Summary
שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.
Abstract
מדידות של תגובות אור עצביות ברשתית הן קריטיות לחקר הפיזיולוגיה של הרשתית הבריאה, לקביעת שינויים פתולוגיים במחלות רשתית ולבדיקת התערבויות טיפוליות. האלקטרורטינוגרמה ex vivo (ERG) מאפשרת כימות של תרומות מסוגי תאים בודדים ברשתית המבודדת על ידי הוספת חומרים פרמקולוגיים ספציפיים והערכה של שינויים פנימיים ברקמה ללא תלות בהשפעות מערכתיות. ניתן למדוד את תגובות אור הרשתית באמצעות מחזיק דגימת ex vivo ERG מיוחד ומערך הקלטה, ששונה מציוד קיים של מהדק טלאי או מערך מיקרואלקטרודה. במיוחד, המחקר של תאים דו-קוטביים על-קוטביים, אך גם של פוטורצפטורים, נפגע על ידי הירידה האיטית אך המתקדמת של תגובות האור ב-ex vivo ERG לאורך זמן. מהירות זלוף מוגברת והתאמת טמפרטורת ההפרשה משפרים את תפקוד הרשתית ex vivo וממקסמים את משרעת התגובה והיציבות. ה- ex vivo ERG מאפשר באופן ייחודי לחקור סוגי תאים עצביים ברשתית בודדים. בנוסף, שיפורים למקסום אמפליטודות התגובה והיציבות מאפשרים לחקור תגובות אור בדגימות רשתית מבעלי חיים גדולים, כמו גם מעיני תורמים אנושיים, מה שהופך את ה- ex vivo ERG לתוספת רבת ערך לרפרטואר הטכניקות המשמשות לחקר תפקוד הרשתית.
Introduction
אלקטרורטינוגרפיה מודדת את תפקוד הרשתית בתגובה לאור1. הוא חלק בלתי נפרד מלימוד הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הרשתית, ומדידת ההצלחה של טיפולים במחלות רשתית. ה- in vivo ERG נמצא בשימוש נרחב להערכת תפקוד הרשתית באורגניזמים שלמים, אך יש לו מגבלות משמעותיות 2,3. בין אלה, הניתוח הכמותי של סוגי תאי רשתית בודדים ב- in vivo ERG נפגע, שכן הוא רושם את סכום השינויים הפוטנציאליים, ולכן תגובות כיסוי, מכל תאי הרשתית לגירויים קלים4. יתר על כן, הוא אינו מאפשר בקלות תוספת של תרופות לרשתית, הוא פגיע להשפעות סיסטמיות, ויש לו יחס אות לרעש נמוך יחסית. חסרונות אלה מתבטלים ב- ex vivo ERG החוקר את תפקוד הרשתית המבודדת 2,3,5,6. ה- ex vivo ERG מאפשר הקלטה של תגובות גדולות ויציבות מסוגי תאי רשתית ספציפיים על ידי הוספת מעכבים פרמקולוגיים והערכה קלה של חומרים טיפוליים, אשר ניתן להוסיף לסופרפוזט. יחד עם זאת, הוא מסיר השפעות של השפעות מערכתיות ומבטל רעש פיזיולוגי (למשל, פעימות לב או נשימה).
ב- ex vivo ERG, רשתיות או דגימות רשתית מבודדות ומותקנות בצד הפוטורצפטור למעלה על הכיפה של מחזיק הדגימה 3,5. מחזיק הדגימה מורכב, מחובר למערכת זלוף המספקת לרשתית מדיה מחוממת ומחומצנת, ומונח על במת מיקרוסקופ, אשר שונה כדי לספק גירויי אור מבוקרי מחשב. כדי לתעד את התגובות שמעוררות האור, מחזיק הדגימה מחובר למגבר, לדיגיטייזר ולמערכת הקלטה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת בידוד של תגובות מפוטורצפטורים של מוטות וחרוטים, תאי ON-bipolar ו-Müller glia על ידי שינוי הפרמטרים של גירויי האור והוספת חומרים פרמקולוגיים.
ניתן להמיר מהדק תיקון קיים או מערך רב-אלקטרודות (MEA) להקלטת ex vivo ERG, בשילוב עם מתאם ex vivo ERG זמין מסחרית או מחזיק דגימה מותאם אישית במכונה של מחשב פוליקרבונט (CNC), כדי למדוד את תגובות האור ברשתיות ממודלים של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים. שינוי זה מגדיל את הנגישות של ex vivo ERG תוך מזעור הצורך בציוד מיוחד. העיצוב של מחזיק הדגימה מפשט את טכניקת ההרכבה ומשלב אלקטרודות, ומבטל את הצורך במניפולציה של מיקרואלקטרודות בהשוואהלשיטות ex vivo ERG שדווחו בעבר 7. קצב הזלוף והטמפרטורה בתוך בעל הדגימה הם גורמים חשובים המשפיעים על תכונות התגובה של פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar. על ידי התאמת תנאים אלה, ניתן להקליט את ה- ex vivo ERG באופן אמין מרשתית העכבר המבודדת לאורך פרקי זמן ממושכים. תנאי ניסוי ממוטבים מאפשרים הקלטות ex vivo ERG באגרופים ברשתית מרשתיות גדולות יותר, כולל עיניים גדולות של בעלי חיים ועיניים של תורמים אנושיים8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית למחקרים בבעלי חיים באוניברסיטת יוטה. עיני חזיר להדגמת הסרטון הזה הושגו לאחר המוות מבית המטבחיים (משאבי חזירים בני קיימא, ג'ונסוןוויל). העיניים התקבלו מתורמים אנושיים לאחר מוות מוחי או לבבי בהסכמה לשימוש מחקרי באמצעות בנק העיניים של יוטה ליונס, בנק העיניים של סן דייגו או Lifesharing, אשר הוסמכו באופן מלא על ידי ה- FDA, איגוד ארגוני רכש האיברים (AOPO) ואיגוד בנקי העיניים של אמריקה. לשימוש בעיניים של תורמים אנושיים היה מעמד פטור באוניברסיטת יוטה (IRB מס' 00106658) וב-ScrippsHealth IRB (IRB מס' 16-6781).
1. הגדרת ה- ex vivo ERG
- כדי להמיר מערך רב-אלקטרודות, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות שלב ראש למגבר דיפרנציאלי, המחובר לכניסה האנלוגית של לוח הממשק של מערכת מערך הרב-אלקטרודות. השתמש בתוכנת ההקלטה עבור מערך multielectrode כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והוסף הגברה נוספת של 10x מתח בהתאם למפרט הדיגיטייזר. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ.
- כדי להמיר מערך מהדק טלאי, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות שלב ראש למגבר דיפרנציאלי, המחובר לשלב הראש של מגבר מהדק התיקון. השתמש בתוכנת מערכת מהדק התיקון וב- digitizer כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והפעל הגברה נוספת של 10x מתח באמצעות שלב ראש מהדק התיקון. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ.
- חבר נורות LED עם אורכי הגל המתאימים (למשל, כ-530 ננומטר כדי לעורר תגובות של תאי מוט פוטורצפטור ותאי ON-bipolar) למיקרוסקופ. שלוט בנורות ה- LED באמצעות תוכנת הקלטה המאפשרת הפעלה של גירויים קלים. כדי לשלוט בגירויים של אור, השתמש בדרייבר LED הנשלט על-ידי יציאות אנלוגיות מדיגיטייזר.
- כייל את תפוקת האור של נוריות ה-LED במיקום הרשתית במחזיק הדגימה באמצעות פוטודיודה. במידת הצורך, הכנס מסנני צפיפות ניטרליים לנתיב האור כדי לעמעם את עוצמת האור.
- השתמש במחזיק דגימת ex vivo ERG זמין מסחרית או מותאם אישית.
הערה: שרטוטים לעיבוד CNC מפוליקרבונט ניתן לקבל מהמחברים על פי בקשה. - כדי להכין את האלקטרודה, הכנס אלקטרודת גלולת Ag/AgCl למחבר לואר מושחל. מלא את החלק הפנימי של מחבר הלואר בדבק חם והכנס שקע של 2 מ"מ לתוך הדבק החם מהצד שאינו מושחל. הלחמה חוט כסף של אלקטרודת EP1 לשקע 2 מ"מ. הברג את האלקטרודה המוגמרת, עם טבעת o על החוט, לתוך יציאות האלקטרודה של מחזיק הדגימה ex vivo ERG.
הערה: ניתן להשתמש באלקטרודות במשך זמן רב. אם משטח הכדור צובר לכלוך ו/או מחשיך (הדבר עלול לגרום למתח היסט גבוה ו/או לסחיפה חשמלית), ניתן "ללטש" אותו באמצעות נייר זכוכית עדין. - לפחות יום אחד לפני הניסוי, הדבק ניירות סינון על הכיפות של מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות דבק אפוקסי, כדי להבטיח שהדבק לא יחסם את תעלת האלקטרודה (ראה 3 לווידאו).
2. הכנת בעלי חיים
- חשוכים מסתגלים לבעלי חיים למשך 6 שעות לפחות או למשך הלילה.
3. הכנת ציוד
- מלאו את קו ההזלפה של ה-ex vivo ERG במדיום של איימס עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן. חבר את קו הזלוף לגוף חימום עם מקור זרם DC או בקר חום ליד מחזיק הדגימה כדי לחמם את המדיום של איימס, כך שהרשתית נשמרת בערך 35-38 מעלות צלזיוס.
- מלא את שני החצאים של מחזיק הדגימה ex vivo ERG בתמיסת אלקטרודות, אטם את קו ההזלפה עם פקקי luer, חבר את האלקטרודות והרכיב את מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים (ראה 3 לווידאו).
- בדוק את מתח ההתנגדות וההיסט בין האלקטרודות במחזיק הדגימה המורכב על ידי הכנסת הגששים של המולטימטר לאלקטרודות.
הערה: אם אין חסימות, והאלקטרודות במצב טוב, ההתנגדות צריכה להיות מתחת ל-100 kΩ ומתח הקיזוז מתחת ל-5 mV. - חברו את מחזיק הדגימה המורכב לקו הזלוף והניחו על הבמה של מיקרוסקופ שהוקם כדי לספק הבזקי אור. ודא כי מחזיק הדגימה וקו הזלוף אינם מכילים בועות אוויר.
4. הכנת רקמות
- להקריב את החיה עם CO2 ומיד לעטוף את העיניים, או להשיג עיניים גדולות של בעל חיים או אדם תורם.
- נקו את הגלובוס של רקמת החיבור הנותרת והשרירים החוץ-עיניים. לחתוך את עצב הראייה.
- על נייר סינון, בזהירות למקם חתך קטן עם סכין גילוח לאורך אורה serrata, כ 1 מ"מ מן הלימבוס בעין העכבר. מכניסים מספריים עדינים של ואנה לתוך החתך וחותכים לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה.
- העבירו את העיניים לצלחת המכילה את המדיום של איימס. תפסו את הסקלרה עם מלקחיים עדינים, תוך הקפדה שלא לגעת ברשתית. מכניסים מספריים של ואנה בין הרשתית לסקלרה וחותכים את הסקלרה מהחלק ההיקפי לכיוון החלק המרכזי. יש להיזהר שלא לגעת או לפגוע ברשתית.
- לשתק את הסקלרה על ידי החזקת צד אחד של החתך עם מספריים vannas על החלק התחתון של צלחת דיסקציה. תפסו את הסקלרה עם מלקחיים בצד השני של החתך. הסר את הסקלרה מבלי לגעת או לפגוע ברשתית על ידי פירוק הסקלרה משני צדי החתך כדי לאפשר בידוד של הרשתית עם נזק מינימלי לרקמה.
- הסר את המקטע הקדמי עם העדשה מהעין העמיתה ואחסן את העין בטמפרטורת החדר בתמיסה של איימס המבעבעת ב-5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן.
הערה: ניתן לקבל תגובות אור פונקציונליות מעיניים המאוחסנות בדרך זו במשך מספר שעות. - בעיניים גדולות, כולל עיני תורם אנושיות, נקו את הגלובוס של רקמת החיבור שנותרה והסירו את המקטע הקדמי ואת העדשה, בדומה להליך המתואר לעין העכבר. השתמש באזמל כדי לבצע חתך כ 3 מ"מ מן הלימבוס. הכנס מספריים דיסקציה מעוקלים לתוך החתך לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה. השג דגימות רשתית עבור אלקטרורטינוגרפיה ex vivo עם אגרוף ביופסיה חד פעמית 3-6 מ"מ.
5. הרכבת הרקמה על מחזיק הדגימה
- הכניסו את החצי התחתון של מחזיק הדגימה לתוך צלחת פטרי גדולה ומלאו במדיום של איימס מחומצן, כך שהכיפה של מחזיק הדגימה פשוט שקועה.
- תופסים בזהירות את קצה הרשתית עם מלקחיים עדינים ומעבירים את הרשתית על הכיפה של מחזיק הדגימה ex vivo , צד הפוטורצפטור פונה כלפי מעלה.
- הרם את מחזיק הדגימה מהפתרון של איימס, ודאג שהרשתית תישאר במקומה.
- ייבש לחלוטין את הצלחת של מחזיק הדגימה כדי למזער רעשים, crosstalk חשמלי, ו shunting אותות.
- הרכיבו את שני חצאי מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים וחברו את קו הזליפה. יבשו את האלקטרודה בחצי התחתון של מחזיק הדגימה וחברו את כבל האנודה לצד הרשתית הפנימית ואת כבל הקתודה לצד הפוטורצפטור.
- יש למזג את מחזיק הדגימה עם לפחות 1 מ"ל/דקה של מדיום איימס מחומצן למשך 10-20 דקות כדי לאפשר זמן לתגובות האור להתייצב.
6. רישום תפקוד תאי עצב ברשתית
- תעדו משפחות תגובה על ידי חשיפת הרשתית להבזקי אור בעוצמה הולכת וגוברת. לדוגמה, לתעד משפחות תגובות של מוטות עכבר עם עוצמות אור הנעות בין כ-10 ל-1,000 פוטונים/מיקרומטר 2 ומשפחות מתאי ON-bipolar של עכברים עם עוצמות אור הנעות בין כ-0.6 ל-20 פוטונים/מיקרומטר2.
- מדוד תגובות אור פוטורצפטור (a-wave) בנוכחות בריום כלוריד של 100 μM, שחוסם תעלות אשלגן בתאי גליה של מולר, ו-40 μM DL-AP4, שחוסם העברת אותות גלוטמטרגיים לתאי ON-דו-קוטביים (איור 2B).
- כדי לבודד את גל ה-b, שמקורו בתפקוד של תאי ON-דו-קוטביים, תחילה תיעדו תגובות אור משולבות הן מתאי פוטורצפטור והן מתאי ON-דו-קוטביים בנוכחות בריום כלוריד בלבד (איור 2A). לאחר מכן, יש לחדור במשך 5-10 דקות עם המדיום של איימס המכיל בריום כלוריד, כמו גם DL-AP4, ולהקליט תגובות פוטורצפטור לאותם גירויי אור כמו קודם (איור 2B). הפחת תגובות פוטורצפטור מתגובות משולבות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-דו-קוטביים, ובכך חישב את תגובות האור של תאי ON-דו-קוטביות בלבד (איור 2C).
7. אופטימיזציה של תפקוד התא הדו-קוטבי
הערה: גל b, שמקורו בתאים הדו-קוטביים ON, רגיש מאוד לטמפרטורה במחזיק הדגימה ולקצב הזליפה.
- שמרו על קצב זלוף של לפחות 0.5 מ"ל/דקה כדי לקבל את גל ה-b.
הערה: קצב זלוף גבוה יותר של 1-2 מ"ל/דקה עדיף כדי לשמור על תגובה גדולה ויציבה של תאים דו-קוטביים ON. - ודא כי עבור קצב זלוף נתון, הטמפרטורה במחזיק הדגימה ליד הרשתית קרובה לטמפרטורת הגוף (כלומר, בערך 35-38 מעלות צלזיוס).
הערה: חשוב להתאים את הטמפרטורה של הבשתן, המחומם לפני שהוא מגיע למחזיק דגימת ex vivo ERG, כך שהוא נמצא בטווח הטמפרטורות האופטימלי ברשתית. - יש לאחסן את כוסות העיניים לניסויים מאוחרים יותר מוגנות מפני אור ובמדיום מחומצן של איימס בטמפרטורת החדר כדי לשמור על גלי A ו-B תקינים למשך מספר שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אקס ויוו ERG מאפשר הקלטה של תגובות אור פוטורצפטור ותאים דו-קוטביים הניתנים לשחזור ויציבות, לדוגמה, מרשתית העכבר (איור 2A-C). הקלטה של תגובות פוטורצפטור מרשתיות של תורמים אנושיים אפשרית עם עיכוב של עד 5 שעות לאחר המוות של אנוקלציה (איור 2D) ושל תגובות תאים דו-קוטביים ON עם עיכוב של <20 דקות באנוקלציה (איור 2E). פרמטרים חשובים לקבלת תגובות גדולות כוללים טכניקת דיסקציה זהירה, קצב זלוף גבוה וטמפרטורת זלוף קרובה לערכים פיזיולוגיים (35-38 מעלות צלזיוס ברשתית היונקים). בתנאים האלה, אמפליטודות התגובה והקינטיקה בשני סוגי התאים היו יציבות יחסית לאורך זמן, אך ירדו באיטיות כ-40-45 דקות לאחר שהרשתיות הותקנו על מחזיק הדגימה (איור 3).
בהשוואה לפוטורצפטורים, תפקוד התאים הדו-קוטביים מופרע בקלות רבה יותר, למשל, על ידי נזק לרשתית במהלך דיסקציה והרכבה או על ידי ירידה בטמפרטורה ו/או במהירות הזליגה. בעוד שהטמפרטורה המופחתת במחזיק הדגימה האטה מאוד את הקינטיקה של שני הפוטורצפטורים ושל תאי ON-bipolar, היא הפחיתה את המשרעת של גל b אך לא את גל ה-a (איור 4A). לעומת זאת, האטת קצב הזלוף מ-2.1 מ"ל/דקה ל-0.6 מ"ל/דקה הפחיתה את המשרעת של תגובות תאי פוטורצפטור ותאי ON-דו-קוטביים, אך לא השפיעה על הזמן המרומז (הזמן מתחילת הגירוי ועד לשיא התגובה) של גל ה-a או ה-b (איור 4B). הפסקת הזלוף למשך 10 דקות ולאחריה רפרפוזיה גרמה לאובדן מוחלט של תפקוד התאים הדו-קוטביים עם תגובות פוטורצפטור משומרות (איור 5).
איור 1: מחזיק דגימת אלקטרורטינוגרמה Ex vivo ומערך הקלטה . (A,B) מחזיק הדגימה ex vivo ERG מורכב מכיפה להרכבת הרשתית המבודדת, המחוברת לקו זלוף כדי לספק באופן רציף את המדיום של איימס. אלקטרודות מחוברות דרך תעלות צרות הן לצד הפוטורצפטור של הרשתית דרך קו הזלוף והן לרשתית הפנימית דרך נייר הסינון המודבק לכיפה. אלקטרודות אלה מחוברות למגבר דיפרנציאלי, המאפשר מדידה של הבדלים פוטנציאליים ברשתית בתגובה לגירויי אור. (C) מחזיק הדגימה מונח על הבמה של מיקרוסקופ, אשר שונה כדי לספק הבזקי אור ומחובר לקו הזליפה, אשר מספק את המדיום של איימס מחומם ומחומצן על ידי כוח הכבידה. מערך ההקלטה כולו מוגן על ידי כלוב פאראדיי כדי למזער רעשים חשמליים. נתון זה שונה מ-9. קיצור: ERG = אלקטרורטינוגרמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: עקבות לדוגמה של תגובות פוטורצפטור ex vivo ותגובות תאים דו-קוטביים ON. תוספת של סוכנים פרמקולוגיים לפרפוזט מאפשרת כימות של תרומות מסוגי תאי רשתית בודדים לאלקטרורטינוגרמה ex vivo. תגובות אור פוטורצפטור (PR) מבודדות בנוכחות 100 μM בריום כלוריד (BaCl2), חוסם של תעלות K+ המבוטאות על ידי תאי גליה של מולר, כמו גם 40 μM DL-AP4, חוסם קולטן גלוטמט, המעכב העברת אותות מפוטורצפטורים לתאים דו-קוטביים (B). פונקציית תא און-דו-קוטבי (ON-BPC) (C) נקבעת על-ידי חיסור מרכיב הפוטורצפטור (B) מתגובת התא המשולב של הפוטורצפטור ו-ON-דו-קוטבי בנוכחות בריום כלוריד בלבד (A). ניתן לקבל תגובות אור פוטורצפטורים מרשתיות של תורמים אנושיים עם עיכוב מוות עד הרחקה של <5 שעות (D), בעוד שרשתיות המובלות תוך 20 דקות מהמוות לעיתים קרובות נותנות גם תגובות של תאים דו-קוטביים (E) (ראו 8 למידע נוסף). איור 2A-C שונה מ-9. קיצורים: יחסי ציבור = פוטורצפטור; ON-BPC = תא דו-קוטבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: יציבות תפקוד התא הפוטורצפטור וה-ON-דו-קוטבי באלקטרורטינוגרמה ex vivo לאורך זמן . (A) תגובות אור תועדו בכל דקה מפוטורצפטורים בלבד בנוכחות 100 μM בריום כלוריד ו-40 μM DL-AP4. (B) הבזקי אור עמומים בנוכחות בריום כלוריד של 100 μM בלבד נשלטים במידה רבה על ידי תפקוד תאי ON-bipolar, למרות שהם מכילים מרכיב פוטורצפטור קטן. תגובות האור של הרשתיות המבודדות מתייצבות בדרך כלל לאחר חדירת מחזיק דגימת ex vivo במשך 15-20 דקות, והיו יציבות לפחות 20-25 דקות לפני שהחלו לרדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תגובות משולבות של תאי פוטורצפטור ותאי ON-דו-קוטביים בטמפרטורות שונות ובמהירויות זלוף שונות . (A) הורדת הטמפרטורה בתוך מחזיק הדגימה מ-37 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר האטה מאוד את הקינטיקה של הפוטורצפטור וה-ON-דו-קוטבי, אך הפחיתה רק את משרעת התאים הדו-קוטביים ON בתגובת התא המעורבת וה-ON-דו-קוטבית. (B) הפחתת קצב הזליפה מ-2.1 מ"ל/דקה ל-0.6 מ"ל/דקה הביאה לירידה בפוטורצפטור ובאמפליטודות של תאים דו-קוטביים ON, אך ללא שינוי בקינטיקה של התגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תגובות תאי ON-bipolar רגישות יותר להפסקת הזליפה . (A) תגובות גדולות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-polar תועדו לאחר זלוף עם 2.1 מ"ל/דקה למשך 20 דקות. (B) לאחר הפסקת הזלוף למשך 10 דקות ולאחר מכן רפרפוזיה למשך 10 דקות במהירות של 2.1 מ"ל/דקה, תגובות הפוטורצפטור היו קיימות, בעוד שתגובות התאים הדו-קוטביים של ON אבדו לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוא פותח במקור בשנת 1865 על ידי הולמגרן כדי למדוד את תגובות האור ברשתית מהרשתיתהדו-חיים 10, אך אילוצים טכניים מנעו בתחילה שימוש נרחב ב-ERG. אף על פי כן, מחקרים ראשוניים של Ragnar Granit ואחרים זיהו את המקורות התאיים של ה-ERG ומדדו תגובות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar exvivo 11,12,13. מאז, שיטות מעודנות אפשרו שימוש נרחב יותר בהקלטות ex vivo ERG 14,15, אם כי אמפליטודות התגובה, במיוחד אלה של תאים דו-קוטביים ON, נותרו קטנות יחסית 16. כדי להתגבר על מגבלות אלה, תפקוד הרשתית נמדד כיום בדרך כלל יותר עם in vivo ERG, למרות אילוצים ניסיוניים ופרשנות מסובכת יותר של צורות הגל המוקלטות. למרות שה- ex vivo ERG מנסה לשכפל מצבים פיזיולוגיים קרוב ככל האפשר, הוא בכל זאת מודד את תפקוד הרשתית בסביבה מלאכותית ובהיעדר גורמים מערכתיים ושינויים פתולוגיים. עם זאת, בשילוב עם in vivo ERG, מגבלה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות חשובות, כגון האם שינויים בתפקוד הרשתית במחלה הם מהותיים לתאי הרשתית או נגרמים על ידי שינויים מערכתיים17.
לאחרונה, מחזיקי דגימות ex vivo ERG שעוצבו לאחרונה פישטו את המתודולוגיה, והפכו את ה- ex vivo ERG לנגיש לקהילת מחקר רחבה יותר 2,3,5,18. שינויים בציוד הקיים של מהדק טלאים או מערך רב-אלקטרודות המתוארים בפרוטוקול זה יאפשרו למעבדות רבות יותר לבצע ex vivo ERG עם מינימום השקעות כספיות ודרישות שטח. בפרט, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית ex vivo ERG הגבירו את התגובה של רשתיות מבודדות של יונקים והביאו ליחס אות לרעש מעולה, שנותר טוב למרות שלבי הגברה נוספים המתוארים בפרוטוקול זה. אף על פי כן, הירידה בתגובות האור, בעיקר מתאים און-דו-קוטביים19, פגעה אולי בשימוש הנרחב יותר ב-ex vivo ERG. השימוש בתווך של איימס או לוק גורם לתגובות גדולות יותר של תאי פוטורצפטור ותאי ON-polar, מה שהופך אותם לעדיפים, למשל, על פני פתרון רינגר עם מאגר HEPES עבור ex vivo ERG3. מעבדות אחרות ייצבו את תפקוד התא הדו-קוטבי ex vivo ON-polar על ידי נטילת תוסף עם גלוטמין או גלוטמט19. דו"ח זה מדגים כיצד להשיג תגובות אור גדולות ויציבות מרשתיות מבודדות, כולל מעיני תורמים אנושיים, כפי שדווח בעבר8.
פרמטרים ניסיוניים חשובים כוללים את הטמפרטורה של הרשתית, אשר צריך להישמר בטווח הפיזיולוגי, וקצב זלוף מהיר. ההשפעות הבולטות ביותר של הורדת הטמפרטורה במחזיק הדגימה ex vivo ERG הן קינטיקה של תגובה איטית יותר הן בפוטורצפטורים והן בתאי ON-bipolar ומשרעת תאים ON-bipolar מוחלשת. אף על פי שנראה כי להורדת הטמפרטורה יש השפעה מועטה על משרעת הפוטורצפטור בתגובה המשולבת של פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar, ייתכן שמדובר בממצא הנובע משינויים דיפרנציאליים בקינטיקה של התגובה משני סוגי התאים.
נראה כי קצב זלוף מספק הוא קריטי במיוחד לתפקוד הרשתית, ככל הנראה כדי לספק חמצן וחומרים מזינים ולסלק מוצרי פסולת. בעוד שגם משרעת התאים הפוטורצפטורים וגם משרעת התאים הדו-קוטביים פוחתים במקצת על ידי הפחתה מתונה בקצב הזליפה, אפילו הפסקה קצרה של הזלוף ביטלה את תפקוד ה-ON-bipolar אך לא את פונקציית הפוטורצפטור. משמעות הדבר היא שתגובות הפוטורצפטור חזקות יותר ועשויות להישמר ביתר קלות בעיניים שעוברות ניסויים עם עיכוב משמעותי, כגון עיני תורם אנושיות8. בהקשר זה, ראוי לציין כי תפקוד התא הדו-קוטבי אינו פוחת על ידי אחסון כוסות עיניים במדיום המחומצן של איימס למשך מספר שעות. לפיכך, אנו משערים כי אובדן תפקוד התא הדו-קוטבי כאשר הזליפה במחזיק הדגימה ex vivo מופסקת עשוי לנבוע מדלדול מהיר של חמצן וחומרים מזינים אחרים בנפח הקטן המקיף את הרשתית במחזיק הדגימה. זה נתמך על ידי דיווחים כי עיכוב קצר ממוות לאנוקלציה הוא קריטי לתיעוד תגובות פוטורצפטור ובמיוחד דו-קוטביות של רשתיות אנושיות, וכי היפוקסיה לאחר המוות היא המועמדת הסבירה ביותר לנזק בלתי הפיך לתפקוד העצבי ברשתית8. בעוד שפרמטרים ניסיוניים עבור ex vivo ERG עברו אופטימיזציה ברשתית העכבר, הם בכל זאת שיפרו בהצלחה את תנאי ההקלטה של דגימות רשתית מבעלי חיים גדולים ועיני תורמים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לעיניים EY02665 ו- EY031706 והקרן הבינלאומית לחקר הרשתית לד"ר וינברג, מענק הליבה של המכונים הלאומיים לבריאות (EY014800), ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק, למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה, אוניברסיטת יוטה. ד"ר פרנס וינברג זכה גם בפרס מחקר למניעת עיוורון / פרס פיתוח הקריירה החופשית של ד"ר ה. ג'יימס וקרול, וד"ר סילקה בקר ממענק ARVO EyeFind. אנו מודים לד"ר אן הנקן ממכון המחקר סקריפס על כך שסיפקה את עין התורם המשמשת להקלטות המוצגות באיור 2E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
