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Article de méthode

Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

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DOI :

10.3791/62756

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21 juin 2021

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1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Résumé

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme et sont actuellement incurables. Ces maladies provoquent des anomalies neurodéveloppementales dont les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Un obstacle majeur est le manque de modèles efficaces récapitulant la déficience neuronale précoce observée chez les patients. Les progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération d’organoïdes cérébraux tridimensionnels (3D) qui peuvent être utilisés pour étudier l’impact des maladies sur le développement et l’organisation du système nerveux. Les chercheurs, y compris ces auteurs, ont récemment introduit des organoïdes cérébraux humains pour modéliser les troubles mitochondriaux. Cet article présente un protocole détaillé pour la génération robuste d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation dans le profilage bioénergétique mitochondrial et les analyses d’imagerie. Ces expériences permettront l’utilisation d’organoïdes cérébraux pour étudier les dysfonctionnements métaboliques et développementaux et peuvent fournir des informations cruciales pour disséquer la pathologie neuronale des maladies mitochondriales.

Introduction

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme1. Ils sont causés par des mutations génétiques perturbant différents processus mitochondriaux, y compris la phosphorylation oxydative (OXPHOS)2, l’assemblage de la chaîne respiratoire, la dynamique mitochondriale et la transcription ou la réplication de l’ADN mitochondrial3. Les tissus ayant des besoins énergétiques sont particulièrement affectés par le dysfonctionnement mitochondrial4. En conséquence, les patients atteints de maladies mitochondriales développent généralement des manifestations neurologiques précoces.

Il n’existe actuellement aucun traitement disponible pour les enfants atteints de maladies mitochondriales5. Un obstacle majeur au développement de médicaments pour les maladies mitochondriales est le manque de modèles efficaces récapitulant l’évolution de la maladie humaine6. Plusieurs des modèles animaux actuellement étudiés ne présentent pas les défauts neurologiques présents chez les patients7. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à la pathologie neuronale des maladies mitochondriales ne sont toujours pas entièrement compris.

Des études récentes ont généré des CSPi de patients atteints de maladies mitochondriales et ont utilisé ces cellules pour obtenir des cellules neuronales spécifiques au patient. Par exemple, des défauts génétiques associés à la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, se sont avérés causer des aberrations dans la bioénergétique cellulaire8,9, la synthèse des protéines10 et l’homéostasie du calcium9,11. Ces rapports ont fourni d’importants indices mécanistes sur la déficience neuronale survenant dans les maladies mitochondriales, ouvrant la voie à la découverte de médicaments pour ces maladies incurables12.

Les cultures bidimensionnelles (2D), cependant, ne permettent pas d’étudier la complexité architecturale et l’organisation régionale des orgues 3D13. À cette fin, l’utilisation d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC spécifiques au patient14 peut permettre aux chercheurs d’obtenir des informations supplémentaires importantes et ainsi aider à disséquer l’impact des maladies mitochondriales sur le développement et la fonction du système nerveux15. Des études utilisant des organoïdes cérébraux dérivés de l’iPSC pour étudier les maladies mitochondriales commencent à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales.

Les organoïdes de la moelle épinière porteurs de mutations associées à la maladie mitochondriale, à l’encéphalopathie mitochondriale, à l’acidose lactique et au syndrome des épisodes ressemblant à des accidents vasculaires cérébraux (MELAS) ont montré une neurogenèse défectueuse et une différenciation retardée des motoneurones16. Les organoïdes corticaux dérivés de patients atteints de la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, ont montré une taille réduite, des défauts dans la génération de bourgeons épithéliaux neuronaux et une perte de l’architecture corticale17. Les organoïdes cérébraux de patients atteints du syndrome de Leigh ont montré que les défauts de la maladie s’initient au niveau des cellules progénitrices neurales, qui ne peuvent pas s’engager dans le métabolisme mitochondrial, provoquant une ramification neuronale aberrante et une morphogenèse18. Ainsi, les progéniteurs neuronaux peuvent représenter une cible thérapeutique cellulaire pour les maladies mitochondriales, et les stratégies favorisant leur fonction mitochondriale peuvent soutenir le développement fonctionnel du système nerveux.

L’utilisation d’organoïdes cérébraux pourrait aider à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales. Les maladies mitochondriales sont principalement considérées comme une neurodégénérescence précoce5. Cependant, des défauts neurodéveloppementaux sont également présents chez les patients atteints de maladies mitochondriales, notamment un retard de développement et des troubles cognitifs19. Les organoïdes cérébraux spécifiques au patient peuvent aider à traiter ces aspects et à élucider comment les maladies mitochondriales peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau humain. Le dysfonctionnement mitochondrial pourrait également jouer un rôle pathogénétique dans d’autres maladies neurologiques plus courantes, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington4. Par conséquent, élucider l’impact des défauts mitochondriaux dans le développement neurologique à l’aide d’organoïdes cérébraux pourrait également être déterminant pour l’étude de ces maladies. Cet article décrit un protocole détaillé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles qui peuvent être utilisés pour effectuer la modélisation des maladies mitochondriales.

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Protocole

REMARQUE: L’utilisation de CSPi humaines peut nécessiter une approbation éthique. Les CSPi utilisées dans cette étude ont été dérivées de personnes témoins en bonne santé après approbation éthique locale (#2019-681). Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire stérile, en désinfectant soigneusement tous les réactifs et consommables avant de les transférer sous le capot. Les CSPi humaines utilisées pour la différenciation devraient avoir un nombre de passage inférieur à 50 pour éviter les aberrations génomiques potentielles qui pourraient se produire lors d’une culture extensive. L’état pluripotent des cellules doit être validé avant la génération d’organoïdes, par exemple en surveillant l’expression de marqueurs associés à la pluripotence tels que NANOG ou OCT4. Des tests de mycoplasmes doivent être effectués chaque semaine pour s’assurer que les cultures sont exemptes de mycoplasmes.

1. Génération d’organoïdes cérébraux

  1. Culture des CSPi humaines
    1. Cultiver des CSPi humaines dans des conditions sans mangeoire dans un milieu iPSC (voir le tableau des matériaux) sur des plaques revêtues de 6 puits et les conserver dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE: Le transfert des cellules nourricières peut entraver la différenciation organoïde. Passage des cellules au moins une fois dans des conditions sans mangeoire.
    2. Passage des CSPi à 80% de confluence en utilisant un milieu de détachement sans enzyme dans des rapports allant de 1:4 à 1:12. Pour augmenter la survie cellulaire, ajoutez 10 μM d’inhibiteur de la protéine kinase rho-associée (ROCK) (Y27632) après chaque fractionnement.
  2. Dissocier les CSPi (80 % de confluence) - Jour 0.
    1. Préparer le milieu de différenciation corticale I (CDMI) (tableau 1). Préchauffer le milieu CDMI à température ambiante (22-25 °C) avant de l’ajouter aux cellules.
    2. Lavez les puits contenant les CSPi avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules mortes et les débris.
    3. Ajouter 500 μL de réactif préavertisSé A (table des matières) à chaque puits et incuber pendant 5 min à 37 °C. Vérifiez au microscope pour vous assurer du détachement des cellules.
    4. Ajouter 1 mL de milieu iPSC pour diluer le réactif A afin de neutraliser son activité.
    5. Utilisez une pipette de 1000 μL pour dissocier les cellules en les pipetant de haut en bas et transférez la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
    6. Centrifuger doucement les iPSC à 125 x g pendant 5 min à température ambiante (22-25 °C).
    7. Aspirez soigneusement le surnageant pour éviter de perturber la pastille cellulaire.
    8. Remettez en suspension la pastille avec 1 mL de CDMI pour obtenir une suspension à cellule unique et comptez le nombre de cellules.
    9. Préparer le milieu d’ensemencement avec 9 000 cSPi par 100 μL dans cdMI complété par un inhibiteur de ROCK de 20 μM, un inhibiteur de la caténine WNT de 3 μM (IWR1) et 5 μM de SB431542.
    10. Ajouter 100 μL de milieu d’ensemencement par puits à une plaque de fond en V de 96 puits.
    11. Conservez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
  3. Génération de neurosphère
    1. Le jour 1, observez que des agrégats cellulaires ronds (neurosphères) avec des bordures lisses définies se forment. Notez les cellules mortes autour des agrégats. Continuer à cultiver dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
    2. Le jour 3, agitez la plaque en tapotant trois fois sur les côtés pour détacher les cellules mortes.
    3. Ajouter 100 μL de CDMI complété par un inhibiteur de ROCK de 20 μM, 3 μM IWR1 et 5 μM SB431542 à chaque puits.
    4. Remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
    5. Le jour 6, retirez soigneusement 80 μL du milieu surnageant de chaque puits. Évitez de toucher le fond du puits.
    6. Ajouter 100 μL de CDMI complété par 3 μM IWR1 et 5 μM SB431542 à chaque puits. Remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
    7. Répétez les étapes 5 et 6 tous les 3 jours jusqu’au jour 18.
  4. Transfert de neurosphères
    1. Le jour 18, préparer le milieu de différenciation corticale II (CDMII) (tableau 1) et ajouter 10 mL à une plaque de culture cellulaire à ultra-faible fixation de 100 mm.
    2. Utilisez une pipette de 200 μL avec la pointe coupée pour transférer les neurosphères rondes de la plaque de 96 puits à la plaque de culture cellulaire à très faible fixation de 100 mm.
      REMARQUE: Soyez doux pour éviter d’endommager les neurosphères en vous assurant que l’ouverture de la pointe est assez large et que les agrégats ne sont pas aspirés trop rapidement.
    3. Retirer 5 mL de milieu de la plaque contenant les neurosphères et ajouter 5 mL de CDMII frais.
      REMARQUE: Cette procédure aide à réduire la quantité de milieu CDMI qui peut avoir été transférée par le transfert de neurosphères.
    4. Placez la plaque sur un agitateur orbital à 70 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE: Inspectez visuellement les neurosphères le lendemain. Augmentez la vitesse du shaker orbital si les neurosphères sont agglomérées ou attachées au fond de la plaque.
    5. Tous les 3 jours, aspirez soigneusement le milieu surnageant et remplacez-le par du CDMII frais. Laissez une petite quantité du milieu pour empêcher les neurosphères de se dessécher.
    6. Le jour 35, préparez le milieu de différenciation corticale III (CDMIII) (tableau 1).
      REMARQUE: Le composant de la matrice doit être dissous dans le CDMIII froid.
    7. Aspirer le milieu de la plaque et ajouter 10 mL de CDMIII froid.
      REMARQUE: Il est plus efficace d’utiliser un milieu froid afin que le composant de la matrice puisse recouvrir les organoïdes sans former d’amas.
    8. Après avoir changé le milieu, replacez la plaque sur un agitateur orbital à 70 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
    9. Changez le milieu tous les 3-5 jours en fonction du taux de croissance, comme indiqué par la couleur du milieu.
    10. Le jour 70, préparez le milieu de différenciation corticale IV (CDMIV) (tableau 1). Utilisez le milieu CDMIV jusqu’à ce que l’âge souhaité des organoïdes soit atteint. Pendant cette période, maintenez la plaque sur un agitateur orbital réglé à 70 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C et 5 % de CO2).
    11. Changez le milieu tous les 3-5 jours, en fonction du taux de croissance.

2. Immunocoloration des organoïdes cérébraux

  1. Préparation des tissus
    1. Préparez une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et placez-la sous une hotte de sécurité.
      REMARQUE: Portez de l’équipement de sécurité personnelle lorsque vous manipulez du PFA.
    2. Recueillez les organoïdes cérébraux et transférez-les doucement avec une pipette Pasteur en plastique de 3 mL à pointe émoussée dans une plaque de 6 puits remplie de PFA.
      REMARQUE: Utilisez des organoïdes de plus de 40 jours pour permettre la visualisation de structures avec une complexité cellulaire plus élevée.
    3. Conserver les organoïdes dans la solution de PFA pendant 1 h à température ambiante.
    4. Retirez soigneusement le PFA avec une pipette Pasteur en plastique de 3 mL et lavez les organoïdes fixes trois fois à l’aide de PBS.
    5. Conserver les organoïdes fixes à 4 °C dans du PBS jusqu’à nouvel usage.
  2. Préparation de tranches organoïdes cérébrales
    1. Préparer une solution de gélose à 3% et chauffer lentement jusqu’à ce qu’elle soit liquéfiée.
    2. Placez le moule (l’extrémité coupée d’une seringue de 10 mL) sur un morceau de papier filtre absorbant (côté lisse vers le haut). Placez une gouttelette de gélose dessus.
    3. Retirez rapidement un seul organoïde de la plaque de 6 puits avec une spatule et retirez l’excès de PBS avec du papier filtre.
      REMARQUE: Veillez à ne pas toucher l’organoïde directement avec du papier filtre.
    4. Placez l’organoïde sur la gouttelette d’agar.
    5. Répétez cette procédure avec jusqu’à trois organoïdes.
      REMARQUE: Travaillez rapidement pour éviter la solidification de la gélose au cours de cette étape.
    6. Remplissez le moule avec de la gélose jusqu’à ce que tous les organoïdes soient complètement recouverts.
    7. Attendez que la gélose commence à se solidifier, puis transférez doucement tout le moule contenant les organoïdes, y compris le papier filtre absorbant, sur un élément de refroidissement.
      REMARQUE: Si un élément de refroidissement n’est pas disponible, conservez les organoïdes pendant quelques minutes dans un réfrigérateur à 4 ° C.
    8. En attendant, préparez-vous à la procédure de tranchage: placez une lame de rasoir (nettoyée à l’acétone et lavée à l’eau double distillée) dans le support du vibratome, montez-la sur le bain et remplissez-la de PBS.
    9. Retirez le moule de la gélose (solidifiée) et utilisez un scalpel pour le couper afin de former un cube.
    10. Fixez le cube de gélose contenant les organoïdes sur la plaque porteuse du vibratome avec du gel adhésif (voir le tableau des matériaux) et placez-le dans le bain contenant du PBS.
    11. Ajustez le vibratome (voir le tableau des matériaux) pour couper des tranches à une épaisseur de 150 μm.
      REMARQUE: Les réglages du vibratome (angle, amplitude, fréquence et vitesse appropriés de la lame) peuvent être similaires à ceux utilisés pour trancher le tissu cérébral fixe dérivé d’animaux postnatals précoces. Cependant, les réglages idéaux dépendent fortement du type de vibratome et doivent être déterminés dans un premier temps pour éviter la distorsion ou même l’arrachage du tissu lors de la coupe.
    12. Commencez la procédure de coupe. Utilisez une pipette en verre ou une spatule pour transférer doucement chaque tranche fraîchement coupée dans une assiette de 24 puits remplie de PBS.
    13. Conserver la plaque contenant les tranches à 4 °C (jusqu’à quelques jours) jusqu’à la suite du traitement.
    14. Transférez les tranches hors de la plaque avec une pipette en verre ou une spatule sur des lames de microscope. Utilisez un minimum de 2 tranches par diapositive.
    15. Retirez soigneusement la gélose et l’excès de PBS avec une seringue.
    16. Laissez sécher les tranches jusqu’à ce qu’elles adhèrent aux lames.
      REMARQUE: Bien que les lames de microscope puissent être stockées dans des chambres en plastique remplies de PBS à 4 ° C, elles doivent être colorées dès que possible après la procédure de tranchage.
  3. Coloration immunohistochimique
    1. Préparez la solution bloquante (Tableau 1).
    2. Utilisez un stylo PAP pour dessiner une bordure hydrophobe autour des tranches sur la diapositive afin de garder toutes les solutions sur les diapositives.
    3. Ajouter soigneusement la solution bloquante sur la lame et incuber pendant 1 h à température ambiante (22-25 °C). Pour éviter de détruire le tissu, n’ajoutez pas la solution directement sur les tranches.
    4. Aspirer la solution bloquante et appliquer l’anticorps primaire désiré dilué dans la solution bloquante.
    5. Incuber la lame pendant la nuit dans une chambre humidifiée à 4 °C.
    6. Rincez la lame trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chacun.
    7. Incuber les tranches avec l’anticorps secondaire spécifique dilué dans la solution bloquante et effectuer une coloration Hoechst (1:2 500) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
      REMARQUE: N’oubliez pas d’effectuer des contrôles négatifs pour confirmer qu’il n’y a pas de liaison non spécifique ou d’auto-fluorescence.
    8. Rincez trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chacun dans l’obscurité.
    9. Ajoutez une goutte de support de montage à la tranche, placez un couvercle sur le bord de la goutte et posez lentement le couvercle vers le bas vers la tranche pour éviter les bulles d’air.
    10. Laissez la glissière reposer pendant la nuit à température ambiante. Appliquez du vernis à ongles sur la bordure du couvercle pour sceller davantage la diapositive. Pour un stockage à long terme, conserver à 4 °C.
  4. Documentation de la coloration
    1. Pour numériser de grandes images pour l’assemblage, utilisez un microscope à grand champ vertical motorisé équipé (voir la table des matériaux pour plus de détails) d’un objectif de haute qualité; Ensemble de filtres DAPI (par exemple, excitation (EX): 340-380 nm, miroir dichroïque (DM): 400 nm, filtre barrière (BA): 435-485 nm); ensemble de filtres à isothiocyanate de fluorescéine (p. ex. EX : 465-495 nm, DM : 505 nm, BA : 515-555 nm); Ensemble de filtres Alexa594 (par exemple, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); appareil photo numérique; logiciel d’acquisition haute performance permettant des points de suture et des opérations de pile automatisés.
    2. Pour la gestion des images, utilisez un programme de traitement d’image capable de générer des fichiers tif 8 bits, de recadrer des points, d’ajuster le contraste et la luminosité, de fusionner les couches (par exemple, bleu, vert et rouge) et d’ajouter des barres d’échelle.
    3. Pour numériser des détails, utilisez un microscope à balayage laser confocal motorisé équipé d’un objectif de haute qualité, un laser UV (EX: 408 nm), un laser Argon (EX: 488 nm), un laser Hélium-Néon (EX: 543), un logiciel d’imagerie pour un microscope confocal.
    4. Pour la gestion des détails de l’image, utilisez un programme de traitement d’image capable de générer des projections d’intensité maximale de piles z confocales (par exemple, des sections optiques de 0,6 μm chacune), de générer des fichiers tif 8 bits, d’ajuster le contraste et la luminosité, de fusionner les canaux (par exemple, bleu, vert et rouge), d’ajouter des barres d’échelle.
    5. Utilisez un éditeur graphique pour organiser les figures.

3. Profilage bioénergétique des organoïdes cérébraux

  1. Préparation d’organoïdes pour le profilage bioénergétique
    1. Préparez la solution de papaïne et de DNase en suivant le protocole du fabricant.
    2. Transférer 3 à 5 organoïdes dans une plaque de 6 puits. Lavez-les deux fois avec du PBS préavertissé.
    3. Ajouter 2 mL de solution de papaïne activée préavertissée contenant de la DNase. À l’aide d’une lame, coupez les organoïdes en petits morceaux.
    4. Placez la plaque sur un agitateur orbital réglé à 27 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire (à 37 °C, 5 % de CO2) et incubez pendant 15 à 20 min.
      REMARQUE: Le temps d’incubation dépend du stade organoïde. Les organoïdes à un stade précoce peuvent être utilisés tels quels. Pour les organoïdes de plus de 3 mois, il est recommandé de couper les organoïdes en 2-3 morceaux avant la dissociation et d’incuber les morceaux à une vitesse de basculement fixée à 27 tr/min pendant 15-20 min à 37 °C. Cette procédure peut aider à éliminer le tissu nécrotique qui peut être présent dans les organoïdes à un stade avancé.
    5. Prélever les tissus digérés dans un tube de 15 mL et ajouter 5 mL de milieu de culture organoïde CDMIV (tableau 1).
    6. Triturez le tissu avec une pipette en plastique de 10 mL en pipetant de haut en bas 10 à 15 fois. Laissez le tissu non dissocié se déposer au fond du tube.
    7. Transférez soigneusement la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL, en évitant tout morceau de tissu non dissocié. Filtrer la solution à l’aide d’une crépine cellulaire de 40 μm (p. ex., tubes à fond rond en polystyrène avec capuchons de crépine cellulaire).
    8. Abattez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Évaluez le nombre de cellules et la qualité à l’aide du bleu trypan.
    10. Plaquez le nombre souhaité (~ 20 000/puits) de cellules sur des microplaques revêtues de 96 puits. Changer le milieu 6-8 h après le placage en milieu neuronal (tableau 1).
    11. Incuber la microplaque enduite de 96 puits dans un incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2) pendant 4 jours.
  2. Profilage bioénergétique
    1. Le jour 3, après avoir replaqué les cellules dissociées, ajoutez 200 μL de solution d’étalonnage dans chaque puits de la partie inférieure de la microplaque de 96 puits et placez la cartouche de capteur verte supérieure sur la microplaque hydratée.
      REMARQUE: Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la microplaque dans la bonne orientation et assurez-vous que la solution d’étrier couvre tous les capteurs.
    2. Incuber la microplaque hydratée de 96 puits dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant la nuit.
    3. Allumez l’analyseur pour permettre à l’instrument de se stabiliser à 37 °C pendant la nuit.
    4. Le jour 4 après la replaquage, inspectez la culture organoïde dissociée sur la microplaque de 96 puits sous le microscope pour vous assurer que les cellules apparaissent comme une monocouche confluente.
    5. Préparer le milieu d’essai (tableau 1).
    6. Retirez le milieu neuronal de tous les puits avec une pipette sans toucher le fond du puits pour éviter d’endommager les cellules. Alternativement, inversez soigneusement toute la plaque, puis séchez-la sur du papier propre. Travaillez rapidement pour éviter la mort cellulaire.
    7. Lavez les cellules deux fois avec 200 μL de milieu d’essai préavertissé. Ajouter le milieu d’essai à un volume final de 180 μL par puits. Incuber la microplaque de 96 puits dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant 1 h.
    8. Préparer des solutions de 10 μM d’inhibiteurs mitochondriaux dans le milieu d’essai. Notez que la concentration finale après injection est de 1 μM.
    9. Chargez la cartouche de capteur placée dans la microplaque hydratée avec 10x solutions d’inhibiteurs mitochondriaux.
      1. Ajouter 18 μL d’inhibiteur mitochondrial 1 dans le port A.
      2. Ajouter 19,8 μL d’inhibiteur mitochondrial 2 dans le port B.
      3. Ajouter 21,6 μL d’inhibiteur mitochondrial 2 dans le port C.
      4. Ajouter 23,4 μL d’inhibiteur mitochondrial 3 dans le port D.
    10. Placer la cartouche chargée dans la microplaque hydratée dans un incubateur sans CO2 à 37 °C jusqu’au début du test.
    11. Configurez un protocole d’exécution dans le logiciel de l’instrument (Tableau 2).
    12. Appuyez sur DÉMARRER. Prenez la cartouche chargée de l’incubateur sans CO2 et placez-la dans l’analyseur pour l’étalonnage.
      REMARQUE: Assurez-vous que la plaque est insérée dans la bonne orientation et sans le couvercle.
    13. Une fois l’étape d’étalonnage terminée, retirez la plaque d’étalonnage. Prenez la microplaque de 96 puits de l’incubateur sans CO2 et placez-la dans l’analyseur. Cliquez sur CONTINUER pour démarrer les mesures.
    14. Lorsque l’exécution est terminée, retirez la microplaque de culture cellulaire de 96 puits de l’analyseur et collectez le milieu de tous les puits sans perturber les cellules.
      REMARQUE: Le milieu peut être conservé à -20 ° C et utilisé plus tard pour mesurer la quantité de lactate libérée par les cellules dans le milieu à l’aide d’un kit de dosage de lactate approprié.
    15. Lavez les cellules avec 200 μL de 1x PBS dans chaque puits.
    16. Après avoir retiré le PBS, congeler la plaque à -20 °C.
      REMARQUE: La plaque congelée peut être utilisée pour quantifier les cellules, les protéines ou l’ADN dans chaque puits de la microplaque. Cette quantification sera nécessaire pour normaliser les taux bioénergétiques obtenus. Suivez les instructions du fabricant pour les tests de quantification des cellules, des protéines ou de l’ADN.

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Résultats

Le protocole décrit ici facilite la génération robuste d’organoïdes ronds (Figure 1A). Les organoïdes générés contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones (SMI312) et aux dendrites (protéine 2 associée aux microtubules (MAP2)) (Figure 1B).. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales (MAP2-positives), mais aussi ...

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Discussion

Cet article décrit la génération reproductible d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation pour la modélisation des maladies mitochondriales. Le protocole décrit ici est modifié sur la base d’un travail précédemment publié20. Un avantage majeur du protocole actuel est qu’il ne nécessite pas l’intégration manuelle de chaque organoïde dans une matrice d’échafaudage. En fait, la solution matricielle est simplement dissoute dans le milieu de culture cellulaire. De plus, il n’e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou non financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions Miriam Bünning pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 à A.P.), de Spark et de l’Institut de la santé de Berlin (BIH) (FONDS DE VALIDATION DE LA BOSNIE-HERZÉGOVINE à A.P.), de la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), de l’hôpital universitaire de Düsseldorf (Forschungskommission UKD à A.P.) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) (e: Subvention bio jeune chercheur AZ 031L0211 à A.P.). Les travaux en laboratoire du C.R.R. ont été soutenus par la DFG (FOR 2795 « Synapses sous stress », Ro 2327/13-1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-mercaptoéthanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdLogiciel de mise en page ; Éditeur de graphiques vectoriels
Alexa Fluor 488 âne anti-cochon d’IndeSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 âne anti-sourisThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycine ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-&beta ;-Tubuline III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Laser ArgonMelles GriotTout autre laser, par exemple, les lasers à diode émettant 488 est très bien, aussi
Acide ascorbiqueSigmaA92902
B-27 avec vitamine AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3 % dans PBS, stocker la solution à -20 ° ; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Culture cellulaire étoile 6 plaque à 6 puitsGreiner-Bio-One657160
Concentré de lipides chimiquement définisGibco11905031
Microscope confocal à balayage laser C1Nikon Microscopeconfocal modulaire système
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice de membrane basale, sans rouge de phénol, sans LDEVde lamatriceCorning
CyQUANT Kit de dosage de la prolifération cellulaireThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Âne anti-chèvre Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Âne anti-souris Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Âne anti-lapin Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc Appareil photoNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i Microscope droit à grand champNikon Microscope Solutions
Microscope droit Eclipse E 600FNmicroscope
Microscope inversé Eclipse Ts2Microsope Nikon EZ-C1
Silver Version 3.91Solutions de microscopeLogiciel d’imagerie pour microscope confocal
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Sérum de bovin fœtalGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Pipette en verre PasteurMarque747715Inverted
GlutamaxGibco35050-061
Laser hélium-néonMelles GriotUn laser sur deux, par exemple les lasers à diode émettant 594 est bien, aussi
HéparineMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubateurThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthLogiciel de traitement d’images
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Knockout Serum ReplacementGibco
Laser (407 nm)CohérentTout autre laser, par exemple les lasers à diode émettant 407 est très bien, aussi
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC medium
Multifuge X3R CentrifugeuseThermo Scientific10325804
MycoAlert Kit de détection de mycoplasmesLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
Aiguille à usage unique (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2Logiciel d’imagerieNikon
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAPour dessiner une barrière hydrophobe sur des lames.
Kit de système de dissociation de la papaïneWorthingtonLK003150
ParaformaldéhydeMerck8187154 % dans le PBS, solution de magasin à -20 ° ; C
Pipette Pasteur 7mLVWR612-1681Graduée jusqu’à 3 mL
Pénicilline-StreptomycineGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ; &infin ;/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsMicroscope sec
Objectif Plan Apo VC 60x / 1.40 huile DIC N2 &infin ;/0.17 WD 0.13Solutions de microscopeNikonMicroscope à immersion dans l’huile Objectif Boîte
Pétri en polystyrène (100 mm)Greiner Bio-One664161
Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine (5 mL)Falcon352235
Chlorure de potassiumRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Papier filtre qualitatifVWR516-0813
Inhibiteur de rocheMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100&beta ;AbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Lames de scalpelHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Bicarbonate de sodiumMerck/Sigma31437-1kg-M
Chlorure de sodiumRoth3957
Sodium phosphate de dihydrogèneApplichem131965
Pyruvate de sodiumGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase Réactif de dissociation cellulaireGibco/StemProA1110501Réactif A
Super Glue GelUHU63261Gel adhésif
SuperFrost PlusVWR631-0108
Seringue à usage unique (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Plate 24 WellSarstedt83.3922
TC Plate 6 WellSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Capotde culture tissulaireThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProduction terminé, tout autre microtome réglable convient également.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonist IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 analyseur de flux extracellulaireSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
Solution de calibrage XFSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (microplaque à 96 puits)Seahorse Bioscience102416-100
Composant 356231 Solutions de Nikon Solutions Nikon 10828010 de

Références

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