Imagerie des épines dendritiques chez Caenorhabditis elegans

Les épines dendritiques sont des structures cellulaires spécialisées qui reçoivent des informations des neurones voisins pour la transmission synaptique. L’activation des récepteurs des neurotransmetteurs élève le calcium intracellulaire et les voies de signalisation en aval dans ces protubérances neuronales caractéristiques¹. En raison de l’importance fondamentale des épines dendritiques pour la neurotransmission et de leur mauvaise régulation dans les maladies neurodéveloppementales¹, la découverte de facteurs qui modulent la morphogenèse et la fonction de la colonne vertébrale dendritique est d’un grand intérêt pour le domaine des neurosciences.

Récemment, des épines dendritiques ont été identifiées dans le système nerveux de C. elegans sur la base de caractéristiques clés partagées avec les épines de mammifères². Cette détermination est cruciale car elle ouvre la possibilité d’exploiter les avantages de C. elegans pour étudier la biologie de la colonne vertébrale. Les épines dendritiques des motoneurones dorsaux D (DD) reçoivent l’entrée des neurones cholinergiques (VA et VB) dans le cordon nerveux ventral (Figure 1A)^2,3,4. Ici, des méthodes d’imagerie sont présentées pour explorer la structure des épines dendritiques DD et leur fonction in vivo dans un système nerveux intact qui est facilement accessible à l’imagerie en direct et à l’analyse génétique. Pour surveiller la forme des épines dendritiques, (1) protéines fluorescentes cytosoliques, qui remplissent le processus dendritique et les épines; (2) les protéines fluorescentes liées à la membrane, qui décorent la bordure des épines dendritiques et des dendrites; ou (3) les marqueurs d’actine, LifeAct⁵ ou Utrophin⁶, enrichis en épines dendritiques sont utilisés, révélant ainsi leur forme. Pour surveiller la fonctionnalité des épines DD, la fluorescence GCaMP est utilisée pour détecter les transitoires Ca++ évoqués par l’activation de l’opsine décalée vers le rouge, Chrimson, dans les neurones cholinergiques présynaptiques⁷. Les deux stratégies devraient faciliter l’étude des épines dendritiques DD chez les animaux de type sauvage et mutants.

1. Détermination de la structure des épines dendritiques DD

1. Créer des vers transgéniques pour marquer les épines DD
   1. Utilisez le promoteur flp-13 pour construire un vecteur d’expression pour l’étiquette d’intérêt (par exemple, cytoplasmique mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (Figure 1). Voir la liste complète des plasmides dans le dossier supplémentaire 1.
   2. Utiliser des méthodes établies pour générer une lignée transgénique marquant les épines^{DD 8,9}.
2. Préparer le scellant
   1. Faire un mélange 1:1 de milieu d’enrobage à base de paraffine¹⁰ (voir le tableau des matériaux).
   2. Chauffer le milieu à 60 °C jusqu’à ce qu’il soit fondu, puis aliquote dans des tubes microcentrifugés recouverts de 1,5 mL et maintenir un bloc chauffant à 60-70 °C.
      REMARQUE: Le scellant peut durer 4 semaines dans le bloc chauffant.
3. Préparez un anesthésique.
   1. Fabriquer des solutions mères dans du_H2Odistillé de 1 % de tricaïne et de lévamisole 1 M (voir tableau des matières). Conserver à -20 °C.
   2. Préparer une solution de travail à 0,05 % de tricaïne et d’anesthésique au lévamisole à 15 mM, comme décrit aux étapes 1.3.3-1.3.5¹¹.
   3. Mélanger 75 μL de bouillon de Tricaïne à 1 % et 22,5 μL de lévamisole 1 M.
   4. Ajouter le tampon M9 à un volume final de 1,5 mL.
   5. Aliquote 10 μL de tricaïne à 0,05 %, lévamisole 15 mM dans des tubes microcentrifugés à 0,5 mL et conserver à -20 °C.
      NOTE: Le mélange anesthésique est sensible à la température et les aliquotes individuelles de la solution de travail ne doivent pas être recongelées après décongélation pour chaque expérience. Voir Fichier supplémentaire 2 pour une recette de tampon M9.
4. Acquérir des images haute résolution
   1. Préparer 10% d’agarose et la maintenir au bain-marie à 60 °C.
      NOTE: Voir le rapport de Monica Driscoll dans WormBook¹².
   2. Monter 15 à 20 jeunes adultes sur des tampons d’agarose à 10 % et ajouter 3 μL d’anesthésique (voir étape 3).
   3. Appliquer la lamelle de couverture (les vers sont immobilisés dans les 5 minutes).
   4. Scellez les bords de la lamelle de couverture avec un mélange de scellant adhésif fondu (voir le tableau des matériaux).
   5. Acquérir des images
      1. Acquisition en super-résolution
         1. Utilisez un microscope confocal à balayage laser équipé pour la microscopie à super-résolution d’une lentille d’objectif à huile 63x/1.40 Plan-Apochromat pour obtenir une petite taille de pixel (par exemple, < 50 nm). Acquérir des piles Z en utilisant la taille de pas recommandée par le logiciel du fabricant (voir Tableau des matériaux).
         2. Recueillir une série de sections optiques qui couvrent le volume total du processus ventral DD (par exemple, 15 à 20 tranches à une taille de pas de 0,19 μm ou une épaisseur de 2 à 3 μm). Soumettez des piles Z pour le traitement d’image à l’aide du logiciel du fabricant et analysez les images avec un score supérieur à 7 (Figure 1B, Figure 2 et Figure 3).
      2. Acquisition de Nyquist
         1. Utilisez un microscope confocal à balayage laser pour sélectionner la taille de pixel optimale pour la longueur d’onde de la lumière et l’ouverture numérique de l’objectif utilisé (par exemple, objectif d’huile Plan Fluor 40x/1.4).
            REMARQUE: La plus petite taille de pixel révélera la structure fine des épines DD.
         2. Soumettre la pile pour la déconvolution 3D à l’aide de l’algorithme automatique (voir le tableau des matériaux) (Figure 3).
      3. Utilisez la plus petite étape Z possible (par exemple, déterminée par l’étage piézoélectrique) car le suréchantillonnage dans Z peut donner des images plus nettes après la déconvolution^{3D 13}.
5. Analyse d’images
   1. Utiliser un logiciel de traitement d’image approprié (voir le tableau des matériaux) pour créer des projections d’intensité maximale des piles Z¹⁴.
   2. Comptez manuellement les protubérances sur la dendrite DD.
      NOTA : Les saillies sont des extensions perpendiculaires de l’arbre principal (figure 1B, pointes de flèches).
   3. Déterminer la longueur de la dendrite DD notée pour calculer la densité des épines par 10 μm de DD dendrite (Figure 1C).
   4. Classer les épines comme minces/champignons, filopodiales, trapues ou ramifiées (figure 2A).
      REMARQUE: Les épines minces / champignons présentent une base étroite (cou) et une extrémité plus large (tête). Les épines filopodiennes ne présentent pas de base resserrée (pas de cou) mais ont une largeur constante. Les épines trapues ont une base et une pointe larges. Les épines ramifiées sont des protubérances avec plus d’une extrémité.

2. Évaluation de l’activation des épines dendritiques DD par signalisation cholinergique présynaptique

1. Créer des vers transgéniques à l’aide de techniques conventionnelles (p. ex., microinjection)^8,9
   1. Utilisez le promoteur flp-13 pour stimuler l’expression du capteur Ca⁺⁺ , GCaMP6s, dans les neurones DD et le promoteur unc-4 pour stimuler l’expression de Chrimson, une channelrhodopsine décalée vers le rouge, dans les neurones VA présynaptiques (Figure 4A). Voir la liste des plasmides dans le dossier supplémentaire 1.
2. Préparer le tout-trans rétinien (ATR) et les plaques de contrôle.
   REMARQUE: ATR est un cofacteur requis pour que Chrimson fonctionne comme un canal ionique optogénétiquement activé.
   1. Préparer 100 mM ATR solution mère dans de l’éthanol (100%). Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 1 mL.
   2. Sous une hotte à flux laminaire, ajouter 300 μL de culture bactérienne OP50 pendant la nuit et 0,25 μL d’ATR à chaque plaque de gélose nutritive NGM (Nematode Growth Medium) de 60 mm et étaler avec une tige de verre stérile.
   3. Pour les témoins, ajouter 300 μL de bactéries OP50 et 0,25 μL d’éthanol (100%) à un groupe distinct de plaques NGM.
   4. Laisser reposer les assiettes dans la hotte à température ambiante pendant 24 h (à l’abri de la lumière ambiante) pour permettre la croissance bactérienne.
      NOTE: Les plaques peuvent être utilisées après l’incubation initiale de 24 heures ou maintenues à 4 ° C pour être utilisées dans les 5 jours.
3. Mise en place de l’expérience
   1. Placer cinq larves au stade L4 NC3569 sur des plaques d’ATR ou des plaques témoins ensemencées d’OP50 qui n’ont pas d’ATR et poussent dans l’obscurité à 23 °C.
   2. Trois jours plus tard, utiliser un microscope à dissection stéréoscopique pour confirmer le développement de la vulve afin de prélever la descendance du stade L4 dans l’ATR et les plaques de contrôle pour l’imagerie, comme décrit aux étapes 2.4.1-2.4.3.
   3. Sur une lame de microscope, placer 2 μL de polybilles de 0,05 μm (2,5 % de solides p/v) (voir le tableau des matériaux).
   4. Utilisez un fil de platine (« pic à vis sans fin ») pour ajouter un petit globule de super colle à la solution et agitez doucement pour générer des « brins » filamenteux de colle. Ajoutez ensuite 3 μL de tampon M9 (Figure 4B).
   5. Placer environ dix larves L4 dans la solution et appliquer une lamelle de couverture.
      REMARQUE: Les fibres de colle entreront en contact aléatoire avec les vers et les immobiliseront après l’application de la lamelle de couverture. Les vers qui sont incrustés dans de gros globules de colle semblent desséchés et ne doivent pas être imagés.
   6. Sceller les bords de la lamelle de couverture comme mentionné à l’étape 1.4.4.
4. Enregistrement des transitoires Ca⁺⁺ évoqués dans les épines dendritiques.
   1. Utilisez un microscope confocal à disque rotatif équipé d’une caméra CCD sensible, d’un objectif d’objectif à huile TIRF 100x et de lignes laser de 488 nm et 561 nm (voir le tableau des matériaux).
   2. Ajustez l’étage du microscope pour positionner les épines DD dans le plan focal.
   3. Configurez l’acquisition time-lapse pour éclairer l’échantillon avec une ligne laser de 488 nm à chaque image (pour détecter la fluorescence GCaMP6) et la ligne laser de 561 nm à intervalles périodiques (pour l’excitation de Chrimson).
      REMARQUE : Par exemple, utilisez une lumière de 488 nm pour capturer des instantanés consécutifs (200 ms) du signal GCaMP6s couplés à une impulsion de 200 ms de lumière de 561 nm toutes les 5 images (figure 4C-E). Avec cette configuration, les niveaux de GCaMP avant et après chaque impulsion de 561 nm sont détectés à ~1 s d’intervalle (200 ms de laser de 488 nm pour détecter la GCaMP avant l’activation de l’AV, 200 ms d’impulsion de 561 nm pour activer l’AV et ~600 ms pour basculer entre les lignes laser et les filtres d’émission. Avec cette configuration, les neurones VA sont activés toutes les 2,5 s.
5. Analyse de l’imagerie Ca⁺⁺ in vivo
   1. Utilisez la déconvolution 2D et l’alignement de l’image pour corriger les écarts mineurs résultant du mouvement du ver pendant l’acquisition (voir le tableau des matériaux).
   2. Définissez l’épine dendritique DD comme la région d’intérêt (ROI dans les figures 4C-D).
   3. Dupliquez le retour sur investissement et déplacez-vous vers une région voisine à l’intérieur du ver pour collecter le signal de fond (c’est-à-dire le bruit).
   4. Utilisez un logiciel approprié (voir le tableau des matières) pour exporter les intensités GCaMP6 afin d’exceller pour chaque point temporel. Soustrayez la fluorescence de fond de la fluorescence ROI de la colonne vertébrale.
   5. Déterminer le changement de fluorescence en soustrayant la fluorescence GCaMP6s dans le cadre immédiatement avant l’excitation de 561 nm (F0) de chaque point temporel après excitation (ΔF), puis en divisant par F0 pour déterminer ΔF/F0 (Figure 4E).
   6. Représenter graphiquement les traces normalisées (voir le tableau des matériaux).
   7. Effectuer un test statistique apparié pour chaque mesure de la fluorescence GCaMP6s avant et après chaque impulsion de lumière de 561 nm.
      REMARQUE : Cette approche exclut effectivement les fluctuations aléatoires de la fluorescence GCaMP6s qui, autrement, réduisent la puissance statistique de la comparaison du signal GCaMP6s moyen de toutes les mesures avant et après une excitation de 561 nm (Figure 4F).
   8. Pour les mesures qui montrent une distribution normale ou gaussienne, utilisez un test ANOVA paramétrique apparié et corrigez les comparaisons multiples pour chacun des deux groupes (ATR avant vs après, pas d’ATR avant vs après). Sinon, pour les données qui ne sont pas normalement distribuées, utilisez une ANOVA non paramétrique avec correction posthoc pour les tests multiples.
      REMARQUE : Les vers cultivés sur des plaques dépourvues d’ATR (« pas d’ATR ») sont des témoins nécessaires et ne doivent pas présenter de transitoires Ca⁺⁺ activés par 561 nm, car l’ATR est nécessaire pour la fonction de Chrimson.

Les mesures avec trois marqueurs indépendants (cytosolic mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) ont donné une densité moyenne de 3,4 ± 1,03 DD épines dendritiques par 10 μm de DD dendrite chez les jeunes adultes de type sauvage (Figure 1B,C). Pour cette analyse, les mesures obtenues avec le marqueur GFP::Utrophin qui ont donné une densité de colonne vertébrale significativement plus faible ont été exclues (2,4 ± 0,74, Figure 1) en raison des interactions de l’utrophine avec le cytosquelette d’actine6 qui entraîne potentiellement la morphogenèse de la colonne vertébrale15. Les mesures de densité de la colonne vertébrale au microscope optique sont comparables à la valeur de 4,2 épines / dendrite de 10 μm obtenue à partir de la reconstruction de 12 épines à partir de micrographies électroniques du neurone DD12. L’approche d’imagerie sur cellules vivantes a confirmé que la morphologie mince/en forme de champignon des épines DD prédomine dans les formes d’épines adultes par rapport aux autres formes d’épines (p. ex. filopodiales, trapues, ramifiées) (figure 2B), ce qui est également typique des épines du système nerveux des mammifères matures16.

Une stratégie optogénétique a été utilisée pour demander si les épines dendritiques présumées détectées par microscopie optique à haute résolution (Figure 1 et Figure 2) répondent à la libération de neurotransmetteurs par les sites présynaptiques, une caractéristique caractéristique des épines dendritiques dans les neurones des mammifères. La lumière verte (561 nm) a été utilisée pour activer une variante de la channelrhodopsine, Chrimson, dans les neurones cholinergiques présynaptiques et la lumière bleue (488 nm) pour détecter la fluorescence dépendante de Ca++ émise par une sonde cytoplasmique GCaMP dans les épines dendritiques DD postsynaptiques. Cette expérience a détecté des rafales transitoires de signal GCaMP dans les épines DD immédiatement après l’activation optogénétique de Chrimson dans les neurones VA présynaptiques (Figure 3). Le succès de cette expérience dépend de l’expression fiable de Chrimson dans tous les neurones VA présynaptiques. Dans ce cas, un intégrateur chromosomique17 du marqueur Punc-4::Chrimson a été utilisé pour assurer une expression cohérente de VA. Cette expérience pourrait également être menée avec un réseau extrachromosomique. L’expression de Chrimson dans un neurone VA spécifique peut être confirmée indépendamment, par exemple, en couplant le transgène de Chrimson à une séquence leader transpliquée SL2 avec une GFP localisée nucléaire en aval comme marqueurde co-expression 2. Il est essentiel d’effectuer une expérience de contrôle en l’absence d’ATR pour confirmer que le signal GCaMP mesuré dépend de l’activation optogénétique de Chrimson, qui est strictement dépendante de l’ATR (Figure 4D). Enfin, les signaux Ca++ évoqués étant transitoires, il est crucial d’adopter un protocole d’imagerie qui permet une commutation rapide (<1 s) entre l’excitation 561 nm et l’acquisition du signal GCaMP avec le laser 488 nm (Figure 4).

Figure 1 : Marquage des épines dendritiques DD. (A) (en haut) Six neurones D dorsaux (DD1-DD6) dans le cordon nerveux ventral de C. elegans. (En bas) Chez les adultes, les épines DD dirigées ventralement (pointe de flèche), les bornes présynaptiques des motoneurones ventraux A (VA) et Ventral B (VB) (magenta), et les commissures DD s’étendent jusqu’au cordon nerveux dorsal pour fournir un débit GABAergique aux muscles du corps (flèche)18. Cette figure a été modifiée par rapport à la référence2. (B) Micrographies fluorescentes (Airyscan) d’épines DD marquées avec mCherry cytosolique, mRuby myristoylé (MYR::mRuby), LifeAct::GFP et GFP::Utrophin chez de jeunes vers adultes. Les pointes de flèches grises pointent vers des épines. Barre d’échelle = 2 μm. (C) Densité (épines/10 μm) des épines dendritiques du neurone DD marquées avec mCherry cytosolique (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) ou GFP::Utrophine (2,41 ± 0,8). Tous les échantillons sont normalement distribués. L’ANOVA unidirectionnelle montre que les densités de colonne vertébrale pour mCherry cytosolique, MYR::mRuby et LifeAct::GFP ne sont pas significativement différentes (NS), alors que la densité de la colonne vertébrale est réduite pour GFP::Utrophin vs. mCherry marqué cytosoliquement (p = 0,0016) et LifeAct::GFP (p = 0,0082). La ligne rouge pointillée représente la densité de la colonne vertébrale des neurones DD évaluée à partir de la reconstruction EM 3D (4,2 épines / 10 μm). Cette figure a été modifiée par rapport à la référence2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Imagerie des épines dendritiques DD. (A) (Haut) Schéma des formes de la colonne vertébrale. (En bas) Images Airyscan de chaque type de colonne vertébrale (barre d’échelle = 500 nm) étiquetées avec LifeAct::GFP (vert) et reconstructions 3D par micrographies électroniques en série d’un adulte gelé à haute pression (bleu). (B) Fréquence de la colonne vertébrale par type, visualisée avec LifeAct::GFP: Mince/Champignon (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Ramifié (15,42 ± 6,01%). Fréquence des épines par type visualisée avec MYR::mRuby: mince / champignon (52,2 ± 16,5%), filopodial (5,68 ± 7,0%), trapu (33,1 ± 14,8%), ramifié (9,02 ± 9,6%). Test T non apparié, filopodiale (p = 0,0339); Les épines trapues (p = 0,0009) et ramifiées (p = 0,011) étiquetées avec le marqueur MYR::mRuby sont significativement différentes de LifeAct::GFP. Cette figure a été modifiée par rapport à la référence2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Stratégies d’acquisition d’images haute résolution des épines DD. (A-B) (Haut) Images fluorescentes de dendrites DD1 marquées avec un marqueur cytosolique (mCherry) par (A) détecteur Airyscan et (B) acquisition de Nyquist. (En bas) La dendrite DD (rouge) est représentée avec un logiciel d’analyse d’image (option de trajectoire automatique du traceur de filament), et les épines DD (bleues) sont illustrées graphiquement à l’aide du module de détection d’épines semi-automatisé. La flèche pointe vers l’épine ramifiée agrandie en C et D. Les pointes de flèches désignent les épines minces / champignons voisines élargies en C et D. Barre d’échelle = 2 μm. (C-D) Exemples agrandis d’épines ramifiées (flèche) (en haut) et (en bas) de deux épines minces / champignons voisines (pointes de flèches) obtenues avec (C) détecteur Airyscan ou par (D) acquisition de Nyquist. Barre d’échelle = 500 nm. Données reproduites à partir de2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Évaluation de la fonction des épines DD. (A) Les motoneurones DD expriment l’indicateur Ca++ GCaMP6s (vert), et les motoneurones VA expriment le variant channelrhodopsine, Chrimson (magenta)7. (B) Méthode de représentation schématique pour le montage des vers pour les mesures de Ca++ . (1) Sur une lame de microscope propre, (2) placer 2 μL de billes de polyéthylène de 0,05 μm, (3) utiliser un fil de platine (« pic à vis sans fin ») pour ajouter un petit globule de super colle et (4) tourbillonner dans la solution pour générer des brins filamenteux de colle. (5) Ajouter 3μL de tampon M9. (6) Placer environ dix larves L4 dans la solution, (7) appliquer la glissière de couverture et sceller les bords avec de la vaseline/cire. (C-D) L’activation des neurones VA est en corrélation avec les transitoires Ca++ dans les épines DD1. La fluorescence GCaMP6s imagée (à intervalles de 0,5 s) avec activation périodique de la lumière de Chrimson (intervalles de 2,5 s) évoque des transitoires Ca++ avec (C) + ATR (n = 12) mais pas dans les contrôles (D) (-ATR, n = 12). Les panneaux sont des instantanés dans le temps (s), avant et après l’impulsion de lumière de 561 nm (ligne rose verticale). Barres d’échelle = 2 μm. Le signal GCaMP6s est acquis à partir d’une ROI (région d’intérêt) à l’extrémité de chaque colonne vertébrale. (E) Fluorescence GCaMP6s pendant la période d’enregistrement de 10 s tracée pour +ATR (vert) vs -ATR (témoin, gris) (n = 12 vidéos). Les barres roses verticales indiquent un éclairage de 561 nm (p. ex., activation de Chrimson). Chaque animal a été stimulé 4 fois avec une lumière de 561 nm. Des mesures ont été recueillies avant et après chaque impulsion de lumière de 561 nm. (F) Tracé de la fluorescence GCaMP6s avant et après chaque impulsion de lumière de 561 nm. La fluorescence GCaMP6s a été mesurée 1 s après chaque impulsion de lumière de 561 nm. Étant donné que les échantillons ne sont pas normalement distribués, un test de Friedman non paramétrique apparié a été appliqué pour corriger les comparaisons multiples de la fluorescence GCaMP6s avant vs. après une stimulation lumineuse de 561 nm pour les vers cultivés soit avec ATR (+ATR, vert) (*** p = 0,0004, n = 48 mesures) ou en l’absence d’ATR (-ATR, gris) (NS, non significatif, p = 0,0962, n = 48 mesures). Cette figure a été modifiée par rapport à la référence2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Liste des plasmides utilisés dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier complémentaire 2 : Composition et préparation du tampon M9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts.