Test in vitro à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient

Les lignées cellulaires cancéreuses humaines sont largement acceptées pour étudier la biologie du cancer et évaluer les agents anticancéreux. Cependant, ces lignées cellulaires ne préservent pas nécessairement les caractéristiques originales de leur tissu source, car leur morphologie, leur mutation génique et leur profil d’expression génique peuvent changer au cours de la culture sur de longues périodes. De plus, la plupart de ces lignées cellulaires sont cultivées en monocouche ou utilisées comme xénogreffes murines, dont aucune ne représente physiquement le tissu tumoral^1,2. Ainsi, l’efficacité clinique des agents anticancéreux peut ne pas être la même que celle observée dans les lignées cellulaires cancéreuses. Par conséquent, des systèmes in vitro, tels que des essais ex vivo utilisant des xénogreffes tumorales dérivées du patient ou des organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDO) et des modèles de sphéroïdes tumoraux qui reproduisent avec précision la structure et la fonction des tissus tumoraux, ont été développés. De plus en plus de preuves suggèrent que ces modèles prédisent la réponse des patients aux agents anticancéreux en étant directement comparables au tissu cancéreux correspondant. Ces systèmes in vitro ont été établis pour différents types de tissus tumoraux, et des systèmes de dosage à haut débit (HTS) associés pour le dépistage de médicaments ont également été développés^3,4,5,6,7. Les cultures organoïdes ex vivo hétérogènes de tumeurs primaires obtenues à partir de patients ou de xénogreffes tumorales dérivées de patients ont gagné en popularité ces dernières années en raison de leur facilité de culture et de leur capacité à maintenir la complexité des cellules dans le tissu stromal^8,9,10. Ces modèles devraient améliorer la compréhension de la biologie du cancer et faciliter l’évaluation de l’efficacité des médicaments in vitro.

Une série de nouveaux PDO ont récemment été créés à partir de différents types de tissus tumoraux, désignés comme F-PDO, dans le cadre du projet de recherche translationnelle de Fukushima. Les PDO forment de grands amas cellulaires avec une morphologie similaire à celle de la tumeur source et peuvent être cultivés pendant plus de six mois^11. L’histologie comparative et les analyses complètes de l’expression génique ont montré que les caractéristiques des PDO sont proches de celles de leurs tissus tumoraux sources, même après une croissance prolongée dans des conditions de culture. En outre, un HTS approprié a été établi pour chaque type d’AOP dans des plaques de 96 puits et 384 puits. Ces tests ont été utilisés pour évaluer plusieurs agents moléculaires ciblés et anticorps. Ici, les agents chimiothérapeutiques standard (paclitaxel et carboplatine) utilisés pour le cancer de l’endomètre ont été évalués à l’aide de F-AOP provenant d’un patient qui n’a pas répondu au paclitaxel et au carboplatine. En conséquence, l’activité inhibitrice de croissance cellulaire du paclitaxel et du carboplatine contre cette AOP était faible (CI₅₀: >10 μM). En outre, des recherches antérieures ont rapporté que la sensibilité de certains F-PDO aux agents chimiothérapeutiques et aux agents moléculaires ciblés est cohérente avec l’efficacité clinique^11,12,13. Enfin, les changements dans la structure d’ordre supérieur des PDO causés par des agents anticancéreux ont été analysés à l’aide d’un système d’analyse cellulaire tridimensionnelle^12,13. Les résultats de l’évaluation des agents anticancéreux à l’aide d’un HTS à base d’AOP sont comparables aux résultats cliniques obtenus pour ces agents. Ici, un protocole est présenté pour un HTS plus simple et plus précis qui peut être utilisé pour évaluer la puissance des agents anticancéreux et de l’immunothérapie à l’aide des modèles AOP.

Toutes les expériences impliquant des matériaux d’origine humaine ont été réalisées en vertu de la Déclaration d’Helsinki et approuvées à l’avance par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Fukushima (numéros d’approbation 1953 et 2192; dates d’approbation 18 mars 2020 et 26 mai 2016, respectivement). Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients qui ont fourni les échantillons cliniques utilisés dans cette étude.

1. Culture des PDO

REMARQUE : Les F-AOP forment des amas cellulaires qui présentent une variété de morphologies hétérogènes et se développent en culture en suspension (Figure 1). De plus, les F-PDO peuvent être cultivés pendant plus de 6 mois et peuvent être cryoconservés pour une utilisation future.

1. Décongélation des AOP stockées (jour 0)
   1. Décongeler et semer les AOP (p. ex. RLUN007, adénocarcinome pulmonaire) au jour 0(figure 1). Tout d’abord, ajoutez 15 mL de milieu pour les PDO (voir tableau des matériaux)contenant 1 % de supplément de B-27 et 30 ng/mL de facteur de croissance épidermique à un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL.
   2. Après avoir retiré le flacon congelé du stockage d’azote liquide, agiter doucement les PDO dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min. Ensuite, retirez le flacon du bain-marie, essuyez le flacon avec 70% d’éthanol, puis déplacez le flacon dans une armoire de sécurité biologique.
   3. Transférer le contenu du flacon dans le tube contenant 15 mL de milieu pour les AOP. Mélanger les PDO et le milieu en pipetant doucement de haut en bas cinq fois avec une pipette de transfert de 3 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 3 min à ~25 °C et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille AOP dans 5 mL de milieu frais et transférer dans une fiole de 25 cm² (voir tableau des matières)avec pipetage doux. Enfin, cultiver les AOP dans un incubateur à 37 °C dans 5% de_CO2.
2. Changez le médium deux fois par semaine (jours 3-7). Centrifuger la suspension d’AOP pour précipiter les grappes de cellules et remplacer 4 mL du milieu (80 % du volume). Remettre en suspension les cellules dans le milieu frais.
   REMARQUE: La majorité des RLUN007 apparaissent sous forme de grappes de cellules de 100 à 500 μm de diamètre. Lorsque la couleur du rouge phénol dans le milieu passe au jaune comme le montre la figure 1A, remplacez le milieu plus fréquemment. Si le milieu jaunit le lendemain du remplacement et que chaque amas de cellules fusionne pour former des amas plus grands de >500 μm de diamètre, passage à un rapport de division de 1:2.
3. Sous-culture (jours 8-28) des PDO
   NOTE: Compte tenu de la difficulté de mesurer réellement le nombre de cellules individuelles, le moment du passage est déterminé en fonction d’une densité de grappes cellulaires appropriée et de la taille de la pastille aopée après centrifugation (Figure 1B). Dans le cas de RLUN007, le volume de la pastille AOP atteint 30 μL (densité saturée en flacons^{de 25 cm 2)} environ 2 semaines après la décongélation.
   1. Pour le transfert d’une fiole de²⁵ cm 2 à deux fioles^{de 25} cm 2 (P1), transférer la suspension AOP dans un tube centrifuge et centrifuger à 200 x g pendant 2 min à environ 25 °C. Estimer le volume de la pastille d’AOP et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille aOP à l’aide d’une pipette de 5 mL dans 5 mL de milieu frais. Pipettez doucement de haut en bas cinq fois à basse vitesse. Ensuite, transférer la moitié du volume de la suspension AOP (2,5 mL) dans deux flacons et ajouter 2,5 mL de milieu frais à chaque fiole. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO_2.
   2. Pour le transfert de deux flacons de 25 cm² à un ballon de 75 cm² (P2), transférer la suspension aOP de deux flacons dans deux tubes centrifuges et centrifuger l’AOP à 200 x g pendant 2 min à environ 25 °C. Ensuite, estimer le volume de la pastille aOP et remettre la pastille en suspension dans 2,5 mL de milieu frais (par tube). Par la suite, mélanger la suspension aOP dans un tube avec celle dans l’autre et la transférer dans une fiole de 75 cm² contenant 10 mL de milieu frais. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO_2. Transférer les AOP sous-cultivés de deux flacons^{de 25} cm 2 à un flacon de 75 cm² environ 1 semaine après le premier passage(Figure 1C).

2. Inhibition de la croissance HTS

REMARQUE: L’activité inhibitrice de croissance des agents anticancéreux contre les PDO est évaluée en mesurant la teneur en ATP intracellulaire, comme le montre la figure 2. Cette étape est effectuée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux).

1. Le jour 0, cultiver les PDO (p. ex., RLUN007) dans des flacons jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de grappes de cellules soit disponible pour le test. Un jour avant l’ensemencement, transférer la suspension aOP d’une fiole de 75 cm² dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min pour mesurer le volume de granulés aOP. Ensuite, remettez en suspension la pastille aOP dans 15 mL de milieu frais et transférez-la dans une fiole de 75 cm^2. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO_2.
   REMARQUE: Le volume de granulés d’AOP requis dépend du taux de dilution de chaque AOP et du nombre de plaques de 384 puits utilisées pour l’essai. Pour RLUN007, un volume de granulés cellulaires de 200 μL est nécessaire pour l’ensemencement dans dix plaques de 384 puits.
2. Le jour 1 (24 h après le changement du milieu), hachez les AOP à l’aide d’un équipement de fragmentation et de dispersion cellulaire (voir Tableau des matériaux)avec un porte-filtre contenant un filtre maillé de 70 μm. Ensuite, diluer 15 mL de la suspension d’AOP par 10x. Ensemencez 40 μL de la suspension AOP dans des microplaques sphéroïdes (fond rond) à très faible fixation de 384 puits (voir Tableau des matériaux)à l’aide d’un distributeur de suspension cellulaire (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Pour le hachage des grappes de cellules, il est recommandé d’utiliser l’équipement de fragmentation et de dispersion de cellules disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux).
3. 24 h après l’ensemencement (jour 2), traiter les AOP avec 0,04 μL de solutions d’agents d’essai à des concentrations finales comprises entre 20 μM et 1,0 nM (10 dilutions en série) à l’aide d’un manipulateur de liquide (voir tableau des matériaux).
4. Le jour 8 (144 h après le traitement de la substance d’essai), ajouter le réactif de mesure intracellulaire de l’ATP aux puits d’essai. Mélanger les plaques à l’aide d’un mélangeur et incuber pendant 10 min à 25 °C. Mesurer la teneur intracellulaire en ATP sous forme de luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques (voir Tableau des matériaux).
5. Pour calculer la viabilité de la cellule, divisez la quantité d’ATP dans les puits d’essai par celle dans les puits de contrôle contenant le véhicule, en soustrayant le fond. Pour calculer le taux de croissance sur 6 jours, divisez la quantité d’ATP dans les puits de contrôle du véhicule par celle dans les puits de contrôle du véhicule 24 h après l’ensemencement.
6. Calculer la concentration inhibitrice de 50 % (CI₅₀₎et l’aire sous la courbe (ASC) à partir des courbes dose-réponse à l’aide d’un logiciel d’analyse des données biologiques (voir tableau des matériaux). Le facteur Z est un paramètre sans dimension qui va de 1 (séparation infinie) à <0, défini comme Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, où σc+, σc-, μc+ et μc- sont les écarts-types (σ) et les moyennes (μ) des contrôles élevé (c+) et faible (c−)¹⁴, respectivement.

3. HTS avec un système de prélèvement cellulaire et d’imagerie pour l’inhibition de la croissance

REMARQUE: S’il y a un écart important (lorsque le coefficient de variation [CV] au test est supérieur à 20%) dans les données utilisant le protocole 2, les PDO d’une taille sélectionnée peuvent être ensemencés dans des plaques de 96 ou 384 puits à l’aide d’un système de prélèvement et d’imagerie cellulaire (Figure 2). Le protocole est le même que celui décrit aux étapes 2.1 et 2.2 de la section précédente. Cette étape est effectuée à l’aide d’un système de prélèvement et d’imagerie de cellules disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux).

1. Le jour 1, réglez une microplaque sphéroïde à très faible attache de 384 puits avec 40 μL de milieu/puits comme plaque de destination sur le système de prélèvement et d’imagerie cellulaire.
2. Remplir la chambre de prélèvement (voir Tableau des matériaux)avec 6 mL de milieu de culture et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min pour éliminer les bulles d’air. Ajouter les PDO suspendus dans le milieu (volume de granulés AOP, 4 μL) à la chambre de prélèvement et les mettre sur le système.
3. Tenir la chambre pendant au moins 1 minute, suivie d’une dispersion, de sorte que les amas de cellules se déposent au fond de la chambre; ensuite, effectuez un balayage de la chambre.
4. Réglez la taille de prélèvement sur 140-160 μm (surface 15 386-20 000 μm²⁾sur le système pour la sélection automatique des grappes de cellules. Ensuite, vérifiez la qualité des grappes de cellules sélectionnées sur les images numérisées et transférez dix grappes de cellules par puits à l’aide d’embouts de prélèvement (voir Tableau des matériaux)dans la plaque de destination.
5. Effectuez les étapes du protocole à partir de l’étape 2.3.

4. HTS pour la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps

REMARQUE: Cette étape est effectuée à l’aide d’un système disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),qui est un instrument de mesure d’impédance électrique. Il est utilisé pour évaluer la cytolyse des PDO par cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) avec des anticorps monoclonaux et des cellules tueuses naturelles (NK) (Figure 3). Les cellules NK sont produites à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique à l’aide du kit de production de cellules NK (voir tableau des matériaux),en suivant les instructions du fabricant.

1. Mesure de l’activité ADCC
   1. Le jour 0, recouvrir une plaque de 96 puits (voir tableau des matériaux) de50 μL de solution de fibronectine de 10 μg/mL (0,5 μg/puits) à 4 °C pendant la nuit.
   2. Le jour 1, après avoir retiré la solution de fibronectine, ajouter 50 μL du milieu de culture à chaque puits pour mesurer l’impédance de fond.
   3. Avant l’ensemencement, ajouter 5 mL de réactif de dissociation de culture cellulaire (voir tableau des matériaux)aux AOP (RLUN007 : 100 μL de la pastille aOP dans une fiole de 75 cm²⁾ et incuber dans un incubateur à CO₂ à 37 °C pendant 20 min pour disperser les AOP. Pour arrêter la trypsinisation, ajouter 5 mL de milieu, centrifuger et retirer le réactif de dissociation. Rincer les AOP avec un milieu frais et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm (voir Tableau des matériaux).
   4. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de viabilité cellulaire (voir Tableau des matériaux).
   5. Transférer la suspension aOP dans un réservoir et mélanger à l’aide d’un pipetteur multicanal. Ajouter la suspension AOP dans des puits à 5 x 10⁴ cellules/puits dans une plaque de 96 puits. Chaque puits contient un volume final de 100 μL. Ensuite, placez la plaque dans une armoire de sécurité biologique à environ 25 °C pendant 30 min.
   6. Transférer la plaque à l’instrument dans un incubateur à CO₂ à 37 °C. Enregistrez les changements dans les signaux d’impédance toutes les 15 minutes en tant qu’indice de cellule.
   7. Décongeler les cellules NK dans un bain-marie à 37 °C le même jour que l’ensemencement de l’AOP. Transférer les cellules du flacon dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu pour cellules NK (voir Tableau des matériaux)et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à environ 25 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu frais. Après le comptage des cellules, ajustez la densité cellulaire à 1 x^{10 6} cellules/mL et transférez-la dans une fiole de 75 cm^2. Cultiver les cellules NK dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   8. Le jour 2, préparer les solutions d’anticorps (solution saline tamponnée au phosphate) à 10 fois la concentration finale dans des plaques stériles à fond en V de 96 puits.
   9. Retirer 60 μL de milieu de chaque puits et ajouter 10 μL de trastuzumab ou de solution de cétuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL et 0,1 μg/mL) aux AOP. Transférez les plaques à l’instrument dans un incubateur et enregistrez l’indice cellulaire pendant 1 h.
   10. Transférez la suspension de la cellule NK dans un tube de 50 mL et comptez le nombre de cellules. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et ajustez la densité des cellules NK à 1 x^{10 6} cellules/mL et 2 x 10⁶ cellules/mL avec le milieu pour les PDO.
   11. Ajouter 50 μL de suspension de cellules NK aux cellules effectrices (NK) à un rapport de cellules cibles (RLUN007) de 1:1 ou 2:1. Les concentrations finales des anticorps sont de 1 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,01 μg/mL. Conservez la plaque à environ 25 °C pendant 15 min et retournez les plaques à l’instrument.
2. Collecte et analyse des données
   1. Convertissez l’index cellulaire en pourcentage des valeurs de cytolyse à l’aide d’un logiciel d’analyse(voir Tableau des matériaux ).
   2. Le pourcentage de cytolyse fait référence au pourcentage de cellules cibles tuées par les cellules NK par rapport aux cellules cibles (PDO) seules comme témoin. Soustrayez les indices cellulaires des puits contenant uniquement des cellules NK de l’index des puits échantillons à chaque point temporel. Normaliser chaque valeur à l’indice cellulaire immédiatement avant l’ajout d’anticorps. Convertissez l’indice cellulaire normalisé en pourcentage de cytolyse à l’aide de l’équation suivante : % cytolyse = (1 - index cellulaire normalisé [puits d’échantillonnage]) / indice cellulaire normalisé (puits cibles seuls) x 100.

Un HTS très précis a été développé en utilisant des PDO et des microplaques de 384 puits pour évaluer les agents anticancéreux, et le développement d’un HTS pour chaque AOP a été précédemment rapporté10,11,12,13. Les performances du HTS ont été évaluées en calculant les CV et le facteur Z'. Le facteur Z est une méthode largement acceptée pour la validation de la qualité et des performances du test, et le test convient au HTS si cette valeur est >0,514. Les points de référence de contrôle dans le test sur plaque à 384 puits utilisant RLUN007 ont montré peu de variabilité, avec des valeurs CV de 5,8% et des facteurs Z calculés de 0,83, comme le montre la figure 4. Ces résultats indiquent que ce test a des performances élevées pour HTS. Pour étudier la sensibilité des PDO aux agents anticancéreux utilisant HTS, l’inhibition de la croissance a été évaluée à l’aide de RLUN007 traité avec huit agents anticancéreux, en particulier les inhibiteurs du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) (afatinib, erlotinib, géfitinib, lapatinib, osimertinib et rociletinib) et le paclitaxel, qui sont des traitements cliniques standard pour le cancer du poumon non à petites cellules, et la mitomycine C comme témoin positif. Les valeurs IC50 et ASC des agents anticancéreux pour chaque AOP sont indiquées à la figure 4. Le RLUN007 a montré une sensibilité élevée (IC50 < 2 μM, ASC < 282) pour tous les inhibiteurs de l’EGFR et autres agents anticancéreux. Les courbes sigmoïdes calculées pour toutes les données indiquaient que l’activité inhibitrice de croissance des agents anticancéreux pouvait être mesurée avec précision.

Le système de prélèvement et d’imagerie cellulaire est utilisé lorsque les données varient considérablement en utilisant la méthodologie ci-dessus. Le système de prélèvement et d’imagerie cellulaire, qui sélectionne les amas cellulaires avec précision sans les endommager, permet des tests HTS précis en alignant la taille des amas cellulaires pour exclure les débris cellulaires du système d’essai. Lorsque le système n’était pas utilisé, la valeur CV était de 26,0 % et la valeur du facteur Z était de 0,23 (données non présentées). Cependant, les valeurs des facteurs CV et Z ont été améliorées à 6,4% et 0,81, respectivement, en utilisant le système.

Pour étudier la cytolyse des PDO avec une activité ADCC à l’aide de l’instrument de mesure de l’impédance électrique, qui surveille le nombre, la morphologie et la fixation des cellules pendant une longue durée, les changements dans les signaux d’impédance ont été évalués à l’aide de RLUN007 traités avec les anticorps (trastuzumab et cetuximab) et les cellules NK en tant que cellules effectrices dans une plaque de 96 puits. Par rapport au contrôle composé uniquement de cellules cibles, le pourcentage de cytolyse a augmenté avec le temps. Il a atteint 45% ou 75% après 6 h à un rapport E:T de 1:1(Figure 5A,C)ou 2:1(Figure 5B,D)sans les anticorps. La cytolyse médiée par les cellules NK à l’aide du trastuzumab était d’environ 60 % et 90 % dans un rapport de1:1 (figure 5A,1 μg/mL) et de 2:1(figure 5B,1 μg/mL), respectivement, à 6 h. En revanche, le cétuximab a eu un impact dose-dépendant sur la cytolyse médiée par les cellules NK (Figure 5C,D). À la concentration la plus élevée de cétuximab, RLUN007 ont été détruits à 90% et 100% à un rapport de 1:1 et 2:1, respectivement (Figure 5C, D). L’effet du trastuzumab était plus faible que celui du cétuximab, avec seulement 60% de cytotoxicité. Ces résultats indiquent que le système de dosage de l’AOP peut évaluer l’activité de l’ADCC à l’aide d’une technologie basée sur l’impédance en temps réel.

Figure 1: Points critiques pour la culture de l’AOP. (A) Changement de couleur dans le support. (B) Mesure de la quantité de PDO à partir de la taille de la pastille en tapissant un tube de centrifugeuse contenant les PDO avec des tubes marqués à des niveaux de 50 à 200 μL. (C) Densité d’AOP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Résumé du protocole utilisé pour créer un système de dosage à haut débit utilisant des microplaques de 384 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Résumé du protocole pour le dosage à haut débit de l’activité ADCC. ADCC, cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps; NK, tueur naturel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Système d’essai à haut débit pour l’inhibition de la croissance avec des agents anticancéreux. Courbe dose-réponse de RLUN007 aux agents anticancéreux. Les AOP hachés ont été ensemencés dans des assiettes de 384 puits. Ceux-ci ont été traités pendant 6 jours avec dix concentrations différentes d’agents anticancéreux (entre 10 μM et 1,5 nM). Les données représentent la moyenne ±'écart-type des expériences triplicates. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Test à haut débit pour l’activité ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cétuximab. (A,C) Un rapport de 1:1 de RLUN007 aux cellules effectrices. (B,D) Cytolyse avec un rapport de RLUN007: cellules effectrices de 1:2. L’activité a été mesurée 12 h après l’ajout des cellules effectrices. Les données sont présentées comme la moyenne ±'écart-type de trois échantillons répliqués. ADCC, cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation est une filiale de Fujifilm Wako Pure Chemicals, propriétaire commercial des supports F-PDO et F-PDO par transfert de licence.