Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système ^immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8. Bien que la plupart des cellules des expectorations soient d’origine hématopoïétique9,10,11, la cytométrie en flux n’a pas été largement appliquée à l’analyse des expectorations à des fins diagnostiques. Cependant, plusieurs études suggèrent que l’évaluation des populations de cellules immunitaires dans les expectorations (le sous-ensemble de cellules le plus important) peut être d’une grande aide dans le diagnostic et / ou la surveillance de maladies telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)^12,13,14,15. De plus, l’existence de marqueurs épithéliaux spécifiques qui peuvent être utilisés en cytométrie en flux permet l’interrogation du sous-ensemble de cellules le plus important suivant dans les expectorations, les cellules épithéliales pulmonaires.

En plus de la capacité d’analyser de nombreuses populations cellulaires distinctes d’origines tissulaires différentes, un cytomètre en flux peut évaluer un grand nombre de cellules dans une période relativement courte. En comparaison, les types d’analyses cytologiques à base de lames nécessitent souvent du personnel et/ou de l’équipement hautement spécialisés. Ces analyses peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre, ce qui conduit à l’analyse d’une partie seulement de l’échantillon d’expectorations16.

Trois problèmes critiques limitent l’utilisation généralisée des expectorations en cytométrie en flux. La première question concerne la collecte des expectorations. Les expectorations sont recueillies par une toux qui expulse le mucus des poumons dans la cavité buccale, puis crache dans une tasse de collecte. Étant donné que le mucus se déplace à travers la cavité buccale, il y a un risque élevé de contamination par la SEC. Cette contamination complique l’analyse de l’échantillon, mais le problème est facilement rectifié sur une plate-forme cytométrique en flux, comme le montre cette étude.

Tout le monde ne peut pas produire des expectorations spontanément; par conséquent, plusieurs dispositifs ont été mis au point pour faciliter la collecte des expectorations de manière non ^invasive17. Le nébuliseur est l’un de ces dispositifs et il a été démontré qu’il produisait des échantillons d’expectorations fiables18,19,20. Bien que le nébuliseur soit un moyen très efficace de collecter les expectorations de manière non invasive, son utilisation nécessite toujours un réglage dans un établissement médical avec du personnel ^{spécialisé21}. En revanche, les appareils portatifs tels que la flûte ^{pulmonaire22,23,24} et l’acapella16,25 peuvent être utilisés à la maison car ils sont très conviviaux. Ces dispositifs d’assistance sont à la fois sûrs et rentables.

Pour nous, l’acapella a toujours donné de meilleurs résultats que la flûte ^pulmonaire16, et par conséquent, le dispositif acapella a été choisi pour les collections d’expectorations. Un échantillon de prélèvement de 3 jours a été décidé parce que le but principal de l’utilisation des expectorations est de développer un test de détection du cancer du ^poumon16. Il a été démontré qu’un échantillon de 3 jours augmente la probabilité de détection du cancer du poumon par rapport à un échantillon de 1 ou 2 jours26,27,28. Cependant, d’autres méthodes de collecte des expectorations peuvent être préférables à des fins différentes. Si une méthode de collecte des expectorations différente de celle décrite ici est utilisée, il est recommandé de titrer soigneusement chaque anticorps ou colorant utilisé pour l’analyse cytométrique en flux; très peu de données sont disponibles sur la façon dont les différentes méthodes de collecte des expectorations affectent les protéines ciblées pour la cytométrie en flux.

Le deuxième problème qui atténue l’enthousiasme pour l’utilisation des expectorations pour le diagnostic, principalement lié à la cytométrie en flux, est le nombre de cellules. Le problème est la collecte de suffisamment de cellules viables pour une analyse fiable. Deux études ont démontré que les échantillons d’expectorations prélevés par des méthodes non invasives, à l’aide d’un dispositif d’assistance, contiennent suffisamment de cellules viables pouvant être utilisées dans le diagnostic clinique ou les études de ^{recherche16,24}. Cependant, aucune de ces études n’a abordé la question du nombre de cellules concernant la cytométrie en flux.

Pour les études qui constituent la base de ce protocole, des échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des participants à risque élevé de développer un cancer du poumon conformément aux directives institutionnelles approuvées pour chaque site d’étude. Les participants à risque élevé ont été définis comme étant âgés de 55 à 75 ans, ayant fumé 30 paquets-années et n’ayant pas cessé de fumer au cours des 15 dernières années. On a montré aux patients comment utiliser le dispositif acapella conformément aux instructions du ^fabricant29 et ont recueilli des expectorations pendant trois jours consécutifs à la maison. L’échantillon a été conservé au réfrigérateur jusqu’à la dernière collecte. Le dernier jour du prélèvement, l’échantillon a été expédié au laboratoire pendant la nuit avec un compresse froid congelé. Les échantillons ont été transformés en une suspension à cellule unique le jour de leur réception. Avec cette méthode de collecte des expectorations, on obtient plus qu’assez de cellules viables pour une analyse cytométrique en flux fiable.

Enfin, et en relation avec le problème précédent du nombre de cellules, il y a la question de savoir comment libérer les cellules des expectorations de leur environnement mucineux. Comment les cellules peuvent-elles rester viables et créer une suspension cellulaire unique qui n’obstrue pas le cytomètre en flux? Basé sur les travaux initiaux de Pizzichini et ^al.30 et Miller et ^al.31, ce protocole décrit une méthode facile et fiable pour le traitement des expectorations en une suspension à cellule unique qui convient à l’analyse cytométrique en flux. Cette méthode a utilisé des lignes directrices bien établies en cytométrie en ^flux32,33,34 pour développer une stratégie efficace de marquage des anticorps afin d’identifier les cellules hématopoïétiques et épithéliales dans les expectorations et de fournir des paramètres d’instrument, des mesures de contrôle de la qualité et des lignes directrices d’analyse normalisant l’analyse des expectorations sur une plate-forme cytométrique en flux.

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations

1. Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation.
   ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément aux instructions du fabricant et congeler à -20 °C dans des aliquotes de 25 mL jusqu’à utilisation.
2. Approximer le poids de l’échantillon et décongeler suffisamment 0,1 % de dithiothréitol (TNT) pour l’étape 2.2 et l’amener à 37 °C. (Les aliquotes de TNT doivent être conservées à -20 °C avant utilisation.)
3. Apportez suffisamment de 0,5 % de N-acétyl-L-cystéine (NAC) jusqu’à 37 °C pour l’étape 2.2. (Le NAC doit être préparé frais chaque semaine et conservé à 4 °C avant utilisation.)

2. Dissociation des expectorations

1. Peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation.
   REMARQUE: Un échantillon est considéré comme petit si le poids initial est de ≤3 g, moyen s’il est >3 g mais ≤8 g, grand s’il >8 mais ≤16 g et extra-grand si un échantillon pèse >16 g. Les indications petite, moyenne, grande et extra-large seront utilisées tout au long du protocole. La quantité de réactifs nécessaires à la dissociation et au marquage diffère selon la taille de l’échantillon d’expectorations.
2. Transférer un petit échantillon dans un tube conique propre de 50 mL, un échantillon moyen dans une bouteille jetable en plastique propre de 250 mL ou un échantillon grand et extra-large dans une bouteille jetable en plastique propre de 500 mL. Ajouter 1 mL/g de poids d’échantillon de 0,5 % de NAC et 4 mL/g de poids d’échantillon de 0,1 % de TNT.
3. Vortex à vitesse maximale (pendant 15 s), puis roche à température ambiante (à vitesse maximale) pendant 15 min.
4. Diluer l’échantillon avec quatre volumes de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (en fonction du volume total de l’échantillon + réactifs) pour neutraliser le NAC et la TNT; vortex rapidement à vitesse maximale et roche à température ambiante pendant 5 min à vitesse maximale.
5. Filtrer la suspension cellulaire à travers une ou plusieurs crépines de cellules en maille de nylon de 100 μm dans un ou plusieurs tubes de centrifugeuse coniques de 50 mL pour créer une suspension à cellule unique.
6. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant, combiner toutes les pastilles dans un tube conique de 15 mL, puis laver les pastilles avec HBSS dans les mêmes conditions.
7. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations.
   REMARQUE : Un petit échantillon est remis en suspension dans 250 μL de HBSS. Un échantillon moyen est remis en suspension dans 760 μL de HBSS. Les échantillons de grande taille et de très grande taille sont remis en suspension dans 1460 μL de HBSS.
8. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire pour un comptage de cellules vivantes / mortes en utilisant Trypan Blue.
   REMARQUE: Pour un petit échantillon, utilisez 5 μL. Pour un échantillon moyen, grand ou extra-large, utilisez 10 μL. Diluer 1:10 avec HBSS.
   1. Mélanger 10 μL de dilution des expectorations avec 30 μL de 0,4 % de bleu de trypan pour obtenir une dilution finale de l’échantillon de 1:40. Chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un comptage cellulaire.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire d’ajuster la dilution finale si le nombre de cellules est trop faible ou trop élevé pour obtenir un nombre précis. Il est fortement recommandé de consulter Guiot et ^al.20 pour distinguer correctement les cellules d’expectorations des SEC et des débris. Ceci est essentiel pour un comptage précis des cellules.
9. De l’échantillon extra-large, retirez 50 x ¹⁰⁶ cellules du total et ajoutez-les à un nouveau tube avec suffisamment de HBSS ajouté pour créer un volume total de 1700 μL.
   REMARQUE : Considérez qu’il s’agit d’un échantillon volumineux pour le reste du protocole. Les échantillons restants peuvent être jetés ou utilisés à d’autres fins.

3. Coloration des anticorps et des colorants de viabilité

1. Choix de l’anticorps et du colorant
   NOTE : Le tableau 1 montre les anticorps et le colorant de viabilité utilisés dans ce protocole et les populations cellulaires qu’ils identifient.
   1. Étiqueter les tubes contenant les cellules d’expectorations (voir le tableau 2 pour les étiquettes).
   2. Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL (compatibles avec le cytomètre en flux utilisé) pour le tube d’échantillon avec les cellules non colorées et le tube avec le contrôle d’isotype. Utilisez des tubes coniques de 15 mL pour les échantillons de sang et de tubes épithéliaux.
      REMARQUE: Ces échantillons seront transférés dans des tubes de cytométrie en flux après la coloration et la fixation des anticorps.
2. Étiquetez les tubes de compensation (tableau 3).
   REMARQUE: Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL compatibles avec le cytomètre en flux utilisé.
3. Ajouter la quantité d’HBSS, d’anticorps et/ou de colorant à chacun des tubes cellulaires d’expectorations et des tubes de compensation comme indiqué dans les tableaux 2 et 3, respectivement.
   REMARQUE: Ajoutez un tampon (HBBS), des anticorps et un colorant à tous les tubes avant d’ajouter des cellules ou des perles de compensation pour vous assurer que le temps de coloration de tous les tubes est cohérent.
4. Ajouter les quantités de volume de cellules d’expectorations indiquées dans le tableau 2 aux tubes d’essai.
5. Ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme indiqué dans le tableau 3.
6. Incuber tous les tubes (tubes d’essai et de compensation) sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 35 min. Ensuite, remplissez les tubes avec du HBSS glacé et centrifugez à 4 °C pendant 10 min à 800 x g.
7. Pour les tubes de compensation, aspirez le surnageant aussi près que possible des pastilles et faites glisser les pastilles pour les desserrer.
8. Ajouter 0,5 mL de HBSS froid aux tubes de compensation, les stocker sur la glace à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’analyse par cytométrie en flux.
9. Aspirer le surnageant de l’isotype, du sang et des tubes épithéliaux non colorés après la centrifugation (étape 3.6 de la section de coloration des anticorps) et desserrer les pastilles en agitant les tubes.

4. Fixation avec 1% de paraformaldéhyde (PFA)

1. Ajouter du PFA froid de 1 % (qui devrait être décongelé maintenant) aux tubes non colorés, isotypes, sanguins et épithéliaux; 2 mL aux tubes non colorés et isotypes, et 10 mL aux tubes sanguins et épithéliaux.
2. Incuber les tubes sur de la glace, à l’abri de la lumière pendant 1 h. Vortex rapidement à vitesse maximale après 30 min.
3. Remplissez les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 10 min à 1600 x g.
4. Aspirer autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faire glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules.
5. Ajouter 200 μL de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes.
6. Calculer le volume d’HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.
   REMARQUE: Volume de remise en suspension = 0,15 x [nombre total de cellules (étape 8 de la dissociation des expectorations) / ¹⁰⁶]. Utilisez 50 x ¹⁰⁶ comme nombre de cellules pour un échantillon extra-large.
7. Conservez tous les tubes d’échantillonnage et de compensation, à l’abri de la lumière sur la glace à 4 °C jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux soit effectuée.
   REMARQUE: Ce protocole n’a pas été testé pour le stockage depuis plus de 24 heures.

5. Acquisition de données sur le cytomètre en flux

1. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé.
   REMARQUE: Cette section du protocole suppose que la personne qui utilise le cytomètre en flux est formée à l’utilisation de l’instrument à sa disposition, en particulier en ce qui concerne les procédures quotidiennes, y compris la vérification de la stabilité des systèmes optiques et fluidiques, les techniques de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que le calcul et l’application de la matrice de compensation correcte.
2. Utilisez le mélange de billes du National Institute of Standards and Technology (NIST) pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes NIST afin de couvrir toute la parcelle sans placer les perles trop près des axes.
   REMARQUE: Cette étape est cruciale pour s’assurer que les débris de moins de 5 μm peuvent être éliminés par une analyse post-acquisition de contrôle. Selon le cytomètre de flux utilisé, gardez à l’esprit que les plus petites billes ne sont pas exclues avec le seuil (lors de l’utilisation du LSR II ou du Lyric) ou avec le discriminateur élevé (en utilisant le cytomètre de flux Navios EX). Pour le Navios EX, un gain de 2 a été utilisé pour la diffusion avant et latérale, une tension de 236 pour la diffusion avant et de 250 pour la diffusion latérale. Pour le LSR II, une tension de diffusion directe de 165 et une tension de diffusion latérale de 190 ont été utilisées.
3. Réglez le débit sur moyen (LSR II) ou élevé (Navios EX).
   REMARQUE: Le débit moyen ou élevé de la plupart des instruments peut être utilisé pour acquérir les tubes d’expectorations. Il est important de noter que l’utilisation d’un débit trop lent ou trop dilué de l’échantillon peut entraîner la sédimentation des cellules, entraînant une augmentation du vortex qui n’est pas souhaitée. Par conséquent, le respect du volume de remise en suspension calculé à l’étape 4.6 devrait entraîner une densité cellulaire qui peut être acquise rapidement mais ne pas obstruer la machine.
4. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires sur l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide sur la façon d’ajuster les tensions en conséquence.
   Remarque : Assurez-vous que tous les paramètres nécessaires sont sélectionnés dans la fenêtre de sélection des paramètres avant l’acquisition ou que les données ne seront pas acquises.
5. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré par isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.
   REMARQUE: Si la suspension cellulaire est trop concentrée pour permettre au cytomètre en flux de faire fonctionner les échantillons sans obstruer, les échantillons peuvent être dilués avec HBSS.

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans perte de temps. Un comptage cellulaire précis, qui est encore nécessaire pour diluer l’échantillon de manière appropriée pour une course non obstruée, peut ensuite être obtenu pendant la période d’incubation du marquage des anticorps.

Ce protocole utilise une mesure du poids des expectorations au lieu d’un nombre de cellules comme indication de la quantité d’anticorps / colorant à utiliser pour un marquage cellulaire optimal. Cependant, il existe un grand degré de variation dans le poids des échantillons d’expectorations; sur les 126 échantillons analysés, le poids variait de 0,57 g à 38,30 g. La figure 1A montre que la corrélation entre le poids des expectorations et le rendement cellulaire n’est pas forte. Par conséquent, les échantillons ont été divisés en quatre catégories; le poids médian des échantillons était de 2,1 g pour les petits échantillons, de 5,0 g pour les échantillons moyens, de 11,2 g pour les grands échantillons et de 22,0 g pour les échantillons extra-larges (figure 1B). Cependant, il y avait encore des échantillons qui donnaient beaucoup plus de cellules que prévu en fonction de leur poids (Figure 1C), la majorité des échantillons se regroupaient bien. Pour les petits échantillons, le rendement cellulaire médian était de 8,0 x 106 cellules, pour les échantillons moyens de 13,0 x 106, pour les grands échantillons de 35,4 x 106 et pour les échantillons extra-larges de 93,0 x 106.

Chaque anticorps utilisé dans ce protocole a été titré. Une concentration sur la phase de plateau (figure 2A) avec l’indice de coloration le plus élevé (figure 2B) de la courbe de titrage a été choisie comme concentration de travail. Les variations du nombre de cellules ne modifieront pas considérablement l’intensité de la coloration. Ce titrage et ce test d’anticorps sont essentiels et doivent être mis en place avec soin pour chaque nouvel anticorps ou colorant utilisé dans ce protocole34,35. Lorsqu’un anticorps est titré avec soin, il devrait tacher 10 à 50 fois plus de cellules que le nombre de cellules sur lesquelles l’anticorps a été titré34,35. Un exemple de ce principe est fourni dans le tableau 4. L’anticorps anti-humain CD45-PE a été titré sur 1 x 106 cellules dans un volume total de 400 μL. Si cet anticorps contre le volume de coloration est extrapolé au protocole (voir le tableau 2, qui montre la quantité de CD45-PE et les volumes de coloration pour chaque taille d’échantillon), pour un petit échantillon, 0,625 x 106 cellules seront colorées, 1,25 x 106 cellules seront colorées pour un échantillon moyen et 2,5 x 106 cellules pour un grand échantillon (colonne A du tableau 4). Un excès de 50 fois dans le nombre de cellules pour chaque catégorie est calculé à 31,25 x 106, 62,5 x 106 et 125 x 106 cellules, respectivement (colonne B). Comme le montrent les colonnes C et D, le nombre médian de cellules de chaque catégorie de taille et le plus grand échantillon de chaque catégorie se situent bien dans la fourchette de 50 fois.

Malgré les différences apparentes de taille et de rendement cellulaire entre les différentes tailles des échantillons d’expectorations, le pourcentage médian de contamination par la SEC dans chaque catégorie est très similaire. La figure 3A montre le pourcentage de CEE trouvés dans des échantillons individuels, stratifiés en fonction de leur catégorie de poids d’expectorations. La principale préoccupation concernait les SECs, car ces cellules ne sont pas représentatives du tissu pulmonaire mais de la cavité buccale. Cependant, la contamination moyenne par la SEC est inférieure à 20% pour toutes les catégories. La figure 3B montre le pourcentage de cellules viables trouvées dans ces échantillons. En excluant les CEE, la viabilité moyenne était d’environ 72 % pour les catégories de petite, moyenne et grande taille d’échantillon. Il était légèrement plus élevé (79 %) pour la catégorie extra-large.

La figure 4 montre une stratégie typique de contrôle pour séparer les cellules d’intérêt des expectorations des débris, des cellules mortes (qui comprennent également les SECs36 contaminants) et des amas de cellules. La figure 4A montre l’utilisation de billes du NIST pour fixer des barrières afin d’éliminer les débris de moins de 5 μm ou de plus de 30 μm, tandis que la figure 4B applique cette porte sur les cellules d’expectorations. La figure 4C montre un profil d’expectoration typique lorsqu’il est vu comme largeur de dispersion latérale (SSC-W) par rapport à la largeur de dispersion avant (FSC-W), la porte de largeur. Ce profil est utilisé pour éliminer les petits débris qui se présentent le long des axes SSC-W et FSC-W. L’élimination des cellules mortes est illustrée aux figures 4D et 4E. Le témoin non coloré (figure 4D) est utilisé pour déterminer le seuil de positivité FVS510; les cellules qui colorent positivement pour FVS510 au-dessus du témoin négatif sont considérées comme mortes et ne seront pas utilisées dans l’analyse des cellules des expectorations (Figure 4E). Enfin, une porte singlet est appliquée pour retirer les doublets de cellules de l’analyse, ce qui est illustré à la figure 4F. Ainsi, les cellules qui ont franchi les portes de sélection illustrées aux figures 4B, 4C, 4E et 4F représentent des cellules d’expectorations uniques vivantes prêtes pour une analyse ultérieure avec les anticorps utilisés dans ce protocole.

L’utilisation de l’anticorps anti-CD45 dans ce protocole de marquage permet la séparation de cellules d’expectorations uniques vivantes en un compartiment cellulaire sanguin (CD45+) et un compartiment cellulaire non sanguin (CD45-). Cette dernière catégorie comprend les cellules épithéliales et d’autres cellules non sanguines. Le profil supérieur de la figure 5A montre l’utilisation d’un échantillon d’expectorations non coloré pour définir le seuil de positivité CD45, rendant les portes pour capturer les cellules CD45+ et les cellules CD45- . Le profil inférieur de la figure 5A montre ces deux portes appliquées à un échantillon d’expectorations coloré avec l’anticorps anti-CD45. La coloration avec des anticorps supplémentaires est ensuite utilisée pour identifier les populations spécifiques des cellules sanguines à l’intérieur de la porte CD45+ (figure 5B) et d’autres populations non sanguines, y compris les populations épithéliales dans la porte CD45( figure 5C). Dans les deux figures, les profils du haut montrent comment les expectorations colorées par isotype sont utilisées pour définir les populations doubles négatives, tandis que les profils du bas montrent les cellules d’expectorations colorées par anticorps. La figure 5B (en bas) montre six populations différentes de cellules CD45+ créées avec le cocktail d’anticorps détectables dans le canal de fluorescence (FL) 1 (anticorps anti-CD66b, CD3, CD19) et l’anti-CD206 détectable dans le canal FL3. Des expériences de tri ont révélé que des macrophages spécifiques aux poumons résident dans les portes identifiées à M. La présence de cellules dans ces portes indique donc que l’échantillon d’expectorations provenait du poumon et n’était pas de la salive (Bederka et al., manuscrit en préparation). La figure 5C (en bas) montre les quadrants de contrôle créés avec l’anti-pan-cytokératine (panCK) détectable dans le canal FL1 et les anticorps de la molécule d’adhésion cellulaire anti-épithéliale (EpCAM) détectables dans le canal FL3 parmi les cellules d’expectoration CD45.

Ce protocole d’étiquetage a été largement testé sur le Navios EX et le LSR II. Quelques expériences préliminaires ont été réalisées sur le Lyric, mais sans l’optimisation approfondie de l’instrument qui a été faite pour les deux autres machines. Par conséquent, des réglages détaillés de l’instrument sont fournis pour le Navios EX et le LSR II dans la feuille Matériaux, mais pas pour le Lyric. Pour comprendre les similitudes et les variations entre ces trois plates-formes cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour analyser les cellules d’expectorations, les profils obtenus à partir des différentes machines peuvent être comparés dans les figures 6 et 7. Deux grands échantillons d’expectorations ont été traités, regroupés, étiquetés, séparés en trois portions égales, puis acquis sur chaque cytomètre de flux mentionné ci-dessus. La figure 6, qui est similaire à la figure 4, compare la stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les cellules mortes et les amas de cellules. La figure 7, identique à la figure 5, compare les profils sanguins et non sanguins à partir des données acquises sur les différents cytomètres de flux.

La comparaison des différents profils obtenus à partir des trois cytomètres de flux différents montre que les mêmes profils de base peuvent être observés avec chaque instrument. Les différences auxquelles il faut prêter attention sont les diagrammes SSC-W/FSC-W (largeur de la porte) (figure 6, deuxième rangée) et les échelles linéaires des nuages de points (figures 6 et 7). Le diagramme de largeur de dispersion généré sur le Navios EX montre une porte d’inclusion (boîte rouge), ce qui signifie que toutes les cellules incluses dans la porte sont analysées plus en détail; les événements le long des axes dans le coin inférieur gauche sont exclus. Les diagrammes de largeur de dispersion sur le LSR II et Lyric ne montrent pas un dépôt similaire d’événements le long de ces mêmes axes. Cet écart est probablement dû au seuil très sensible utilisé sur le Navios EX, ce qui a entraîné de petits débris dans la porte d’exclusion de taille précédente (rangée supérieure de la figure 6). À l’occasion, des débris sont vus le long des axes dans le profil de largeur de dispersion généré sur le LSRII, mais ils se trouvent dans le coin inférieur droit. Dans ces cas, une barrière d’exclusion (comme l’indique la case rouge pointillée dans le profil central de la ligne 2 de la figure 6) est utilisée pour éliminer ces événements d’une analyse plus approfondie.

Alors que les échelles logarithmiques semblent légèrement différentes sur les graphiques entre le Navios EX et les cytomètres Lyric et LSR II, le Navios EX a la possibilité d’acquérir des données en utilisant plus de décennies. La mise en œuvre de plus de décennies dépend du contexte de l’expérience et de la sensibilité souhaitée pour visualiser les populations d’intérêt.

Une différence notable supplémentaire entre les cytomètres Navios EX et LSR II et Lyric est l’apparence du profil de la porte singulet. Le cytomètre Navios EX est équipé d’une cellule d’écoulement rectangulaire avec un angle de collecte différent de celui du LSR II. Le Navios EX contient trois angles de collecte contrôlés par logiciel pour optimiser la diffusion de la lumière de l’angle avant afin d’obtenir la sensibilité appropriée à la taille des particules à analyser. La grille polygonale du cytomètre Navios EX devra être ajustée à un angle légèrement inférieur à celui de la porte singulet du LSRII. La porte singlet pour le Lyric peut être optimisée pour obtenir un profil similaire à celui vu avec le LSR II. En utilisant l’échantillon d’expectorations, le facteur d’échelle de la zone devrait être optimisé pour chaque laser sur le Lyric afin d’obtenir une porte singlet similaire au LSR II.

Tous les profils présentés dans les figures 4 à 7 ont été analysés avec le logiciel FlowJo, version 10.6. Les fichiers .fcs se trouvent dans le FlowRepository (https://flowrepository.org), sous les ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ et FR-FCM-Z3MM et peuvent être utilisés pour pratiquer l’analyse des expectorations comme illustré dans ces figures.

Figure 1 : Poids des expectorations et rendement cellulaire. (A) La relation représentée est la relation entre le poids des expectorations, déterminé avant le traitement, et le rendement cellulaire total, déterminé après le traitement à l’aide d’un hémocytomètre. Chaque puce représente un échantillon individuel, 126 au total. (B) Les échantillons d’expectorations ont été stratifiés en quatre catégories en fonction de leur poids: petits pour les échantillons pesant jusqu’à 3 g, moyens pour les échantillons pesant plus de 3 g jusqu’à 8 g, grands pour les échantillons pesant plus de 8 g jusqu’à 16 g et extra-larges pour ceux pesant plus de 16 g. (C) La distribution du rendement cellulaire pour les échantillons de chaque catégorie est indiquée. Les barres rouges en (B) et (C) représentent les valeurs médianes de chaque catégorie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Titrage des anticorps pour le CD45-PE anti-humain. (A) La courbe de titrage cd45-PE (IgG1) avec l’intensité moyenne de fluorescence (IFM) de la population positive tracée par rapport à la concentration de l’anticorps CD45-PE plafonne à 1 μg/mL. (B) La courbe de titrage représentant l’indice de coloration par rapport à la concentration d’anticorps montre que l’indice de coloration le plus élevé est de 1 μg/mL. L’indice de coloration a été calculé comme suit : [population positive de l’IFM CD45 - population négative de l’IFM CD45] / [2 * Écart type]. Sur la base des figures 2A et 2B, 1 μg/mL a été choisi comme concentration optimale pour l’anticorps CD45-PE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: La proportion de SEC et de cellules mortes dans les échantillons d’expectorations est cohérente entre les quatre catégories de poids. (A) La proportion de SEC dans les échantillons d’expectorations est classée en fonction de leur catégorie de poids. Le pourcentage de contamination par la SEC a été déterminé par hémocytomètre dans le cadre du nombre total de cellules. (B) Viabilité cellulaire des échantillons d’expectorations à l’exclusion du SECS, déterminée par hémocytomètre et la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Pour chaque graphique, les lignes rouges représentent les valeurs médianes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Stratégie de contrôle pour exclure les débris, les cellules mortes et les doublets dans un échantillon d’expectorations. (A) Des billes du NIST de tailles 5 μm, 20 μm et 30 μm ont été utilisées pour fixer la porte indiquée par la boîte rouge afin d’exclure les débris de moins de 5 μm et les débris plus gros au-dessus de 30 μm et proches de l’axe. (B) Un échantillon d’expectorations a été acquis en utilisant les mêmes tensions pour la dispersion vers l’avant et latérale que celles des billes du NIST. La barrière créée en (A) a été appliquée pour exclure les débris. (C) Les petits débris proches de l’axe ont été exclus de ce nuage de points. (D) Un échantillon d’expectorations non coloré a été utilisé pour fixer le seuil (ligne rouge) de la population négative et non colorée pour le colorant de viabilité. (E) La coupure créée en D a été appliquée à l’échantillon d’expectorations colorées pour former une porte (boîte rouge) afin d’inclure des cellules vivantes et viables. (F) La porte singulet indiquée par le polygone rouge exclut les cellules qui ne tombent pas sur la diagonale, éliminant ainsi les doublets et/ou les amas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Stratégie de contrôle des cellules d’expectorations dans les compartiments sanguins et non sanguins. (A) Des cellules d’expectorations non colorées dérivées de la porte singulet sont utilisées pour définir le seuil (ligne rouge) de la population négative pour CD45 (en haut). La coupure du profil supérieur est appliquée à l’échantillon d’expectorations coloré (en bas) pour différencier les populations CD45 positives (CD45+) et négatives (CD45-). (B) Les cellules d’expectorations CD45+ colorées avec des anticorps isotypes pour FITC/AF488 sont utilisées pour fixer les portes sur la population négative (en haut). Les mêmes portes sont appliquées aux cellules des expectorations CD45+ colorées avec des marqueurs de cellules sanguines CD3, CD19, CD66b et CD206 (en bas). (C) Des portes quadrantaires sont placées sur les cellules d’expectorations CD45 colorées avec des contrôles d’isotype (en haut) et appliquées aux cellules CD45 à partir de l’échantillon d’expectorations coloré avec les marqueurs épithéliaux pan-cytokératine (panCK) et EpCAM (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Stratégie de contrôle pour exclure les débris, les amas et les cellules mortes des cellules d’expectorations colorées sur trois plateformes cytométriques en flux. Deux grands échantillons d’expectorations ont été traités, regroupés, étiquetés et divisés en trois portions égales pour acquisition sur les cytomètres de flux Navios EX (A), LSR II (B) et Lyric (C). Rangée du haut : Les échantillons d’expectorations ont été fermés (boîte rouge) pour exclure les très petits et gros débris. Deuxième rangée : La grande boîte rouge du tracé Navios EX représente une porte d’inclusion qui inclut les cellules mais exclut les débris. La petite boîte rouge en pointillés vue dans le graphique LSR II représente une porte d’exclusion pour éliminer les débris d’une analyse plus approfondie. Une optimisation supplémentaire avec le Lyric est nécessaire pour déterminer où l’exclusion des débris est nécessaire. Par conséquent, aucune porte n’est présente dans cette parcelle. Troisième rangée: les portes rectangulaires rouges comprennent des cellules vivantes pour une analyse plus approfondie. Rangée du bas: la porte polygonale a des cellules simples en excluant les doublets qui tombent en dehors de la diagonale de la porte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Stratégie de contrôle des expectorations colorées pour le sang et les marqueurs épithéliaux sur trois plateformes cytométriques en flux. L’analyse illustrée à la figure 6 se poursuit à la figure 7; toutes les cellules uniques viables (rangée du bas, figure 6) ont été divisées en populations CD45+ et CD45( première rangée, figure 7), de sorte que les marqueurs spécifiques des cellules sanguines et les marqueurs spécifiques des cellules épithéliales puissent délimiter davantage ces populations. Deuxième rangée : profil des marqueurs de cellules sanguines CD3/CD19/CD66b et CD206 à partir de cellules CD45+. Troisième rangée : marqueurs de cellules épithéliales panCK et EpCAM à partir de cellules CD45. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Anticorps et taches de viabilité utilisés. Liste des anticorps et du colorant de viabilité utilisés dans ce protocole. Les sous-ensembles cellulaires qu’ils identifient chacun sont indiqués.

Tableau 2 : Contenu des tubes contenant des cellules d’expectorations. Utilisez ce tableau tel que référencé dans le protocole pour ajouter les volumes spécifiés d’anticorps et la coloration de viabilité pour la taille d’échantillon appropriée.

Tableau 3: Contenu des tubes de compensation. Utilisez ce tableau tel que référencé dans le protocole pour ajouter les volumes spécifiés d’anticorps aux billes de compensation.

Tableau 4 : Concentration anti-humaine de CD45-PE pour tous les échantillons de chaque catégorie de taille d’échantillon.

Tous les auteurs sont des employés passés ou actuels de bioAffinity Technologies.