déposer le lysate sur la chambre en verre de couverture. Placez un couvercle pour éviter le séchage et le couvercle de scène pour l’ombrage léger.
3. Définissez l’état d’acquisition, la puissance laser, le temps de mesure et les répétitions.
4. Cliquez sur le taux de comptage et ajustez la valeur AOTF du laser de sorte que la valeur CPM devient supérieure à 1 kHz.
5. Effectuez une mesure d’essai pendant 1 min. Vérifiez si l’ACF calculé montre une amplitude positive et une désintégration lisse.
6. Effectuez la mesure principale pendant 5 min.
   REMARQUE : Le temps total de mesure est progressivement augmenté jusqu’à ce que la forme de l’ACF ne change pas même si le temps de mesure est augmenté.
7. Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe.
8. Sélectionnez un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet. N’oubliez pas d’entrer la valeur SP et de modifier son paramètre en « Fixe » et non « Gratuit » avant de cliquer sur Fit all.
9. Exportez la table équipée comme un fichier texte délimité par onglet.
10. Si nécessaire, exportez l’enregistrement des taux ACF et Count sous forme de fichier texte délimité par onglets.

6. Mesure fcs dans les cellules vivantes

1. Remplacer le milieu par un milieu frais avant la mesure.
2. Utilisez un incubateur de stades thermiques. Placez le plat de culture cellulaire sur la scène du microscope.
3. Confirmez la mise au point et la position à l’aide du micrope confocal. Sélectionnez la cellule de mesure. Zoomez et ajustez la position de la cellule. Obtenez des images de fluorescence d’une cellule exprimant le GFP en utilisant le mode vitesse de balayage lent.
4. Sélectionnez une position de mesure FCS à l’aide de la position dans la section « FCS ».
5. Sélectionnez au moins un point de mesure FCS à l’aide d’un réticule(figure 1).
6. Mesurer l’ACF pendant 1 min.
   REMARQUE : Étant donné que les protéines fluorescentes ont tendance à être photobleached dans les cellules vivantes en raison du mouvement lent comparé à la solution, le temps de mesure devrait être minimum. Il est généralement difficile d’obtenir de l’ACF dans la cellule aussi facilement que les mesures de solution parce que la mesure prolongée conduira à la photobleaching des protéines fluorescentes.
7. Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe à l’aide d’un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet.
   REMARQUE : Pour les mesures des cellules vivantes, un modèle de diffusion 3D à deux composants à l’état triplet serait préférable parce qu’il est empiriquement difficile de diminuer la valeur chi-carrée avec un modèle de diffusion 3D à un composant en raison de l’existence de divers composants mobiles dans la cellule vivante. Mais même en utilisant un modèle pour la diffusion 3D à trois composants, les composants de diffusion ne sont généralement pas séparés par rapport à l’utilisation du modèle pour deux composants.

Results

Nous avons effectué la mesure fcs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire et SOD1-G85R-GFP dans les cellules vivantes. Dans les deux cas, une amplitude positive et des APF lisses ont pu être acquis. Nous avons montré qu’une partie du GFP-TDP25 exprimée dans les cellules Neuro2a a été récupérée dans la fraction soluble dans l’état indiqué⁶. Dans la fraction soluble du lysate cellulaire, des molécules de fluorescence extrêmement brillantes ont été détectées dans l’enregistrement du taux de nombre de ...

Discussion

En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du sténopé. Des taux extr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % (p/v) Trypsine-1 mmol/L EDTA· ; Solution de 4Na avec rouge de phénol (trypsine-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Plats en plastique de 100 mm	CORNING	430167
Plat à base en verre de 35 mm	IWAKI	3910-035	Pour la mesure de cellules vivantes
Plats en plastique de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Plaque en aluminium	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Grattoir à cellule d’objectif
	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Membrane filtrante en acétate de cellulose (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Chambre de couverture en verre 8 puits	IWAKI	5232-008	Pour
la mesure de la solution Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Milieu basal
Sérum fœtal bovin (FBS)	biosera		Vérification du lot requise
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		Système FCS
Neuroblastome murin Cellules Neuro2a	ATCC	CCL-131	Lignée cellulaire
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	ADN plasmidique pour le transporteur de transfection
Solution de pénicilline-streptomycine (& fois ; 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			ADN plasmidique pour TDP25 marqué avec un eGFP monomère
pmeGFP-N1			ADN plasmidique pour l’expression de monomères eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			plasmidique pour le mutant G85R lié à la SLA de SOD1 marqué avec un cocktail monomère d’inhibiteur de
protéase	Sigma-Aldrich	P8304