Article de méthode

Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

DOI :

10.3791/62757

⸱

5 janvier 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie intravitale (MIV) permet de visualiser le mouvement, la division et la mort des cellules à une résolution unicellulaire. La MIV à travers des fenêtres d’imagerie insérées chirurgicalement est particulièrement puissante car elle permet l’observation longitudinale du même tissu sur des jours ou des semaines. Les fenêtres d’imagerie typiques comprennent un couvercle en verre dans un cadre métallique biocompatible suturé à la peau de la souris. Ces fenêtres peuvent interférer avec la libre circulation des souris, provoquer une forte réponse inflammatoire et échouer en raison de bris de verre ou de sutures déchirées, dont l’une peut nécessiter une euthanasie. Pour résoudre ces problèmes, des fenêtres pour l’imagerie à long terme des organes abdominaux et des glandes mammaires ont été développées à partir d’un film mince de polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone optiquement clair précédemment utilisé pour les fenêtres d’imagerie crânienne. Ces fenêtres peuvent être collées directement sur les tissus, ce qui réduit le temps nécessaire à l’insertion. Le PDMS est flexible, contribuant à sa durabilité chez la souris au fil du temps – jusqu’à 35 jours ont été testés. L’imagerie longitudinale est l’imagerie de la même région tissulaire au cours de séances distinctes. Une grille en acier inoxydable a été intégrée dans les fenêtres pour localiser la même région, permettant la visualisation de processus dynamiques (comme l’involution des glandes mammaires) aux mêmes endroits, à quelques jours d’intervalle. Cette fenêtre en silicone a également permis de surveiller les cellules cancéreuses disséminées uniques se développant en micro-métastases au fil du temps. Les fenêtres en silicone utilisées dans cette étude sont plus simples à insérer que les fenêtres en verre à cadre métallique et provoquent une inflammation limitée des tissus imagés. De plus, les grilles intégrées permettent un suivi simple de la même région tissulaire lors de séances d’imagerie répétées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie intravitale (MIV), l’imagerie des tissus chez les animaux anesthésiés, offre un aperçu de la dynamique des événements physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire dans les tissus intacts. Les applications de cette technique varient considérablement, mais la MIV a joué un rôle déterminant dans le domaine de la biologie du cancer pour aider à élucider comment les cellules cancéreuses envahissent les tissus et métastasent, interagissent avec le microenvironnement environnant et répondent aux médicaments 1,2,3. En outre, la MIV a joué un rôle clé dans la compréhension des mécanismes complexes régissant les réponses immunitaires en fournissant des informations complémentaires aux approches de profilage ex vivo (par exemple, cytométrie en flux). Par exemple, des expériences d’imagerie intravitale ont révélé des détails sur les fonctions immunitaires en ce qui concerne la migration cellulaire et le contact cellule-cellule et ont offert une plate-forme pour quantifier la dynamique spatio-temporelle en réponse à une blessure ou à une infection 4,5,6,7. Beaucoup de ces processus peuvent également être étudiés par coloration histologique, mais seule la MIV permet le suivi des changements dynamiques. En fait, alors qu’une section histologique offre un instantané du tissu à un moment donné, l’imagerie intravitale peut suivre les événements intercellulaires et subcellulaires au sein du même tissu au fil du temps. En particulier, les progrès dans le marquage de fluorescence et le développement de rapporteurs moléculaires ont permis de corréler les événements moléculaires avec les comportements cellulaires, tels que la prolifération, la mort, la motilité et l’interaction avec d’autres cellules ou la matrice extracellulaire. La plupart des techniques de MIV sont basées sur la microscopie à fluorescence, ce qui, en raison de la diffusion de la lumière, rend l’imagerie des tissus plus profonds difficile. Le tissu d’intérêt doit donc souvent être exposé chirurgicalement avec une procédure souvent invasive et terminale. Ainsi, selon le site de l’organe, le tissu peut être imagé en continu pendant une période variant de quelques-uns à 40 h8. Alternativement, l’insertion chirurgicale d’une fenêtre d’imagerie permanente permet l’imagerie séquentielle du même tissu sur une période de jours àsemaines 7,9.

Le développement de nouvelles fenêtres d’imagerie a été mis en évidence comme un besoin technologique pour améliorer encore les approches d’imagerie intravitale10. La fenêtre d’imagerie intravitale prototypique est un anneau métallique contenant un couvercle en verre fixé à la peau avec des sutures11. L’interférence avec la libre circulation, l’accumulation d’exsudat et les dommages à la glissière de couverture en verre sont des problèmes courants observés lors de l’utilisation de telles fenêtres. De plus, la fenêtre prototypique nécessite une production spécialisée et la procédure chirurgicale peut nécessiter une formation approfondie. Pour résoudre ces problèmes, le polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone, qui a déjà été utilisé dans les fenêtres crâniennes pour l’imagerie à long terme dans le cerveau12, a été adapté pour une utilisation dans l’imagerie des organes abdominaux et des glandes mammaires. Ici, une méthode détaillée pour générer des fenêtres en silicone à base de PDMS est présentée, y compris comment couler la fenêtre autour d’une grille en acier inoxydable pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. En outre, une procédure chirurgicale simple et sans couture pour insérer la fenêtre sur les organes abdominaux ou la glande mammaire est décrite. Cette nouvelle approche permet de surmonter certains des problèmes les plus courants liés aux fenêtres d’imagerie actuellement utilisées et d’accroître l’accessibilité de l’imagerie intravitale longitudinale.

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Protocole

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Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux directives chirurgicales du laboratoire de Cold Spring Harbor et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du laboratoire de Cold Spring Harbor.

1. Coulée de la fenêtre en silicone

  1. Préparez le polymère de silicone (PDMS) en mélangeant l’élastomère de base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 (v / v).
  2. Coulez une fenêtre en déposant une petite quantité de PDMS sur une surface stérile et lisse et ajustez le rapport volume/surface à l’épaisseur souhaitée.
    REMARQUE: L’utilisation de 200 mg de solution de polymère pour un cercle de 22 mm de diamètre sur le couvercle d’un couvercle à 24 puits donne un bon compromis entre la robustesse de la fenêtre et la clarté optique.
  3. Facultatif : Pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires, appuyez légèrement sur une grille en acier inoxydable dans le silicone une fois que le PDMS est sur la surface de coulée souhaitée.
  4. Pour éliminer les bulles d’air, placez la surface revêtue dans un dessiccateur sous vide pendant 45 minutes pour dégazer le polymère.
  5. Durcir les fenêtres en silicone dans un four à 80 °C pendant 45 min.
  6. Marquez le polymère sur les bords du moule et pelez doucement les fenêtres durcies de la surface utilisée pour la coulée avec des pinces.
  7. Avant la chirurgie, stérilisez les fenêtres en autoclavant.

2. Préparation de la souris pour l’insertion de la fenêtre en silicone

  1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction en utilisant 4% (v/v) d’isoflurane. Déplacez la souris sur un coussin chauffant sur la table chirurgicale, placez la souris dans le masque nasal d’anesthésie et abaissez la concentration d’isoflurane à 2% pour l’entretien tout au long de la chirurgie.
  2. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils des membres postérieurs. Ne continuez pas tant que la souris n’est pas inactive et ne montre pas de réponse réflexe de pincement des orteils.
  3. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de sécher et prévenir les traumatismes.
  4. Administrer l’analgésie préventive (buprénorphine 0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée.
  5. Rasez le site chirurgical et enlevez complètement les poils avec une crème dépilatoire.
  6. Appliquer la solution de povidone-iode (10% v / v) et l’éthanol (70% v / v) consécutivement 3x pour prévenir l’infection du site chirurgical.

3. Insertion d’une fenêtre ventrale pour l’imagerie dans le foie; adaptable pour d’autres organes abdominaux (Figure 1)

  1. Placez la souris en position couchée.
  2. Faites une incision de 10 mm à partir de 3 mm du processus xiphoïde à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
  3. Enlever une section de peau de 1 à 1,5 cm2 le long de la ligne médiane.
  4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
  5. Facultatif: Pour visualiser une plus grande partie du foie, utilisez des cotons-tiges stériles humidifiés avec une solution saline stérile pour pousser le foie vers le bas du diaphragme révélant le ligament falciforme reliant le foie au diaphragme. Couper le ligament en prenant soin de ne pas couper la veine cave inférieure.
  6. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager. Cet adhésif crée un joint circulaire, laissant la zone centrale intacte pour l’imagerie.
    ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés. Il n’est pas nécessaire de sécher le tissu avant d’appliquer l’adhésif.
    REMARQUE: Tous les adhésifs à base de cyanoacrylate peuvent être utilisés avec succès pour cette procédure. L’adhésif chirurgical assure la stérilité. Pour les procédures terminales, les super colles tout usage donnent de bons résultats.
  7. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
  8. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
  9. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
  10. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
    REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu hépatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
  11. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.
    ATTENTION: Si la procédure est effectuée à l’aide de techniques chirurgicales stériles et que la fenêtre est stérilisée avant l’insertion, le scellement de la plaie avec de l’adhésif chirurgical est suffisant pour éviter les infections. Cependant, le non-respect des techniques aseptiques appropriées lors de l’insertion chirurgicale ou la fermeture imparfaite peut entraîner une infection manifeste ou subclinique et un dessèchement des tissus.

4. Insertion d’une fenêtre latérale pour l’imagerie dans le foie; compatible avec l’injection concomitante de cellules cancéreuses dans la veine porte (Figure 2)

  1. Placez la souris sur la position de décubitus latéral gauche
  2. Faites une incision de 10 mm sur le flanc droit à 3 mm sous l’arc costal à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
  3. Enlever une section de peau de 1 cm2 .
  4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
  5. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager.
    ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
    REMARQUE: Tous les adhésifs à base de cyanoacrylate peuvent être utilisés avec succès pour cette procédure. L’adhésif chirurgical assure la stérilité. Pour les procédures terminales, les super colles tout usage donnent de bons résultats.
  6. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le foie jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
  7. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
  8. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
  9. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
    REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu hépatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
  10. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.
  11. Si une injection de veine porte est nécessaire :
    1. Placez la souris en position couchée.
    2. Faites une incision de 10 mm en partant du processus xiphoïde dans la peau.
    3. À l’aide d’une deuxième paire de ciseaux et de pinces stériles, faites une incision de 10 mm dans le péritoine.
    4. Trempez deux cotons-tiges dans une solution saline stérile.
    5. Utilisez les cotons-tiges pour tirer doucement l’intestin sur de la gaze stérile humidifiée avec une solution saline stérile, en prenant soin de ne pas tordre ou perturber l’orientation.
    6. Continuez à déplacer l’intestin de la cavité abdominale jusqu’à ce que la veine porte soit visible sur le côté droit de l’abdomen.
    7. Insérez une aiguille de 31–33 G caudale de 5–7 mm jusqu’au point d’entrée de la veine porte dans le foie, en veillant à ce qu’elle se déplace dans le vaisseau sanguin et non à travers celui-ci.
    8. Injecter lentement les cellules cancéreuses (remises en suspension dans 100 μL de PBS stérile).
      REMARQUE: Pour cette expérience, la lignée cellulaire du cancer du pancréas de l’amurine (par exemple, KPC-BL / 6-1199) peut être cultivée dans un milieu DMEM complet et 1 x 105 cellules injectées dans 100 μL de PBS stérile.
    9. Pour prévenir les saignements, immédiatement après avoir retiré l’aiguille, appliquez une légère pression sur le site d’injection avec un petit morceau d’éponge chirurgicale pendant 1 à 2 minutes.
    10. Une fois la pression relâchée, surveillez le site pendant 1 à 2 minutes pour vous assurer de l’hémostase.
    11. À l’aide de cotons-tiges humidifiés, retournez l’intestin dans la cavité abdominale en suivant l’orientation physiologique de l’organe.
    12. À l’aide d’une pince stérile, insérez la fenêtre immédiatement sous le péritoine, sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris.
    13. Suture avec 4-0 sutures en soie et agrafe l’incision médiane avec des clips de plaie en acier inoxydable de 7 mm.
    14. Déplacez la souris vers la position de décubitus latéral gauche
    15. Faites une incision de 10 mm sur le flanc droit à 3 mm sous l’arc costal à travers la peau à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
    16. Retirez une section de peau de 1 cm2 autour de l’incision.
    17. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
    18. Tirez la fenêtre en place sur le foie avant de la coller en place, comme décrit aux étapes 4.8 à 4.10.

5. Insertion de la fenêtre d’imagerie dans le pancréas (Figure 3)

  1. Placez la souris sur la position de décubitus latéral droit.
  2. Faites une incision de 10 mm sur le flanc gauche à 3 mm sous l’arc costal à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
  3. Retirez une section de peau de 1 cm2 autour de l’incision.
  4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles et de pinces pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau.
  5. À l’aide de cotons-tiges stériles imbibés de solution saline stérile, tirez doucement sur la rate pour visualiser le pancréas. Procédez au repositionnement du pancréas avec les cotons-tiges humidifiés pour rendre plus de surface visible à travers l’incision.
    REMARQUE: À ce stade, les cellules cancéreuses du pancréas peuvent être injectées orthotopiquement dans le pancréas si cela fait partie de la conception expérimentale.
  6. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface du pancréas autour des bords de la zone à imager.
    ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
  7. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre le pancréas jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
  8. Pliez les bords de la fenêtre sous le péritoine.
  9. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine. Appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
  10. De même, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur le péritoine avant de pousser sur la peau avec une pince pour la fixer au péritoine.
    REMARQUE: Si elle est effectuée correctement, une zone circulaire du tissu pancréatique devrait maintenant être visible à travers la fenêtre.
  11. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.

6. Insertion de la fenêtre d’imagerie dans la glande mammaire (Figure 4)

  1. Placez la souris en décubitus dorsal.
  2. Faites une incision médiale de 10 mm sur l’un des mamelons inguinaux à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
  3. Enlever une section de peau de 0,5 cm2 au-dessus de la glande mammaire.
  4. Utilisez une deuxième paire de ciseaux stériles pour séparer soigneusement la glande mammaire de la peau en étalant les ciseaux entre les deux surfaces pour perturber l’adhérence.
    REMARQUE: Pour faciliter l’imagerie de la région de la glande mammaire inguinale, veillez à disséquer une partie de la peau au-dessus de la glande mammaire mais supérieure à la patte postérieure, de sorte que la fenêtre ne limite pas la mobilité de la souris.
  5. Retirez l’adhésif chirurgical avec une seringue de 31 G, appliquez-en une petite quantité sur la surface de la glande mammaire autour des bords de la zone à imager.
    ATTENTION : Limitez l’adhésif à de petites gouttelettes formant un motif circulaire autour de la zone d’imagerie. Les tissus immédiatement en contact avec l’adhésif ne peuvent pas être imagés.
  6. Positionnez la fenêtre à l’aide d’une pince et maintenez-la fermement contre la glande mammaire jusqu’à ce que l’adhésif ait séché (~2 min).
    REMARQUE: Une zone circulaire du tissu de la glande mammaire devrait maintenant être visible à travers la fenêtre si elle est effectuée correctement.
  7. Pliez les bords de la fenêtre sous la peau.
  8. Avec une seringue, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui sont maintenant sous la peau. Appuyez sur la peau avec des pinces pour fixer la peau à la fenêtre.
  9. Appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui aidera à empêcher la peau de repousser sur la fenêtre.

7. Récupération post-chirurgicale

  1. Placez la souris dans une cage de récupération propre avec suffisamment de matériel de nidification, en vous assurant qu’une partie de la cage repose sur un coussin chauffant.
  2. Surveillez la souris en continu jusqu’à ce qu’elle soit consciente et mobile.
  3. Si nécessaire, fournir une dose supplémentaire d’analgésique 12 h après la dose préventive.
    REMARQUE: Une analgésie supplémentaire est généralement inutile, mais consultez un vétérinaire si la souris montre des signes de détresse (comme le dos voûté, la fourrure négligée ou la perte d’intérêt pour la nourriture). Surveillez la souris quotidiennement pendant les 3 premiers jours après la chirurgie pour détecter tout signe d’infection ou d’autres effets indésirables. Moins de 2% des souris nécessitent des soins vétérinaires ou une euthanasie, généralement en raison d’un détachement partiel de la fenêtre. Il est important de noter que pour les souris mâles avec des fenêtres d’imagerie du foie ventral, les combats entre souris peuvent entraîner un détachement des fenêtres. Ceci est évité en logeant les souris séparément.

8. Imagerie à travers la fenêtre

  1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction en utilisant 4% (v/v) d’isoflurane.
  2. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de sécher et prévenir les traumatismes.
  3. Déplacez la souris de la chambre d’induction à l’étage du microscope. Placez la souris dans le masque nasal d’anesthésie et abaissez la concentration d’isoflurane à environ 1 à 1,5% pour l’anesthésie d’entretien tout au long de la procédure d’imagerie.
  4. Placez un capteur de coussin de pression sous la souris pour surveiller la fréquence respiratoire et fixez la souris à la scène à l’aide d’un ruban chirurgical souple.
  5. Insérez un thermomètre rectal pour surveiller la température corporelle tout au long de la séance d’imagerie.
  6. Allumez le coussin chauffant, en surveillant de près la souris pour vous assurer que la température corporelle ne dépasse pas 37 °C.
  7. Utilisez un logiciel pour surveiller le taux d’haleine de la souris. Le taux optimal est d’environ 1 respiration / seconde. Ajuster l’anesthésie au besoin.
  8. Avant chaque séance d’imagerie, nettoyez la fenêtre de tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et des débris en l’essuyant doucement avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70% (v / v).
  9. Lorsque vous utilisez une lentille d’immersion dans l’eau, appliquez un gel à ultrasons sur la fenêtre, en évitant les bulles.
    REMARQUE: L’eau distillée peut également être utilisée, mais peut nécessiter une nouvelle application pendant l’imagerie.
  10. Pour trouver la profondeur optimale pour l’imagerie, commencez par localiser la grille et placez-la au point.
  11. Déterminez la profondeur approximative de l’imagerie tissulaire en définissant le bas de la grille sur 0. Ces informations sont nécessaires pour localiser le plan z correspondant lors de sessions d’imagerie ultérieures.
  12. Pour identifier le même emplacement sur plusieurs sessions d’imagerie, utilisez les carrés de la grille comme point de référence. Pendant l’imagerie, notez l’orientation de la grille et l’emplacement dans la grille de chaque champ de vision imagé (par exemple, 2e ligne du haut, 4e carré à partir de la gauche).
  13. Au cours des sessions d’imagerie successives, utilisez la grille pour revenir à des zones de grille spécifiques - et donc à des champs d’imagerie.
  14. Après chaque séance d’imagerie, retirez tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et les débris en essuyant doucement la fenêtre avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70 % (v/v).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’imagerie intravitale via des fenêtres d’imagerie peut être utilisée pour observer, suivre et quantifier un large éventail d’événements cellulaires et moléculaires à une résolution unicellulaire sur une période de plusieurs heures à quelques semaines. Les caractéristiques idéales pour une fenêtre d’imagerie comprennent: a) un impact limité sur le bien-être de la souris et la physiologie du tissu; b) la durabilité; c) simplicité d’insertion; et d) des repères clairs pour l’imagerie répétée de la même région. Le résultat ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les fenêtres d’imagerie intravitale sont des outils importants pour visualiser directement les processus physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire au fur et à mesure qu’ils se déroulent au fil du temps. La nouvelle procédure décrite pour la coulée et l’insertion de fenêtres d’imagerie flexibles en silicone chez la souris surmonte certains des problèmes les plus courants avec les fenêtres d’imagerie actuellement utilisées (exsudat, rupture et interférence avec la mobilité normale), offre une sécurité supp...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. est membre du conseil consultatif de recherche pour brensocatib pour Insmed, Inc.; membre du conseil consultatif scientifique de Vividion Therapeutics, Inc.; un consultant pour Protalix, Inc.; et détient des actions d’Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. est co-fondateur de Mestag Therapeutics, et siège au conseil consultatif scientifique et détient des actions dans Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology et Cygnal Therapeutics. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Rob Eifert pour son aide dans la conception et l’optimisation des grilles en acier inoxydable découpées au laser. Ce travail a été soutenu par le CSHL Cancer Center (P30-CA045508) et des fonds pour M.E. des National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 et 5P01CA013106-49); CSHL et Northwell Health; la Fondation de la famille Thompson; Nager à travers l’Amérique; et une subvention de la Fondation Simons à CSHL. M.S. a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) et le National Cancer Institute du NIH sous le numéro d’attribution 1F30CA253993-01. L.M. est soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation James S. McDonnell. J.M.A. est récipiendaire d’une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le cancer et Irvington (Prix CRI no 3435). D.A.T. est soutenu par le Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research et la Thompson Family Foundation. Les dessins animés ont été créés avec Biorender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape3M70200770819
Suture en soie 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon  ;N267H
ACTB-ECFP sourisJackson Laboratory22974
Kit de substrat AEC, peroxydase (HRP), (3-amino-9-éthylcarbazole)Vector Laboratories  ;SK-4200
Tampons imbibés d’alcoolBD  ;
Système d’anesthésieMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge logiciels et capteurs  ;BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Bétadine en spray  ;LORIS109-08
souris c-fms-EGFP (MacGreen)Jackson Laboratory18549
souris C57BL/6JLaboratory664
CD45 Anticorps monoclonal (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AnticorpsAbcamab125212
Éponges de gaze Curity  ;Âne Covidien
Anti-Chèvre IgG H& L (HRP)  ;Abcamab6885
Âne Anti-Lapin IgG H& L (HRP)  ;Abcamab97064
Âne Anti-Rat IgG H& L (HRP)  ;Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Microscopie électronique transparenteSciences24236-10deux parties, rapport de mélange 10:1
, diamètre 8 mm, épaisseur #1.5  ;Microscopie électronique Sciences72296-08
Ender-3 Pro Imprimante 3DShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Couverture chauffante infrarouge lointaineKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji emballagede traitement d’imagerie https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0,04µ ; m, jaune-vert (505/515)InvitrogenF8795
Système de gating :BIOPAC Systems Inc.Ensemble, les composants permettent de surveiller les signes vitaux de la souris pendant l’imagerie et de contrôler l’acquisition d’images lors de la respiration de la souris. Tous ont été acquis auprès des systèmes BIOPAC.
Acqknowledge software  ;ACK100W, module ACK100M
. différentiel, série C  ;DA100C
Système de déclenchement double petit animalDTU200  ;
MP160 pour Windows - Systèmed’analyse MP160WSW  ;
MouseOx Plus 120V  ;MOX-120V ; 015000  ;
Coussin de pression  ;TSD110  ;
GelfoamPfizer 9031508Éponge à gélatine résorbable
Ciseaux fins durcisOutils scientifiques fins14090-11Deux paires ; acier inoxydable, pointes tranchantes
, pointe droite, tranchant de 26 mm
, longueur 11 cm
Myéloperoxydase/souris Anticorps MPOR& D SystemsAF3667
Stérilisateur à billes chaudesOutils de science fine18000-45Allumer environ 30 min
avant utilisation ; stériliser les outils à >200
° ; C pour 30 s
Imaris  ;Bitplanewww.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000  ;
Seringues à insuline avec aiguille ultra-fine BD 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurane (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectine (LEL, TL), DyLight® ; 594Vector Laboratories  ;DL-1177-1
LysM-eGFPsouris www.mmrrc.org012039-MU
Micro pince à dissectionRobozRS-5135Dentelée, légère courbure, largeur de pointe de 0,8 mm ; longueur 4
Micro pince à dissectionRobozRS-51531 x 2 dents, légère courbure, largeur < > de pointe, longueur 4 »
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsMachine d’essai de matériaux servohydrauliques
Neutrophile Elastase 680 FAST sondePerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
OxygenGeneral Welding Supply Corp.
Filament d’acide polylactiqueHatchbox1,75 mm de diamètre
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube pommade ophtalmiqueDechra  ;NDC17033-211-38
Reflex 7 clips de plaieRoboz SurgicalRS-9255
Grille en acier inoxydableFotofabUne grille a un diamètre de 0,200 pouce, avec un total de 52 carrés de grille individuels de 0,016 x 0,016 pouce. Il y a 0,003 pouce d’espace entre chaque carré.   ;
Plaques de culture tissulaire stériles traitées en surfaceFisher ScientificFB012929Couvercle utilisé comme surface de durcissement pour les fenêtres d’imagerie
Microscope multiphotonique TriM Scope  ;L’imagerie LaVision BioTeca été réalisée sur un microscope droit à 2 photons (Trimscope, LaVision BioTec) équipé de deux lasers Ti :Sapphire (Mai Tai et InSight, Spectra-Physics) et d’un oscillateur paramétrique optique. Les séparateurs de faisceaux dichroïques passe-longs suivants (Chroma) ont été utilisés pour diriger le signal vers quatre tubes photomultipleurs :
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro cover glassVWR48404-453
326895 Jackson Verre à couverture ronde en amp »

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

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Microscopie intravitalefen tre d imagerie en siliconeimagerie longitudinalefen tre en polydim thylsiloxaneimagerie de la glande mammaireimagerie des organes abdominauxsuivi des cellules immunitairesimagerie des cellules canc reusesinsertion de fen tre chirurgicalevisualisation tissulaire

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