Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Denne protokollen presenterer en komplett eksperimentell arbeidsflyt for å studere RNA-proteininteraksjoner ved hjelp av optisk pinsett. Flere mulige eksperimentelle oppsett er skissert, inkludert kombinasjonen av optisk pinsett med konfikal mikroskopi.

Abstract

RNA vedtar forskjellige strukturelle folder, som er avgjørende for sine funksjoner og dermed kan påvirke ulike prosesser i cellen. I tillegg kan strukturen og funksjonen til en RNA moduleres av ulike transvirkende faktorer, for eksempel proteiner, metabolitter eller andre RNAer. Frameshifting RNA molekyler, for eksempel, er regulatoriske RNAer plassert i koding regioner, som direkte oversette ribosomer til en alternativ åpen leseramme, og dermed fungere som genbrytere. De kan også vedta forskjellige folder etter binding til proteiner eller andre transfaktorer. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det avgjørende å studere samspillet og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene samtidig. Dette arbeidet illustrerer hvordan man bruker enkeltmolekyl-fluorescens-koblede optiske pinsett for å utforske konformasjons- og termodynamisk landskap av RNA-proteinkomplekser med høy oppløsning. Som et eksempel utarbeides samspillet mellom SARS-CoV-2 programmert ribosomal frameshifting element med transvirkende faktor kort isoform av sinkfinger antiviralt protein. I tillegg ble fluorescensmerkede ribosomer overvåket ved hjelp av den konfekale enheten, noe som til slutt ville muliggjøre studiet av oversettelsesforlengelse. Fluorescens koblet OT-analyse kan brukes mye for å utforske forskjellige RNA-proteinkomplekser eller transvirkende faktorer som regulerer oversettelsen og kan lette studier av RNA-basert genregulering.

Introduction

Overføring av genetisk informasjon fra DNA til proteiner gjennom mRNAer er en kompleks biokjemisk prosess, som er nøyaktig regulert på alle nivåer gjennom makromolekylære interaksjoner inne i celler. For translasjonsregulering gir RNA-proteininteraksjoner en kritisk rolle for raskt å reagere på ulike stimuli og signaler1,2. Noen RNA-proteininteraksjoner påvirker mRNA-stabiliteten og endrer dermed tiden en RNA er translasjonelt aktiv. Andre RNA-protein interaksjoner er forbundet med omkodingsmekanismer som stop-codon readthrough, bypassing eller programmert ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nylig har en rekke RNA-bindende proteiner (RBPer) vist seg å samhandle med stimulatoriske mRNA-elementer og oversettelsesmaskineriet for å diktere når og hvor mye omkoding som vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det derfor avgjørende å studere interaksjonsprinsippene og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene i detalj.

Tiår med arbeid har lagt grunnlaget for å studere flertrinns- og flerkomponentprosessen for oversettelse, som er avhengig av intrikat kommunikasjon mellom RNA og proteinkomponentene i oversettelsesmaskineriet for å oppnå hastighet og nøyaktighet12,13,14. Et avgjørende neste skritt for å forstå komplekse regulatoriske hendelser er å bestemme krefter, tidsskalaer og strukturelle determinanter under oversettelse med høy presisjon12,15,16,17. Studien av RNA-konformasjonsdynamikk og spesielt hvordan transvirkende hjelpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversettelse har blitt ytterligere opplyst av fremveksten av enkeltmolekylverktøy, inkludert optiske pinsett eller nullmodusbølgeledere16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optisk pinsett (OT) representerer en svært presis enkeltmolekylteknikk, som har blitt brukt til å studere mange slags RNA-avhengige dynamiske prosesser, inkludert transkripsjon, og oversettelse26,27,28,29,30,31,32. Bruken av optiske pinsett har gjort det mulig å undersøke molekylære interaksjoner, nukleinsyrestrukturer og termodynamiske egenskaper, kinetikk og energi av disse prosessene i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pinsettanalyse er basert på entrapment av mikroskopiske objekter med en fokusert laserstråle. I et typisk OT-eksperiment er interessemolekylet bundet mellom to gjennomsiktige (vanligvis polystyren) perler (figur 1A)27. Disse perlene blir deretter fanget av optiske feller, som oppfører seg som fjærer. Dermed kan kraften som påføres molekylet beregnes basert på perlens forskyvning fra midten av den fokuserte laserstrålen (fellesenteret). Nylig har optisk pinsett blitt kombinert med konfektmikroskopi (figur 1B), noe som muliggjør fluorescens eller Förster resonansenergioverføring (FRET) målinger40,41,42. Dette åpner et helt nytt felt av mulige eksperimenter som tillater samtidig måling og derfor presis korrelasjon av kraftspektroskopi- og fluorescensdata.

Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjelp av de optiske pinsettene kombinert med konfikal mikroskopi for å studere protein-RNA-interaksjoner som regulerer translasjonell frameshifting. Mellom målsettingen og kondensatoren muliggjør en strømningscelle med fem kanaler kontinuerlig prøveapplikasjon med laminær strømning. Gjennom mikrofluidiske kanaler kan ulike komponenter injiseres direkte, noe som reduserer den praktiske tiden, samt tillater svært lite prøveforbruk gjennom hele eksperimentet.

For det første foreslås en grunnleggende retningslinje for å bistå utformingen av OT-eksperimenter, og fordeler samt fallgruver i ulike oppsett diskuteres. Deretter beskrives utarbeidelsen av prøver og eksperimentelle arbeidsflyter, og en protokoll for dataanalysen er gitt. For å representere et eksempel skisserer vi resultatene fra RNA-strekkeksperimenter for å studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med transvirkende faktor den korte isoformen av sinkfinger antiviralt protein (ZAP), som endrer oversettelsen av viral RNA fra en alternativ leseramme43. I tillegg er det demonstrert at fluorescensmerkede ribosomer kan brukes i denne OT-konfiskeringsanalysen, noe som vil være nyttig for å overvåke prosessiviteten og hastigheten til oversettelsesmaskineriet. Metoden som presenteres her, kan brukes til raskt å teste effekten av forskjellige buffere, ligander eller andre cellulære komponenter for å studere ulike aspekter ved oversettelse. Til slutt diskuteres vanlige eksperimentelle fallgruver og hvordan du feilsøker dem. Nedenfor er noen viktige punkter i eksperimentell design skissert.

Konstruere design
I prinsippet er det to vanlige tilnærminger for å skape en OT-kompatibel RNA-konstruksjon. Den første tilnærmingen bruker et langt RNA-molekyl som er hybridisert med komplementære DNA-håndtak, og gir dermed en konstruksjon som består av to RNA / DNA-hybridregioner som flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (figur 2B). Denne tilnærmingen brukes i de fleste OT RNA-eksperimenter33,44,45.

Den andre tilnærmingen utnytter dsDNA-håndtak med korte (rundt 20 nt) overheng15,17. Disse overhengene blir deretter hybridisert med RNA-molekylet. Selv om det er mer komplisert i design, overvinner bruken av dsDNA-håndtak noen av begrensningene i DNA / RNA-hybridsystemet. I prinsippet kan selv svært lange håndtak (>10kb) implementeres, noe som er mer praktisk for konfiskeringer. I tillegg kan RNA-molekylet ligateres til DNA-håndtak for å øke tetherstabiliteten.

Strategi for sluttmerking
Konstruksjonen må knyttes til perler via en sterk molekylær interaksjon. Mens det er tilnærminger tilgjengelig for kovalent binding av håndtak til perler46, brukes sterke, men ikke-kovalente interaksjoner som streptavidin-biotin og digoxigenin-antistoff ofte i OT-eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokollen er konstruksjonen merket med biotin eller digoksigenin, og perlene er belagt med streptavidin eller antistoffer mot henholdsvis digoxigenin (figur 1A). Denne tilnærmingen vil være egnet for påføring av krefter opp til ca. 60 pN (per tether)47. Videre tillater bruken av forskjellige 5' og 3 ' merkingsstrategier å bestemme orienteringen av tether dannet mellom perlene17.

Proteinmerking for fluorescensmålinger
For den kondokale avbildningen er det flere ofte brukte tilnærminger for fluorescensmerking. For eksempel kan fluoroforer festes kovalent til aminosyrerester som finnes innfødt i proteiner eller introdusert av stedsstyrt mutagenese gjennom en reaktiv organisk gruppe. Tiol- eller aminreaktive fargestoffer kan brukes til merking av henholdsvis cystein- og lysinrester. Det finnes flere reversible beskyttelsesmetoder for å øke spesifisiteten til merkingen av48,49, men innfødte proteiner vil vanligvis bli merket ved flere rester. Selv om den lille størrelsen på fluoroforen kan gi en fordel, kan ikke-spesifikk merking forstyrre proteinaktiviteten og dermed kan signalintensiteten variere49. Avhengig av etiketteffektivitetssignalintensiteten kan det også variere mellom forskjellige eksperimenter. Derfor bør en aktivitetskontroll utføres før eksperimentet.

I tilfelle proteinet av interesse inneholder en N- eller C-terminal tag, for eksempel en His-tag eller strep-tag, representerer spesifikk merking av disse taggene en annen populær tilnærming. Videre reduserer tag-målrettet merking sjansen for at fluoroforen forstyrrer proteinaktiviteten og kan forbedre løseligheten49. Tag-spesifikk merking gir imidlertid vanligvis mono-fluoroformerkede proteiner, noe som kan være utfordrende å oppdage. En annen måte å spesifikk merking kan oppnås ved å bruke antistoffer.

Oppsett av mikrofluidikk
Kombinasjonen av OT med et mikrofluidikksystem muliggjør en rask overgang mellom ulike eksperimentelle forhold. Videre utnytter nåværende systemer å opprettholde laminærstrømmen inne i strømningscellen, noe som utelukker blanding av væsker fra andre kanaler i vinkelrett retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminær strømning spesielt fordelaktig for eksperimentell design. For tiden brukes flytceller med opptil 5 kanaler ofte (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøvepreparering

  1. Klone sekvensen av interesse inn i vektoren som inneholder Lambda DNA fragmenter, som tjener som håndtak sekvenser (Figur 2)43,50.
  2. Generer først en DNA-mal for påfølgende in vitro-transkripsjon via PCR (figur 2B, reaksjon 1). På dette PCR-trinnet blir T7-promotoren lagt til i 5' enden av sansen DNA-molekyl32,33,43,50. Still inn PCR-reaksjonen i henhold til tabell 1. Kjør PCR i 50 μL aliquots med passende sykluser i termocycleren.
  3. Klargjør håndtakene med to separate PCR-reaksjoner (tabell 1, figur 2B, reaksjon 2 og 3). Først genererer du 5'-håndtaket av PCR. Generer deretter 3'håndtaket og merk det samtidig med digoxigenin ved å bruke en 5 ' digoxigenin-merket primer32,33,43,50.
  4. Etter PCR, rense DNA ved hjelp av silika spinn kolonner.
  5. Utfør in vitrotranskripsjonsreaksjonen ved hjelp av T7 RNA-polymerase (tabell 2)32,33,43,50. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 2-4 timer, avhengig av lengden på RNA. Deretter legger du DNase I til reaksjonen og inkuberer ved 37 °C i 30 minutter for å fordøye DNA-malen. Rens RNA ved hjelp av silikaspinsøyler.
  6. Under merkingsreaksjonen på 5'-håndtaket (tabell 3) tilsett biotin-16-dUTP ved 3' enden av håndtaket med T4 DNA-polymerase38,50. Utfør reaksjonen ved romtemperatur i 1-2 timer. Deretter renser du DNA-et ved hjelp av silikaspinkolonner.
    MERK: Siden håndtaket på 5' må merkes i enden av 3' (figur 2B), kan ikke merkingen utføres under PCR.
  7. Bland komponentene nevnt ovenfor - 5' håndtak (3' merket med biotin), 3' håndtak (5' merket med digoxigenin) og RNA - i et 1:1:1 molar forhold i glødebuffer (80% formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), for å oppnå ønsket RNA/DNA-hybrid (tabell 4). Varm opp glødeblandingen opp til 85 °C i 10 minutter og avkjøl deretter sakte ned til 4 °C.
  8. Bland den glødede prøven med 1/10 volum 3 M natriumacetat (pH 5), 3 volumer iskald etanol og inkuber ved -80 °C i minst 1 t eller ved -20 °C over natten.
  9. Sentrifuger prøvene ved 15 000 × g i 30 min ved 4 °C. Kast supernatanten og tørk pelletsen (vanligvis ikke synlig) under vakuum.
  10. Til slutt, resuspend, pellet i 50 μL RNase-fritt vann og lage aliquots. Oppbevar aliquots ved -80 °C til de brukes. For korttidslagring kan prøvene også lagres ved -20 °C.

2. Instrumentoppsett

MERK: Følgende protokoll er optimalisert for det kommersielle optiske pinsettinstrumentet C-Trap fra LUMICKS-selskapet. Derfor kan justeringer av de presenterte trinnene være nødvendige når du bruker andre optiske pinsettinstrumenter. Hvis det ikke brukes, holdes maskinens mikrofluidikksystem i blekemiddel (natriumhypoklorittoppløsning) og må vaskes før bruk.

  1. Kast blekemiddelet og fyll sprøytene med 1 ml RNase-fritt vann.
  2. Tilsett 50 μL 0,5 M natriumtiosulfat til minst 1 ml RNasefritt vann og vask systemet grundig (1 bar, minst 0,5 ml) for å eliminere gjenværende blekemiddel i systemet.
  3. Kast natriumtiosulfatoppløsningen fra sprøytene. Skift ut sprøyter med friske og vask systemet med minst 0,5 ml RNase-fritt vann.
    MERK: Vær forsiktig, at mikrofluidikksystemet aldri går tørt for å unngå luftbobler i systemet.
  4. Sett 2 dråper nedsenkningsolje (brytningsindeks på 1,33) eller ca. 70 μL vann på toppen av målet.
  5. Plasser strømningscellen inne i oppbevaringsrammen i posisjonen.
  6. Sett 2 dråper nedsenkningsolje (brytningsindeks på 1,51) på toppen av strømningscellen.
  7. Slå på laserenheten i pinsettmaskinen. Når den er i gang, slår du på overlappingslaseren i programvaregrensesnittet på 100%.
  8. Bruk diagnostiske kameraer (Z-finder), juster Z-aksen til midten av kammeret mellom den andre og den tredje refleksjonen (grensesnitt) der brytningsringene er de største, ved å dreie mikroskruen.
    MERK: Hver gang målet flyttes nærmere målekammeret og fokusplanet til målet krysser grensesnittet mellom to faser, kan en refleksjon gjenkjennes i Z-finder-modus. Det er 4 mulige grensesnitt: (i) vann/nedsenkningsolje og bunnglass (ii) bunnglass og buffer inne i kammerbufferen (iii) inne i kammeret og toppglasset (iv) toppglass og nedsenkningsolje for kondensator.
  9. Juster kondensatorposisjonen (sett overlappingslaseren til ca. 50 %) slik at kondensatoren berører nedsenkningsoljen på toppen av målekammeret.
  10. Juster fokuset ved å bevege deg sakte ned/opp med kondensatoren, slik at ca. 10 lysbånd vises i månemodus (diagnostiske kameraer).

3. Prøvemåling

  1. Inkuber anti-digoksigeninbelagte perler (AD) med prøvekonstruksjonene (3 μL 0,1 % (w/v) AD-perlefjæring + 4 μL prøve) og med 1 μL RNase-hemmere og 8 μL av analysebufferen (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) ved RT i 10-20 min. Etter inkubasjonen fortynner du prøven i 500 μL analysebuffer.
    MERK: Det anbefales å tilsette oksygenfangere, spesielt under fluorescensmålinger til bufferen for å forhindre oksidativ skade. Her ble oksygenfangersystem som inneholder glukose (8,3 mg/ml), glukoseoksidase (40 U/ml) og katasase (185 U/ml) brukt.
  2. Bland 0,8 μL 1% (w/v) streptavidinbelagte (SA) perler med 1 ml analysebuffer.
  3. Kast vann fra sprøytene og fyll sprøytene med respektive suspensjoner/løsninger. Vask i minst 2 min på ca 1 bar, og begynn deretter å fange perler.
    MERK: Avhengig av det eksperimentelle oppsettet kan ulike kanalarrangementer brukes (figur 3). Vanligvis er en strømningskanal fylt med anti-digoksigeninperler som bærer RNA-molekylet. En annen kanal er fylt med streptavidin-belagte perler. Bufferkanalen brukes til å danne tjoringene. En fjerde kanal kan brukes til å laste inn RNA-bindingsproteinet (figur 3C), eller alternativt kan RBP tilsetts direkte i bufferkanalen (figur 3B).
  4. For å fange perlene, flytt de optiske fellene bortsett fra hverandre. Flytt først til AD-kanalen og ta en AD-perle i felle 1. Deretter flytter du scenen til SA-kanalen og fanger en enkelt SA-perle ved felle 2.
    MERK: Prøv å holde deg ved grensesnittet til buffer- og perlekanalene for å unngå å miste den allerede fangede perlen, eller for å forhindre å fange flere perler med samme felle.
  5. Når perlene av riktig størrelse er fanget, flytt til bufferkanalen og stopp laminærstrømmen. Deretter utfører du kraftkalibrering for å kontrollere fellestivheten. De respektive stivhetsverdiene bør ikke variere i x/y-aksen med mer enn 10-15%.
    MERK: Juster lasereffekten eller laserdelingen mellom fellene i henhold til perlestørrelse. Kraftkalibrering trenger ikke å gjøres for hvert perlepar så lenge perlemalene samsvarer (likhetspoeng > 0,9). Det bør imidlertid utføres regelmessig, eller i det minste hver gang analyseforholdene endres.
  6. Begynn å fiske etter en tether ved å flytte perlene nær hverandre, vente i noen sekunder, og flytt dem deretter tilbake fra hverandre, gjenta til en tether er dannet. En tetherformasjon resulterer i en økning av målt kraft ved å trekke de to perlene bort fra hverandre.
    MERK: For å unngå dannelse av flere tethers, bør perlene ikke flyttes for nært. Ved å fange en tether mellom de to perlene, kan tether kvalitet kontrolleres ved å finne overstretching platået. Platået skal være mellom 50 og 60 pN for en enkelt tether.
  7. Når du får en tether, start målingen. Avhengig av fenomenet som studeres, bør forskjellige måleoppsett velges (figur 1B-D).
    MERK: Vanligvis i begynnelsen av eksperimentet utføres et kraftrampeeksperiment for å sjekke tetherkvaliteten og undersøke oppførselen. Etterpå kan man også starte de konstante eller konstante stillingseksperimentene for å studere tilstandsovergangene ytterligere. Når det er utført tilstrekkelig antall målinger på en RNA-prøve for å fastslå virkemåten, kan merkede faktorer legges til systemet for å utføre konfiskeringer.
  8. For å utføre fluorescensmålinger, slå på de konfektlasere og fotontellerenheten i det optiske pinsettinstrumentet.
  9. Slå på eksitasjonslaseren for ønsket bølgelengde i programvaregrensesnittet og sett laserens kraft til 5% eller høyere, avhengig av fluoroforen.
    MERK: Mens du ikke måler, senk strøminnstillingen til eksitasjonslaseren til 0 % for å unngå overdreven fotodamage til prøven.
  10. Begynn å forestille deg eksemplet ved hjelp av bildefunksjoner i programvaren.
    MERK: For å få velfokuserte bilder må fokusplanet til det konfokale mikroskopet og optiske feller justeres. Til dette formål kan autofluorescence av polystyrenperler i den blå laserkanalen brukes. Fokusplanet av optiske feller flyttes opp eller ned i z-aksen til bildet av perler når sin høyeste diameter. I denne posisjonen kan fluorescenssignalet fra molekylet som er bundet mellom perlene måles.
  11. For å bruke kymograffunksjonen, spesifiser x-y-posisjonen til kymografaksen slik at den tillater deteksjon av tetheren mellom perlene.
  12. Gjennom hele målingen kan buffersammensetningen enkelt endres ved enten å flytte perlene til forskjellige kanaler eller ved å endre bufferen som leveres i mikrofluidikksystemet.

4. Dataanalyse

  1. Forhåndsbehandling av rådata
    1. Ved å bruke et enkelt skript reduserer du oppløsningen for rådataene nok til å (i) tillate raskere etterfølgende databehandling, men (ii) inneholder fortsatt all viktig informasjon (figur 4A). Vanligvis er 100-5000 Hz egnet for dette formålet.
      MERK: Datainnsamlingsfrekvensen i optiske pinsetteksperimenter er ofte høyere enn det er nødvendig for analysen - i de presenterte eksperimentene er datainnsamlingsfrekvensen satt til 78 125 Hz som standard. Siden lagringsplassen er begrenset, er det praktisk og tidsbesparende å redusere samplingsfrekvensen for dataene. Her ble rådataene nedsamplet med en faktor på 30.
    2. Deretter bruker du et signalfilter for å redusere høyfrekvent målestøy fra signalet (figur 4A). Juster filtergraden og avskjæringsfrekvensparametrene tilsvarende for å optimalisere datautgangen for forskjellige eksperimenter (figur 5).
      MERK: Blant signalfiltre er Butterworth filter51 en av de mest brukte. Et spesialskrevet pythonskript som tillater forhåndsbehandling av rådata, finnes i tilleggsdataene. Reduksjons- og signalfiltreringsparametere (cut-off frekvens, filtergrad) må optimaliseres for forskjellige eksperimenter.
  2. Bruk følgende fremgangsmåte for analyse av kraftramper.
    1. Merk trinnene enten manuelt ved å finne tilsvarende punkter på kraftbanen eller ved å bruke egendefinerte skript. Utfoldende trinn er preget av et plutselig fall i kraft kombinert med en økning i avstand i kraftavstandskurven (FD).
    2. Når utfoldelseshendelser er merket, passer forskjellige områder i FD-kurven ved hjelp av passende modeller (figur 4D).
      MERK: For regionen før det første utfoldende trinnet kan tether betraktes som "dobbeltstrenget" og passer vanligvis ved hjelp av en utvidbar ormlignende kjedemodell (WLC)47,52,53. Delene etter den første utfoldende hendelsen betraktes som en kombinasjon av dobbeltstrengede nukleotider (håndtak) og enkeltstrengede nukleotider (utfoldet RNA-molekyl). Derfor er datatilpasning mer kompleks - vanligvis brukes en kombinasjon av 2 WLC-modeller eller WLC- og Freely-jointed chain (FJC) -modeller36,39,52. Den utvidbare WLC-modellen har to hovedtilpasningsparametere konturlengden (LC) og utholdenhetslengden (LP). Konturlengden tilsvarer lengden på det fullt strakte molekylet, og utholdenhetslengden definerer bøyeegenskapene til molekylet av interesse. Modellen kan beskrives med følgende ligning (1). WLC kan brukes til å modellere oppførselen til både brettede så vel som utfoldede regioner, men for hver av disse må en egen modell med forskjellige parametere brukes.
      (1) Equation 1
      hvor x er forlengelse, LC er konturlengde, F er kraft, LP er utholdenhetslengde, kB er Boltzmann konstant, T er termodynamisk temperatur, og S er strekkmodulus.
      Den andre modellen kalt Freely-jointed chain (FJC) brukes ofte til å beskrive oppførselen til utfoldede enkeltstrengede regioner. Den bruker lignende parametere av polymerene, men behandler hver enhet av "kjeden" som en stiv stang, her som tilsvarer nukleotidene til den utfoldede enkeltstrengede regionen. Følgende formel (2) beskriver denne modellen:
      (2) Equation 2
      MERK: Laboratoriet vårt har nylig utviklet en algoritme som tillater batchbehandling av rå kraft-rampedata kalt "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54." Algoritmen reduserer oppløsningen og filtrerer dataene, så identifiserer den mulige utfoldelsestrinn og utfører til slutt datatilpasning. POTATO er bygget i et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Behandle konstante kraftdata på følgende måte:
    MERK: Følgende instruksjoner kan brukes analogt på konstantposisjonsdata.
    1. For data med konstant kraft tegner du inn avstanden over tid (figur 5). Et histogram som viser frekvensen (antall) av forskjellige konformasjoner over den relative posisjonsendringen, er en nyttig måte å karakterisere ulike dominerende og mindre tilstander på (figur 7).
    2. Tilpass histogrammet ved hjelp av (flere) gaussiske funksjoner for å estimere den totale prosentandelen av individuelle konforme ved en gitt kraft (figur 7C). Gaussian passer, gjennomsnittlig posisjon, og standardavviket skisserer det kraftrelaterte forholdet mellom ulike populasjoner.
      MERK: Et spesialskrevet pythonskript som tillater forhåndsbehandling og grunnleggende bimodal gaussisk tilpasning av konstante kraftdata, finnes i tilleggsdataene. Parametere (cut-off frekvens, filter grad, forventede midler, standard avviksverdier og amplituder) må optimaliseres for ulike eksperimenter.
    3. Deretter bruker du Hidden Markov-modellen for å analysere tilstandene ytterligere, noe som kan avdekke ytterligere sammenleggbare mellomprodukter (konforme)55. For ytterligere informasjon om konstant kraft og Skjult Markov-modellen, kan man referere til55,56,57,58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne delen fokuseres det hovedsakelig på målinger av RNA-protein/ligand interaksjoner av fluorescens optisk pinsett. For en beskrivelse av generelle RNA optisk pinsett eksperimenter og tilsvarende representative resultater, se32. For mer detaljert diskusjon av RNA/DNA-proteininteraksjonene, se også1,2,26,59,60.

I prinsippet stabiliserer binding av en RBP eller annen transvirkende interessefaktor på RNA, destabiliserer eller kan endre molekylets konformasjon. Nedenfor vises en skildring av de mekaniske observerbare for hver effekt. Den faktiske effekten som observeres for et gitt RNA-proteinkompleks er imidlertid ikke begrenset til disse scenariene nedenfor.

Stabilisering
RNA-strukturen kan gjenkjennes og bindes spesielt av proteinet eller andre ligander45,61,62,63,64. Dannelsen av bindingene er ledsaget av en frigjøring av energi. Derfor må en ekstra energisk barriere overvinnes for å utfolde den gitte RNA-strukturen. Som et resultat kan en økning i den gjennomsnittlige utfoldende kraften observeres50,65. Stabiliseringen av RNA-strukturen ved binding av et eksternt middel (protein, lite molekyl, andre transvirkende faktorer) kan også resultere i en endring av strukturens foldede kinetikk. For det kan ytterligere målinger utføres i konstant kraftmodus, hvor mindre hyppige overganger mellom folding mellomprodukter samt kraftskift i likevekten kan observeres.

Destabilisering
Noen proteiner gjenkjenner visse sekvensmotiver i stedet for spesifikke RNA-strukturer. Bindingsstedene kan variere fra et svært spesifikt motiv til et mer generelt mønster som GC eller AU rich stretch60,66. Likevel, hvis proteinet fortrinnsvis binder seg til den utfoldede enkeltstrengede RNA-konformasjonen, kan likevekten mellom foldet og utfoldet tilstand skiftes mot den utfoldede tilstanden36,43,67. I figur 6 og figur 7 er eksempler på slik oppførsel avbildet.

Strukturendring
I noen tilfeller kan RBPer (eller andre ligander) kombinere begge mekanismene nevnt ovenfor på en slik måte at RBP destabiliserer den tidligere dominerende konformasjonen og skifter likevekten mot en alternativ RNA-struktur44,68,69. Overgangen til en alternativ tilstand kan føre til en endring i observerte konformasjonspopulasjonsfrekvenser samt forekomst eller forsvinning av individuelle foldetilstander. Disse endringene kan først observeres i kraft-rampe eksperimenter og kan undersøkes nærmere av konstant-force (eller konstant posisjon) eksperimenter.

Effekt av transvirkende faktor på RNA folding /utfoldelse
Her ble en RNA-sekvens som tilsvarer det -1 programmerte ribosomale frameshifting-elementet i SARS-CoV-2 studert. Dette RNA-elementet er spådd å danne en H-type pseudoknot70,71. I eksemplet på kraftavstandsbaner utfolder og bretter RNA seg sammen i to påfølgende trinn (figur 6A). Disse to trinnene tilsvarer sannsynligvis de to stammeløkkene som er forutsetningen for pseudoknotformasjonen. I dette tilfellet ble pseudoknot ikke observert enten fordi RNA ikke brettet helt eller dannet en alternativ struktur som konkurrerer med pseudoknot. Ved tillegg av den transvirkende faktoren ZAP ble det observert en plutselig forsvinning av omfoldingshendelsene og en stor hysterese (figur 6B)43. Dette antyder at proteinet binder seg til RNA-ens enstrengede tilstand, noe som hindrer dannelsen av sekundære strukturer. Videre bekrefter konstante krafteksperimenter resultatene av kraft-rampeeksperimenter. Følgelig, mens RNA er fullt brettet på rundt 10 pN (figur 7A), skifter tilstedeværelsen av proteinet foldingen mot lavere krefter, og ved 10 pN opptar RNA fortsatt for det meste utfoldet tilstand (figur 7B).

OT-målinger kombinert med konfektmikroskopi
Deretter vises eksemplariske resultater for ikke-spesifikke så vel som spesifikk binding av forskjellige fluoroforer og merkede ribosomer (figur 8). I det første eksemplet ble SYTOX Green fargestoff brukt til å merke den tethered DNA / RNA hybrid. Med økende kraft er fargebindingen mer rikelig, noe som resulterer i høyere fluorescenssignal. Når kraften er for høy, brytes tetheren, og fluorescenssignalet går tapt (figur 8A). For forsøkene med bakterielle ribosomer (figur 8B) ble det brukt ikke-spesifikk merking av lysinrester ved hjelp av N-hydroksysuccinimid (NHS) konjugert til et rødt fluorescerende fargestoff. Selv om det er fare for å redusere aktiviteten til merket protein / kompleks, oppnås den store fordelen sterkere signal når hvert ribosom (i gjennomsnitt) er merket av flere fluoroforer. RNA-konstruksjonen inneholdt et ribosombindingssted (RBS) anerkjent av bakterielle ribosomer, som ble plassert i 5'nærhet av den studerte RNA-sekvensen. Ved binding av ribosomene observeres fluorescenssignalet på tetheren. Fluorescensdata kan analyseres videre ved hjelp av bildeanalyseverktøy72, og resultatene kan kombineres med kraftdataene, slik at studiet av sammenleggbare overganger.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for OT-eksperimentet og mulige målemetoder. (A) Skjematisk som illustrerer de optiske pinsetteksperimentene med SARS-CoV-2 frameshifting RNA i midten. RNA er hybridisert til ssDNA håndtak og immobilisert på perler. Disse brukes til å utøve trekkraft på RNA med en fokusert laserstråle. Kraften økes gradvis til RNA utfoldes (bunnen). (B) Skjematisk for konfektmikroskopi kombinert med optisk pinsett for å overvåke binding av merket faktor til RNA. (C) Eksempel på konstante kraftdata kan oppnås ved å fikse kraften til en konstant verdi over tid, noe som gjør det mulig å nøyaktig måle botid for konformiører. (D) Eksempel på kraftavstandskurve (FD) hentet fra en kraft-rampemåling. Det utfoldende trinnet observeres som et plutselig brudd i FD-profilen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En generell ordning for OT-prøvesyntese. (A) Eksempelsekvens og predikert sekundærstruktur av den studerte SARS-CoV-2 frameshifting RNA ansatt i studien. (B) En vektor som inneholder sekvensen av interesse (SoI) flankert av to håndtaksregioner fungerer som mal for generering av DNA / RNA-konstruksjonen i 3 PCR-reaksjoner. Primere er avbildet og nummerert i ordningen i henhold til deres bindende nettsteder i tilsvarende PCR. PCR 1 gir in vitro transkripsjon malen, som senere brukes til in vitro transkripsjon (IVT) reaksjon for å generere den lange RNA molekyl (lyseblå). PCR 2 gir 5'håndtaket, som senere er 3' merket med biotin. PCR 3 ved hjelp av den fremre primeren som er konjugert til digoxigenin, produserer det 3' digoksigeninmerkede håndtaket. Til slutt er de to håndtakene og RNA glødet for å gi en DNA / RNA hybridkonstruksjon egnet for optisk pinsettmålinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Illustrasjon av ulike mikrofluidics kanaloppsett. (A) En ordning av strømningscellen med 5-mikrofluidikkkanaler. (B) og (C) er zoom-ins av det rød-stiplede området i (A). (B) Et enkelt 3-kanals oppsett med AD-perler og SA-perler i henholdsvis kanal 1 og 3. Faktoren finnes i kanal 2. Dette oppsettet er egnet for stabile proteiner med høy affinitet, og dermed er lav konsentrasjon foretrukket for å sikre lav fluorescerende bakgrunn. Perlekanalene på siden tillater fast tether orientering og rask rekruttering av nye perler om nødvendig. (C) 4-kanals oppsett med faktor i kanal 4. En slik ordning er spesielt fordelaktig for minimalt prøveforbruk. Målingen kan utføres direkte i kanal 4. Alternativt, for å unngå bakgrunnsfluorescenssignal, kan komplekset dannes i kanal 4, og deretter kan målingen utføres i kanal 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt for dataanalyse for tvangsramperforsøk. (A) Flytskjema for arbeidsflyten for dataanalyse. Rådatafilene blir først senket og filtrert, deretter er trinnene merket og de enkelte tilstandene er montert på den tilsvarende modellen. (B) Rådataene inneholder betydelig støy, noe som hindrer identifisering av utfoldelses-/brettingshendelser. I de fleste forsøkene er også hyppigheten av datainnsamling høyere enn nødvendig. (C) Derfor brukes samplingsreduksjon og signalfiltrering for å jevne ut dataprofilen. (D) De bearbeidede kurvene monteres til slutt ved hjelp av WLC-modellen når molekylet fortsatt er i foldet tilstand (før utfoldelseshendelsen), en kombinasjon av WLC med FJC-modeller eller en annen WLC-modell når molekylet er i utfoldet tilstand (etter utfoldelseshendelsen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekten av avskjæringsfrekvens på datautgangen. Selv om rådatautgangen kan være belastet med signalstøy (øverst), er det avgjørende å velge riktige signalfiltreringsparametere for dataanalyse. Selv om riktig filtrering vil hjelpe i identifisering av sammenleggbare mellomprodukter (cut-off frekvens 0,1, midten), over filtrering (cut-off frekvens <0.001, bunn) kan føre til tap av oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på FD-baner i fravær og tilstedeværelse av ZAP. (A) Utfoldelse (rosa) og bretting (blå) spor av SARS-CoV-2 RNA i fravær av ZAP. Utvalget viser lett bretting med bare liten hysterese. (B) Utfoldelse (rosa) og bretting (blå) spor av RNA i nærvær av transfaktor ZAP (400 nM). Prøven viser stor hysterese, noe som tyder på at proteinet binder seg til den enstrengede RNA og forhindrer omfolding. (C) Et liggende stolpediagram som viser antall trinn for utfoldelse (rosa) og bretting (blå) i fravær eller tilstedeværelse av ZAP. Mens distribusjonen av utfoldende trinn forblir nesten upåvirket av tilstedeværelsen av ZAP, er det en klar nedgang i antall brettingstrinn med ZAP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Eksempel på konstante kraftdata i fravær og tilstedeværelse av ZAP. (A) Konstante kraftdata innhentet ved krefter mellom 10 (opp) til 13 (nederst) pN som viser skiftet fra fullt brettet tilstand til fullstendig utfoldet tilstand av SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet. Hvert diagram inneholder posisjonen i forhold til tid (til venstre) og et histogramtegning (til høyre). (B) Konstante kraftdata innhentet i nærvær av ZAP (400 nM). Ved proteinbinding er brettingen svekket. Ved 10 pN, i motsetning til RNA alene, eksisterer i nærvær av ZAP RNA for det meste i utfoldet tilstand. Derfor er et skifte i likevektskraften mot lavere krefter indikert. (C) Histogrammet for posisjonsdata kan analyseres ved å tilpasse dataene til gaussiske funksjoner for å gi den relative overfloden av hver stat (avledet fra området under kurven for hver tilstand). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: OT kombinert med konfektmikroskopi. (A) Et eksempel på kymografi av SYTOX Green merket tether (venstre). Legg merke til økningen i signalintensiteten ved økende krefter. Den svarte pilen markerer tether breakage-hendelsen, noe som fører til tap av signal. Skildring av tether med fargestoff bundet til den (Binding) og etter brudd uten fargestoff (Ingen signal) (høyre). (B) Eksempel kymografi av spesifikk binding av ribosomet på mRNA (venstre). Bindingshendelsen kan observeres som et fluorescenssignal på den tethered RNA mellom de to perlene. Skildring av tether uten (ingen signal) og med fluorescens-merkede ribosomer bundet (Binding) (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Volum
Reaksjonsvolum - - 500 μL
10× buffer 10× 1× 50 μL
dNTP-blanding 10 mM 0,2 mM 10 μL
Dna-polymerase med høy kvalitet 1,25 U/μL 0,025 U/μL 10 μL
Primer 1 10 μM 0,4 μM 20 μL
Primer 2 10 μM 0,4 μM 20 μL
Mal 100 ng/μL 1 ng/μL 5 μL
Vann - - 385 μL

Tabell 1: Pipetteringsordning for PCR for å generere de optiske pinsettkonstruksjonene.

Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Volum
Reaksjonsvolum - - 300 μL
5× buffer 5× 1× 60 μL
rNTP-blanding 25 mM 5 mM 60 μL
RNase-hemmer 40 U/μL 0,7 U/μL 5 μL
Pyrofosfatase 100 U/ml 1,7 mU/μL 4 μL
DTT 100 mM 3,3 mM 10 μL
T7 RNA polymerase 50 U/μL 3.3 U/μL 20 μL
Mal 120 ng/μL 2 ng/μL 5 μL
Vann - - 136 μL

Tabell 2: Pipetteringsordning for in vitro transkripsjon.

Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Volum
Reaksjonsvolum - - 100 μL
10× buffer (NEB 2.1) 10× 1× 10 μL
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μL
Biotin-16-dUTP 1 mM 50 μM 5 μL
T4 DNA-polymerase 30 U/μL 1,5 U/μL 5 μL
DNA 5' håndtak (20-60 μg) 300 ng/μL 237 ng/μL 79 μL

Tabell 3: Pipetteringsordning for 3' sluttbiotinmerking.

Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Endelig beløp Volum
Reaksjonsvolum - - - 300 μL
Annealing-buffer 1.25× 1× - 240 μL
RNase-hemmere 40 U/μL 0,5 U/μL - 5 μL
5' biotinylert DNA-håndtak 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
3' DNA-håndtak 300 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 10 μL
RNA 150 ng/μL 10 ng/μL 3 μg 20 μL
Vann - - - 5 μL

Tabell 4: Pipetteringsordning for annealing av den optiske pinsettkonstruksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi bruken av fluorescens-koblede optiske pinsett for å studere interaksjoner og dynamisk oppførsel av RNA-molekyler med ulike ligander. Nedenfor diskuteres kritiske trinn og begrensninger i den nåværende teknikken.

Kritiske trinn i protokollen
Når det gjelder mange andre metoder, er kvaliteten på prøven avgjørende for å oppnå pålitelige data. Derfor, for å oppnå høyest mulig kvalitetsprøver, er det verdt det å bruke tid på å optimalisere prosedyren for prøvepreparering. Optimaliseringstrinnene inkluderer riktig primerdesign, glødende temperaturer, RNA og proteinrensingstrinn.

Gjennom eksperimentet er bruk av filtrerte tips og løsninger avgjørende for å opprettholde RNase-frie forhold. I tillegg holdes mikrofluidikksystemet i blekemiddel når det ikke er i bruk. Før du starter målinger, er det viktig å vaske systemet riktig med natriumtiosulfat og RNasefritt vann for å fjerne blekemiddelet fra systemet.

I tilfelle de samme perlene brukes gjennom hele eksperimentet, er det ikke nødvendig å utføre kraftkalibrering hver gang. Likevel bør kraftkalibreringskontroller gjøres regelmessig for reproduserbarhet av eksperimenter.

Endringer og feilsøking av metoden
Fluoroforstabilitet og fotobleking
En komplikasjon under fluorescensmålinger er fotobleaching. Siden tidsrammen for å overvåke oversettelse kan utvides fra sekunder til minutter, avhengig av systemet, bør fotobleaching under målingene også vurderes og minimeres så mye som mulig73. Et alternativ er å bruke mer stabile fluoroforer, som er mindre utsatt for fotobleaching, for eksempel nylig introduserte kvanteprikkene49,74,75. Ytterligere stabilitet oppnås også ved å fjerne oksygenmolekyler ved hjelp av et "oksygenfanger" -system, for eksempel glukoseoksidase kombinert med katasase. Glukoseoksidase fjerner oksygen fra miljøet ved å gjøre det til hydrogenperoksid, som deretter brytes ned av katasase. Alternative oksygenoppfinnende systemer kan også benyttes76,77.

Mikrofluidikk
Opprettholdelse av en kontinuerlig laminær strømning er avgjørende for riktige målinger. Det viktigste er at systemet aldri skal gå tørt. Dessverre er RBPer eller andre transvirkende interessefaktorer ofte bare tilgjengelige i små volumer for forsøkene, derfor kan det være utfordrende og kostnadskrevende å opprettholde kontinuerlig flyt. Hvis luftbobler innføres i systemet under prøveapplikasjonen, er manuell trykk- eller etanolvask vanligvis tilstrekkelig for fjerning.

Begrensninger ved metoden
Kombinasjon av OT med konfektmikroskopi gir også noen begrensninger. For det første må fokusplanet til konfokalenheten justeres riktig med fellesentre for å tillate riktig registrering av fluorescenssignal. Videre, for konfektmålinger, er det vanligvis nødvendig med håndtak på minst 2 kb på hvert sted17. Selv om det i prinsippet er mulig å bruke lengre håndtak, bør man vurdere energibidraget til håndtakene og endringen i utholdenhetslengden for nøyaktigheten av dataanalyse78. Et annet viktig poeng er oksygenfangerne, som brukes til å øke halveringstiden til fluoroforene, fører også til relativt raske endringer i pH av løsningene76. Disse endringene kan delvis kompenseres ved å øke konsentrasjonen av bufferforbindelsen; Under målingene bør imidlertid prøvene etterfylles regelmessig (hver 30-60 min) for å sikre konsistente forhold gjennom eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Anuja Kibe og jun. prof. Redmond Smyth for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker Tatyana Koch for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Kristyna Pekarkova for hjelpen med å spille inn eksperimentelle videoer. Arbeidet i vårt laboratorium støttes av Helmholtz-foreningen og midler fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) Grant Nr. 948636 (til NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Biokjemi utgave 180
Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter