Summary
Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.
Abstract
Drosophila melanogaster representa um modelo geneticamente tratável para estudar a estrutura e a função neuronal, e alterações subsequentes nos estados da doença. A junção neuromuscular larval bem caracterizada é frequentemente utilizada para tais estudos. No entanto, o rápido desenvolvimento larval seguido de histrólise muscular e remodelação do sistema nervoso durante a metamorfose torna este modelo problemático para o estudo de mudanças degenerativas dependentes da idade lenta, como as que ocorrem na esclerose lateral amiotrófica. Alternativamente, moscas adultas vivem por 90 dias e a perna adulta pode ser usada para estudar mudanças de neurônios motores ao longo da vida adulta usando imagens fluorescentes in vivo através da cutícula. Aqui, descrevemos uma técnica de dissecção de pernas aliada à imunocitoquímica, que permite o estudo de alterações moleculares na junção neuromuscular de neurônios motores de perna adulta identificados. Essas técnicas podem ser acopladas a uma miríade de anticorpos que rotulam estruturas pré e pós-sinápticas. Juntos, esses procedimentos permitem uma caracterização mais completa das mudanças lentas dependentes da idade em moscas adultas e podem ser aplicados em vários modelos de doença do neurônio motor.
Introduction
As doenças do neurônio motor (MN) abrangem um grupo de condições heterogrógenas que incluem degeneração progressiva levando ao perda muscular e paralisia como fenótipo clínico primário1. Embora raro com uma prevalência global de 4,5 por 100.000, espera-se que essa prevalência aumente com um envelhecimento populacional2. A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é a doença de MN mais comum (MND) e é tipicamente fatal em um curto espaço de tempo de diagnóstico sem tratamentos modificados por doenças existentes 3. Os MNDs compartilham em comum uma fase pré-sinttomática prolongada com alterações de biomarcadores moleculares precoces e alterações de imagem funcionais vistas em pacientes4. A patologia celular pré-síntomática precoce também é observada em modelos de doenças não humanas5,6,7,8. O estudo de alterações precoces na junção neuromuscular é importante para a compreensão da patogênese da doença de MN e pode auxiliar no desenvolvimento de diagnósticos precoces e terapêuticas potenciais.
Existe uma riqueza de ferramentas genéticas e moleculares em Drosophila para dissecar a estrutura e a função da junção neuromuscular (NMJ, ver9 para uma revisão da larva bem caracterizada NMJ). Essas ferramentas combinadas com uma vida útil curta fazem do Drosophila um excelente modelo para estudar mudanças neurodegenerativas no NMJ. Especificamente, os músculos adultos que inervam inervando estão presentes ao longo da vida adulta de ~90 dias e estão sujeitos a processos normais de envelhecimento10,11,12,13. Os MNs adultos, portanto, oferecem uma oportunidade de estudar mudanças degenerativas lentas em contraste com os NMJs larvais que existem por apenas um curto período de tempo de ~1 semana antes da metamorfose14,15.
Aqui, descrevemos um procedimento de dissecção que nos permite realizar análises imunocitômicas de MNs na perna adulta. Cada perna adulta é inervatada por ~50 MNs, que sinapse na perna associada muscular para conduzir a locomoção. A anatomia da perna, a fisiologia mecânica e a neurobiologia foram bem descritas16,17,18. As arbors axon de MNs de perna foram anteriormente caracterizadas por imagens através de cutículas em populações de células com antecedentes ou geneticamente rotuladas usando o sistema bipartite Gal4/UAS e métodos de imagem foram publicados anteriormente19. Os métodos de dissecção aqui apresentados preservam a morfologia ramificada do axônio e nos permitem explorar uma gama diversificada de anticorpos para rotular diferentes componentes moleculares do NMJ. Nosso trabalho anterior se concentrou em projeções de um MN definido na perna metatorácica (3ª), que inerva o músculo levator da tíbia (tilm) e mostra padrões consistentes de arborização e números de bouton. Inicialmente estudamos alterações dependentes da idade em drosophila superoxida desmutase 1 (dsod1) mutantes e encontramos alterações consistentes com o desmantelamento do NMJ20. Esses métodos de dissecção oferecem a oportunidade de caracterizar melhor mudanças degenerativas lentas no NMJ para outros modelos de ELA, estudos básicos de envelhecimento e outras doenças associadas à MN.
Figura 1. Resumo do fluxo de trabalho para dissecar as pernas. Consulte o protocolo para obter etapas detalhadas. (A,B) Moscas são selecionadas e anestesiadas. (C) As moscas são transferidas para o metanol e lavadas com PBS. (D) As pernas metaturácicas são removidas na base da coxa enquanto visualizadas com um microscópio dissecador (ampliação~30x); barra de escala = 500 μm. (E) As pernas são então fixadas em solução de formaldeído/PBS (FA) de 3,7% por 30 minutos dentro de poços de placas de 24 poços e, em seguida, a FA é removida por lavagens com PBS. (F, G, H) As pernas são transferidas para bandejas de dissecação de destomerso de silicone e um pedaço de cutícula é removido do fêmur proximal usando fórceps chanfrados enquanto visualizado sob um microscópio dissecando em 80x; barra de escala = 50 μm. (I) As pernas são pós-dissecção fixadas em FA e lavadas em PBS e, em seguida, PBT (PBS+ 0,1% surfactante não iônico). (J) As pernas são submetidas a coloração imunocitômica. (K,L) As pernas são transferidas para um escorregador de vidro, limpas em meios de montagem, e cobertas com um deslizamento contendo espaçadores de argila; barras de escala = 2 mm e 500 μm. (M) As pernas são imagens por microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Os procedimentos de preparação de soluções de trabalho utilizadas em conjunto com este protocolo estão descritos na Tabela 1.
| Reagente | Preparação | Armazenamento | |||
| PBS | Faça um estoque de 1x PBS de uma solução de estoque PBS de 10x diluindo em água destilada. O pH das ações da PBS em funcionamento deve ser de 7,2- 7,4 | 4 °C por mais de 1 mês até que a contaminação bacteriana seja visível. | |||
| PBT | Solução 1x PBS com surfactante não iônico de 0,1%. | 4 °C por mais de 1 mês até que a contaminação bacteriana seja visível. | |||
| FA | Solução de formaldeído de 3,7% feita a partir de um estoque de formaldeído de 37% e diluída em 1x PBS. | Temperatura ambiente. Faça fresco a cada dia de dissecção | |||
| ATENÇÃO: O formaldeído fornecido como 37% da solução de estoque é um potencial cancerígeno e deve ser diluído em um capô de fumaça. | |||||
| 5% de NGS | 5% de soro de cabra normal diluído em PBT. O soro utilizado deve combinar com a espécie do anticorpo secundário a ser utilizado. | 4 °C por várias semanas até que a contaminação bacteriana seja visível | |||
Mesa 1. Soluções para a realização da imunocitoquímica da perna de Drosophila adulta .
1. Fixação inicial dos tecidos
- Selecione aproximadamente 10 moscas para cada genótipo e idade. Anestesiar em uma plataforma de mosca sob dióxido de carbono (Figura 1A, B).
NOTA: Comece com mais moscas do que o necessário para garantir um tamanho amostral grande o suficiente após a dissecção. - Usando um pincel, transfira moscas para metanol frio em um poço de vidro ou prato por aproximadamente 30 segundos a 1 minuto (Figura 1C). O metanol solubiliza os hidrocarbonetos cuticulares e as moscas podem agora ser submersas em vez de flutuar em soluções aquosas.
- Com fórceps, transfira cuidadosamente moscas para a PBS. Enxágüe 3x em PBS gelado para remover o excesso de metanol e mantenha moscas em PBS no gelo até dissecção e fixação. Neste ponto, dissecar moscas e corrigir no menor tempo possível (<30 minutos).
- Para isolar as pernas, transfira moscas para um prato de dissecção de desintoxicação de silicone cheio de PBS frio, remova as pernas metatorácicas na coxa usando dois pares de fórceps #5 Dumont ou corte as pernas com a tesoura Vanna (Figura 1D). Transfira as pernas para um poço em uma placa de plástico de 24 poços cheia de 1 mL de PBS e mantenha a placa no gelo até que todas as pernas sejam removidas e transferidas para poços.
NOTA: Cada poço pode segurar pelo menos 20 pernas. - Substitua a solução PBS por 1 mL de solução FA e gire em um nutador por 30 minutos (Figura 1E). A configuração nutator deve ser definida a uma velocidade média (17 rpm). Certifique-se de que as pernas estão completamente submersas na solução FA durante este tempo para fixação adequada.
- Para remover a solução FA, lave em 1 mL de PBS 3x rapidamente seguido por 3 lavagens adicionais por 5 minutos cada em 1 mL de PBS. Segure tecidos em 1 mL de PBS no gelo antes, e durante as etapas de dissecção descritas abaixo.
2. Remoção da cutícula da perna e mancha de anticorpos
- Removendo a cutícula da perna
- As a fórceps dissecando são fundamentais para o sucesso. Introduza pequenas curvas paralelas em ambas as pinças no final de fórceps super finos #5 para fornecer um chanfrado que permite que a cutícula seja agarrada superficialmente em vez de ser cutucada, o que pode arruinar o tecido (Figura 1F, G).
NOTA: Os pinos dobrados em paralelo ainda devem fazer contato entre si durante toda a extensão do pino quando fechados (Figura 2). - Transfira as pernas para um prato de elastômero de silicone na PBS para dissecção. Oriente uma perna para que o lado anterior esteja voltado para cima (ver Figura 3 para anatomia da perna e informações de orientação). Usando um par de fórceps, segure o segmento da tíbia contra o prato de elastômero de silicone. Usando as outras fórceps para baixo, pegue um pedaço de cutícula na extremidade distal do fêmur e puxe a direção proximal em direção ao trochanter.
- Mantenha-se metodicamente removendo a cutícula até que o músculo nu seja visível em toda a extremidade proximal do fêmur (Figura 1F, G, H).
NOTA: Só faça contato superficial com as pernas usando o lado chanfrado dos fórceps para evitar puxar o músculo. - Uma vez que todas as pernas sejam dissecadas, substitua pbs por FA para pernas pós-fixadas por 30 minutos com agitação em um nutador em velocidade média (Figura 1I). Lave amostras em 1 mL de PBS por 3 vezes rápido e depois 3 vezes por 5 minutos cada em PBT (Figura 1J).
NOTA: Se a coloração com anticorpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot) para rotular zonas ativas, pós-fixe por 20 minutos, pois este antígeno é sensível a fixações mais longas.
- As a fórceps dissecando são fundamentais para o sucesso. Introduza pequenas curvas paralelas em ambas as pinças no final de fórceps super finos #5 para fornecer um chanfrado que permite que a cutícula seja agarrada superficialmente em vez de ser cutucada, o que pode arruinar o tecido (Figura 1F, G).
Figura 2. Fórceps modificados usados para dissecar pernas adultas. (A) As extremidades dos fórceps são dobradas e, em seguida, achatadas na parte inferior (seta) criando um bisel ao arquivar em uma pedra de aftosa. (B) Em contraste, as pinças de fórceps não modificados não são dobradas. Barra de escala = 1 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Mancha de anticorpos
- Para bloquear tecidos para coloração de anticorpos, substitua 1 mL de PBT por solução de bloqueio composta por 1 mL de 5% de NGS diluído em PBT. Incubar as pernas dissecadas por 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança em um nutador a velocidade média (17 rpm). Durante todas as incubações, cubra poços com fita adesiva, além da tampa plástica (Figura 1J).
NOTA: 24 placas de poço são usadas para imunocitoquímica em vez de 1,5 mL ou microcentrifuuge de 2 mL porque tentativas anteriores de uso de tubos de microcentrifuuuagem resultaram em pernas quebradas e tecido danificado. - Remova a solução de bloqueio e adicione 300 mL de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio fresco. O pequeno volume de anticorpos utilizados deve ser suficiente para cobrir os tecidos. Selar os poços com fita de vedação de laboratório e tampa plástica e incubar durante a noite a 4 °C com agitação em um nutador em velocidade média (Figura 1J). As informações e concentrações de reagentes de anticorpos de trabalho utilizadas nesses estudos estão descritas na Tabela 2.
- Lave os anticorpos primários em 1 mL de PBT por 3 vezes brevemente e depois 3 vezes por 15 minutos cada (Figura 1J).
NOTA: Os anticorpos primários diluídos podem ser salvos e reutilizados se armazenados a 4 °C por até 2 semanas. - Bloqueie novamente os tecidos em 1 mL de 5% de NGS por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 C (Figura 1J).
- Remova a solução de bloqueio de 5% de NGS e adicione 300 μL dos anticorpos secundários conjugados fluorescentes diluídos apropriados. Além disso, adicione 1:2000 diluição de fhalloidina conjugada com fluorescência para rotular músculo (Figura 1J).
- Para incubações secundárias de anticorpos, veda poços com fita de vedação de laboratório e tampa. Além disso, enrole placas em papel alumínio para proteger os fluoroforos da luz. Incubar por 6-8 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Lave anticorpos secundários e falooidina conforme descrito na etapa 2.2.3 acima. Cubra placas com papel alumínio entre as lavagens para proteger os fluoroforos da luz.
- Para bloquear tecidos para coloração de anticorpos, substitua 1 mL de PBT por solução de bloqueio composta por 1 mL de 5% de NGS diluído em PBT. Incubar as pernas dissecadas por 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança em um nutador a velocidade média (17 rpm). Durante todas as incubações, cubra poços com fita adesiva, além da tampa plástica (Figura 1J).
3. Pernas de montagem
- Transfira as pernas para um slide usando fórceps e oriente o lado anterior para cima. Cubra as pernas com mídia de montagem (Figura 1K, L).
NOTA: As pernas dissecadas podem ser aspiradas com uma ponta de pipeta P1000 se o furo inferior for ampliado cortando com uma lâmina de barbear. - Adicione espaçadores de argila a uma tampa de 22x22 mm2 (nº 1,5 de espessura) raspando os cantos de deslizamento de tampa em uma pequena bola de argila modeladora. Cada canto deve ter uma pequena quantidade de argila de 1-2 mm de espessura (Figura 1K).
- Para cobrir o slide, adicione o deslizamento com os espaçadores de argila voltados para o escorregador e empurre cuidadosamente os cantos até que a mancha de cobertura toque apenas a superfície do fêmur.
- Para evitar a evaporação, sele as bordas da mancha com esmalte e deixe secar em um lugar escuro (cerca de 10 minutos) antes de armazenar a 4 °C até a imagem.
4. Imagem
- Imagem por microscópio confocal (Figura 1M). Inclua um canal de luz transmitido para avaliar melhor a qualidade da dissecção e amostras com fibras musculares visivelmente interrompidas na área de interesse devem ser descartadas.
- Comece a fotografar pilhas z com ampliação de 20x com zoom de 2x e uma profundidade total de imagem de ~ 40 mm correspondente à espessura do fêmur. Para detecção de sinal fluorescente, capture imagens em resoluções consistentes com a amostragem de Nyquist (estamos usando 1024 x 1024 pixels com uma configuração de 8-10 μs/pixel). A intensidade do sinal deve estar na faixa linear que é alcançada ajustando as configurações de ganho de alta tensão. Uma vez que as configurações de ganho são definidas para uma série de amostras dentro de um experimento, elas não devem ser alteradas para que as intensidades de sinal possam ser comparadas entre as amostras.
- Para imagens sinapáticas e outras estruturas subcelulares, capture imagens confocal na ampliação de ≥60x. As configurações do detector devem estar na faixa linear, enquanto a densidade dos pixels, as configurações de moradia e a profundidade z devem ser semelhantes para imagens capturadas em menor ampliação (passo 4.1).
Representative Results
A Figura 4 mostra um exemplo representativo de uma perna metatirácica manchada com anti-hrp, anti-dlg e falooidina. Para dissecções que removem cutícula da porção proximal do fêmur, arbors estereotipadas serão aparentes perto do tendão que é detectada facilmente por autofluorescência. Observe que a penetração de anticorpos na perna ocorre por uma curta distância além da região em que a cutícula foi removida (Figura 4A). Essas regiões podem ser imagens efetivamente quando há forte sinal de fluorescência. A imagem em baixa ampliação (20x com zoom de 2x) permite uma determinação fácil de 1) quanto cutícula é removida, e 2) se o dano ocorreu durante a dissecção. O aumento da ampliação (60x) mostra projeções estereotipadas no tilm (Figura 4B). Nosso trabalho se concentrou em um MN, provavelmente derivado da linhagem I-MN que invada o tilm no fêmur proximal (caixa, Figura 4B e Figura 4C). Aumentar ainda mais a ampliação (100x com zoom de 2x) permite uma visualização eficaz de boutons sinápticos (Figura 4D).
Para estudar alterações morfológicas no NMJ adulto ao longo do tempo, já usamos dsod1 mutantes como modelo de ELA. O inchaço de bouton ocorre em mutantes dsod1H71Y idosos em relação a dsod1null e dsod1+ (Figura 5A, B). No NMJ larval, o anticorpo monoclonal NC82 é frequentemente usado para rotular zonas ativas e estas estruturas podem ser facilmente visualizadas no NMJ adulto (Figura 5C). Os ramos de axônio HRP fracamente positivos são abundantes em mutantes dsod1H71Y e esses ramos muitas vezes mostram localização de BRP fraca e difusa (setas).
Importante para a neurodegeneração, anticorpos disponíveis comercialmente podem detectar proteínasubiquitinadas frequentemente encontradas em agregados, e detectamos agregadosubiquitinados dentro de axônios terminais de MNs em moscas mutantes envelhecidas, bem como dentro do músculo (Figura 6A). Além disso, anticorpos que rotulam mitocôndrias também podem detectar alterações morfológicas com a idade (Figura 6B).
Para algumas preparações, danos musculares durante a dissecção tornam a amostra inutilizável. No início, esse dano pode ser uma ocorrência comum, mas a melhoria ocorre com a prática. Exemplos de boas dissecções são os mostras Figure 7A, C enquanto as dissecções ruins são mostradas na Figura 7B, D. Dissecções ruins causam desorganização das fibras musculares detectadas por microscopia de contraste de fase (Figura 7B) ou falta de fibras musculares visualizadas por faloideina conjugada fluorescente (Figura 7D, seta). A combinação do uso da falooidina para rotular músculos, e imagens de luz transmitidas podem ajudar a detectar tais danos musculares que podem não ser aparentes ao visualizar sob um microscópio dissecando.
Figura 3. Anatomia da perna de Drosophila . (A) Diagrama do lado anterior de uma perna metatórácica, caracterizado pela presença de cerdas em contraste com a cutícula nua proeminente presente no lado posterior. A perna segmentada é composta pelos segmentos coxa (Cx), trochanter (Tr), fêmur (fêmur (Fêmur), tíbia (Ti), 5 segmentos tarsos (Ta1-5) e garra (Cl) em ordem de proximal (Pr) a distal (Di). As laterais dorsal (D) e ventral (V) do fêmur também são indicadas. Barra de escala =100 μm. (B) Diagrama do fêmur contendo os músculos tíbia levator (tilm), depressor de tíbia (tidm), músculo tendão longo 2 (ltm2) e redutor de tíbia (tirm) e projeções de axônio no fêmur proximal inervando o tilm. Essas projeções axonais estereotipadas são presumidamente derivadas dos neuroblastos de linhagem I16, e a segunda arborização é a mais fácil de acessar por dissecção (encaixotada). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O fêmur metatirácico dissecado revelou arquitetura MN estereotipada que invata o tilm. A imunocitoquímica foi usada para marcar neurônios (HRP), discos grandes (DLG) e músculos (faloideína). As pilhas Z foram capturadas por imagens de microscopia confocal através de todo o fêmur e mostradas como uma projeção de série máxima. (A) Um canal de luz transmitido também foi incluído para ilustrar que não ocorreu nenhum dano muscular detectável durante a dissecção. A imagem foi capturada a 20x de ampliação, barra de escala =50 μm. (B) Arbors identificados associados ao tilm (área encaixotado, centro), barra de escala =20 μm; e (C) a 60x de ampliação, barra de escala = 20 μm. (D) Os boutons circundantes foram aparentes em animais do tipo selvagem quando retratados em ampliação de 100x com zoom de 2x; barra de escala = 2 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Exemplo de alterações dependentes da idade na morfologia bouton que podem ser detectadas usando a técnica de dissecção da perna. O inchaço bouton é visto em mutantes dsod1H71Y envelhecidos. (A) Imagens representativas de boutons manchados de HRP de jovens (recém-eclosed, dia 0 adultos) e velhos (dia 10) moscas, barra de escala = 1 μm. (B) Os tamanhos de bouton foram quantificados a partir de seus respectivos genótipos utilizando a função de medida dentro do ImageJ. p<0.0001 (ANOVA de 2 vias com teste tukey pós-hoc). (C) Zonas ativas dentro de boutons sinápticos rotulados com anticorpo monoclonal NC82 (anti-bruchpilot); barra de escala = 1 μm. Figura modificada a partir de20Por clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Marcadores comuns associados à doença neurodegenerativa utilizada nas preparações da perna de Drosophila. (A) Os agregados poliabiquitinados subcelulares são detectados em axônios terminais e músculos de moscas dsod1H71Y envelhecidas. A imunocitoquímica usando anti-poliubiquitina (FK2) detecta puncta (setas) em dsod1H71Y/H71Y envelhecido, barra de escala = 20 μm (esquerda) e 5 μm (direita). (B) Mitocôndrias inchadas podem ser detectadas usando anti-ATP5A, barra de escala = 1 μm. Figura modificada a partir de20Por clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Exemplos de dissecções boas e pobres. (A) Dissecção que não interrompeu a arquitetura muscular subjacente. (B) Um exemplo de dissecção ruim que mostrou fibras musculares desgastadas (seta) e não pôde ser usada para análise. Ambas as amostras foram imagens por microscopia de contraste de fase. Barra de escala = 50 μm. (C) Exemplo de uma boa dissecção imagem por microscopia confocal com HRP (verde) e faloidina (azul). (D) Falta de dissecção falta de fibras musculares dorsais do TILM (seta). Barra de escala = 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo/Mancha | Diluição* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Proteína de corda anti-cisteína (ab49) | 1:50 |
| Anti-discos grandes (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-poliuubiquitina (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Anticorpo secundário anti-rato de cabra | 1:800 |
| Faloideina | 1:2000 |
| *Diluir em 5% de NGS |
Mesa 2. Anticorpos e diluições. Os fornecedores comerciais dos anticorpos utilizados nesses estudos estão listados na Lista de Materiais.
Discussion
A perna adulta Drosophila é um modelo ideal para estudar a neurodegeneração dada a relativa simplicidade com MNs bem caracterizados mapeados de linhagens neuroblastos e padrões de arborização estereotipados. Vários relatos já utilizaram MNs de perna para o estudo da doença neurodegenerativa21,22. Estes estudos utilizaram linhas de expressão de GFP combinadas com a análise de mosaico com um marcador celular repressível (MARCM) para a imagem através da cutícula e documentaram uma série de alterações morfológicas. Imagens de NMJs adultos por imunocitoquímica com cutícula ressecada permitem uma caracterização adicional com a capacidade de rastrear mudanças moleculares complexas usando uma caixa de ferramentas de anticorpos disponíveis.
A porção imunocitoquímica deste protocolo é relativamente padrão e pode ser implementada independente do genótipo (ver23 para uma excelente descrição dos métodos gerais de coloração de anticorpos para uso com Drosophila). Além disso, parâmetros como intensidade de fluorescência, comprimento do ramo de axônio e números e tamanho bouton podem ser determinados usando uma variedade de macros ImageJ disponíveis uma vez que as imagens são capturadas e métodos detalhados para análise quantitativa foram publicados (por exemplo, ver24,25,26). Assim, a técnica de dissecção é a principal inovação descrita aqui. Antes da dissecção, as moscas são submersas em um álcool para remover hidrocarbonetos cuticulares. Tanto o etanol quanto o metanol são comumente utilizados para este fim; no entanto, só usamos metanol. Crítico para dissecção o sucesso são vários fatores: Primeiro, o uso de fórceps modificados com um chanfrado permite um contato muito superficial com a cutícula. Segundo, usando um microscópio dissecando capaz de ampliação total de 60-100x para que a superfície da cutícula seja claramente visível. Para microscópios com menor ampliação máxima, os objetivos 2x estão disponíveis para as marcas mais comuns e devem ser suficientes quando combinados com as lentes existentes. Em terceiro lugar, a etapa inicial de fixação torna a cutícula frágil e mais fácil de se afastar sem danificar o músculo por baixo. A super fixação nesta etapa torna toda a perna muito rígida para dissecção eficaz. Portanto, a fixação inicial deve ser limitada a 30 minutos. O fixador de formaldeído não penetrará o suficiente para interligar efetivamente o tecido subjacente durante este curto período e, portanto, é necessário um segundo passo de fixação. Antes da segunda fixação, os tecidos devem ser mantidos no gelo para evitar a degradação e mudanças na morfologia. Em quarto lugar, encontramos amostras dissecando enquanto o frio também é importante, provavelmente por razões semelhantes em que a cutícula é frágil e uma pequena peça pode ser mais facilmente removida.
Com a prática, descobrimos que ~50% das dissecções serão utilizáveis dentro de nenhum dano tecidual discernível. Embora essa porcentagem possa parecer baixa em relação a alguns outros tecidos, o procedimento de dissecção é rápido, e muitas pernas podem ser processadas em 30- 60 minutos. Portanto, mesmo que as taxas de sucesso sejam baixas inicialmente, é viável obter 4-5 boas amostras para cada grupo experimental. No entanto, uma limitação pode ser o número de moscas disponíveis a qualquer momento se genótipos e/ou idade resultar em letalidade substancial.
Outra limitação é que não conseguimos dissecar outras áreas da perna além da região proximal do fêmur devido ao tamanho. Assim, podemos estudar arbors MN identificados inervando o TILM de forma confiável e é possível dissecar cutícula acima do músculo depressor da tíbia com pequenas alterações na forma como a perna é orientada ao dissecar. No entanto, o acesso a outras regiões da perna tem se mostrado mais difícil sem interromper a arquitetura axonal durante a dissecção.
Aqui, apresentamos métodos de dissecção para detectar alterações no NMJ adulto para MNs definidas que inervam o tilm usando imunocitoquímica. A perna é útil como um sistema simples, inervado por apenas ~50 MNs e contendo 14 músculos com anatomia bem descrita. A preparação da perna dissecada pode ser usada através de genótipos e um conjunto de anticorpos estão disponíveis para visualização NMJ sem a necessidade de construir estoques genotipicamente complexos de construções genéticas de repórteres em fundos mutantes. Essa abordagem permitirá uma caracterização mais detalhada das alterações no NMJ para doenças de MN e outras condições relacionadas à idade.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Eric Roberts por conselhos sobre imagens. Também queremos agradecer aos Serviços de Tecnologia da Informação no Rhode Island College e, em particular, michael Caine e Jake Douglas pela videografia. Anticorpos monoclonais anti-dlg e anti-brp foram desenvolvidos pela UC-Berkeley e Universitaetsklinikim Wuerzburg, respectivamente, e foram obtidos do Banco Hybridoma de Estudos de Desenvolvimento, criado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA 52242, EUA. A pesquisa aqui relatada foi apoiada integralmente pela Rede de Excelência em Pesquisa Biomédica do Rhode Island (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de subvenção [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
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