Article de méthode

Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

DOI :

10.3791/62902

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13 août 2021

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1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce travail, nous décrivons un protocole modifié pour tester le flux de substrat respiratoire mitochondrial en utilisant la perfringolysine O recombinante en combinaison avec la respirométrie à base de microplaques. Avec ce protocole, nous montrons comment la metformine affecte la respiration mitochondriale de deux lignées cellulaires tumorales différentes.

Résumé

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Le flux de substrat mitochondrial est une caractéristique distinctive de chaque type de cellule, et des changements dans ses composants tels que les transporteurs, les canaux ou les enzymes sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Le flux de substrat mitochondrial peut être étudié à l’aide de cellules intactes, de cellules perméabilisées ou de mitochondries isolées. L’étude de cellules intactes rencontre plusieurs problèmes dus à l’oxydation simultanée de différents substrats. En outre, plusieurs types de cellules contiennent des réserves internes de différents substrats qui compliquent l’interprétation des résultats. Les méthodes telles que l’isolement mitochondrial ou l’utilisation d’agents perméabilisants ne sont pas facilement reproductibles. Isoler des mitochondries pures avec des membranes intactes en quantité suffisante à partir de petits échantillons est problématique. L’utilisation de perméabilisateurs non sélectifs provoque divers degrés de dommages inévitables à la membrane mitochondriale. La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme perméabilisant plus approprié, grâce à sa capacité à perméabiliser sélectivement la membrane plasmique sans affecter l’intégrité mitochondriale. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec la microflamétrie, il permet de tester le flux de plusieurs substrats mitochondriaux avec suffisamment de répliques dans une expérience tout en utilisant un nombre minimal de cellules. Dans ce travail, le protocole décrit une méthode pour comparer le flux de substrat mitochondrial de deux phénotypes ou génotypes cellulaires différents et peut être personnalisé pour tester divers substrats ou inhibiteurs mitochondriaux.

Introduction

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La respirométrie à base de microplaques a révolutionné la recherche mitochondriale en permettant l’étude de la respiration cellulaire d’un échantillon de petite taille1. La respiration cellulaire est généralement considérée comme un indicateur de la fonction mitochondriale ou du « dysfonctionnement », malgré le fait que la gamme mitochondriale des fonctions s’étend au-delà de la production d’énergie2. Dans des conditions aérobies, les mitochondries extraient l’énergie stockée dans différents substrats en décomposant et en convertissant ces substrats en intermédiaires métaboliques pouvant alimenter le cycle de l’acide citrique3 (Figure 1). Le flux continu de substrats est essentiel pour que le flux du cycle de l’acide citrique génère des « donneurs d’électrons » à haute énergie, qui délivrent des électrons à la chaîne de transport d’électrons qui génère un gradient de protons à travers la membrane mitochondriale interne, permettant à l’ATP-synthase de phosphoryler ADP en ATP4. Par conséquent, une conception expérimentale pour tester la respiration mitochondriale doit inclure la nature de l’échantillon (cellules intactes, cellules perméabilisées ou mitochondries isolées) et les substrats mitochondriaux.

Les cellules conservent un stock de substrats indigènes5, et les mitochondries oxydent plusieurs types de substrats simultanément6, ce qui complique l’interprétation des résultats obtenus à partir d’expériences réalisées sur des cellules intactes. Une approche courante pour étudier la capacité mitochondriale à oxyder un substrat sélectionné consiste à isoler les mitochondries ou à perméabiliser les cellules étudiées5. Bien que les mitochondries isolées soient idéales pour les études quantitatives, le processus d’isolement est laborieux. Il fait face à des difficultés techniques telles que la nécessité d’un échantillon de grande taille, la pureté du rendement et la reproductibilité de la technique5. Les cellules perméabilisées offrent une solution aux inconvénients de l’isolement mitochondrial; cependant, les agents perméabilisants de routine de nature détergente ne sont pas spécifiques et peuvent endommager les membranes mitochondriales5.

La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme agent sélectif de perméabilisation de la membraneplasmique 7,et elle a été utilisée avec succès en association avec un analyseur de flux extracellulaire dans plusieurs études7,8,9,10. Nous avons modifié un protocole utilisant rPFO pour filtrer le flux de substrat mitochondrial à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire XFe96. Dans ce protocole, quatre voies d’oxydation de substrat différentes dans deux phénotypes cellulaires sont comparées tout en ayant suffisamment de répliques et le contrôle approprié pour chaque matériau testé.

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Protocole

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1. Un jour avant le test

  1. Préparation des réactifs et des substrats.
    1. Solution d’essai mitochondrial (MAS) : Préparer des solutions mères de tous les réactifs comme décrit dans le tableau 1. Réchauffer les stocks de mannitol et de saccharose à 37 °C pour les dissoudre complètement. Mélanger les réactifs pour préparer 2x MAS, puis chauffer le mélange à 37 °C. Réglez le pH avec 5N KOH à 7,4 (~ 7 mL), puis ajoutez de l’eau pour porter le volume à 1 L. Filtrez stérilisez et conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’au jour de mesure.
    2. Albumine sérique bovine (5 % BSA) : Dissoudre 5 g de BSA dans 90 mL d’eau stérile préavertie sur un agitateur magnétique et éviter les secousses. Réglez le pH à 7,4 avec 5 N KOH, puis ajoutez de l’eau pour porter le volume à 100 mL. Filtrer-stériliser et conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’au jour de la mesure.
    3. Substrats mitochondriaux: Préparer 1 M de solutions mères de succinate de sodium, de pyruvate de sodium et de glutamate de sodium dans de l’eau stérile. Préparer une solution mère de malate de sodium de 100 mM dans de l’eau stérile et utiliser de l’eau stérile préavertie pour préparer une solution mère de palmitoyl carnitine de 10 mM. Ajuster le pH de chaque solution à 7,4 par 5 N KOH et filtrer-stériliser. Conservez les substrats à une température de 2 à 8 °C. Au moment de l’utilisation, chauffer la palmitoyl carnitine à 37 °C pour dissoudre les précipités. Pour une utilisation ultérieure, stocker les aliquotes de tous les substrats à l’exception du pyruvate à -20 °C.
    4. Inhibiteurs mitochondriaux : Utilisez le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer des solutions mères de 25 mM d’oligomycine, de cyanure de carbonyle 50 mM de phénylhydrazone (FCCP), de 20 mM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP), de roténone de 20 mM et d’antimycine A. Conservez les aliquotes à -20 °C.
  2. Ensemencement et traitement des cellules : Comme le montre la figure 2,ensemencez les cellules dans les colonnes 2 à 11. Les colonnes 1 et 12 doivent être laissées vides pour servir de puits d’arrière-plan. Dans ce travail, des cellules HepG2 et A549 ont été utilisées.
    1. Ensemencez les cellules à une densité de 20 000 cellules par puits. Utilisez 50 à 80 μL de milieu de culture cellulaire pour l’ensemencement.
    2. Remplir les puits vierges avec un volume égal de milieu de culture cellulaire et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2. Laissez les cellules se fixer pendant 3 à 4 heures, puis ajoutez 100 μL de milieu de culture cellulaire à tous les puits.
    3. Avec cet ajout final de milieu, appliquez le traitement dans les colonnes 7 à 11. Dans ce travail, le groupe expérimental a été traité avec du chlorhydrate de metformine de 1 mM pendant 16 heures, et le groupe témoin a été traité avec un volume égal d’eau distillée stérile comme contrôle du véhicule.
  3. Hydratation des capteurs : Pipette 200 μL d’eau stérile par puits dans la plaque utilitaire, puis retournez soigneusement la cartouche du capteur tout en immergeant les capteurs dans l’eau. Incuber la cartouche dans un incubateur sans CO2à 37 °C jusqu’au lendemain.
  4. Le modèle de protocole d’essai : Allumez l’analyseur (voir Tableau des matériaux)et l’unité de contrôle. Démarrez le logiciel de contrôle de l’instrument et d’acquisition de données et concevez le protocole d’essai comme décrit dans le tableau 2. Sous Définitions de groupe,créez quatre stratégies d’injection où le port A diffère selon le substrat injecté (Figure 3). Nommez les stratégies d’après les substrats ou leurs abréviations.
  5. Aux ports B, C et D, affectez les composés oligomycine, FCCP et roténone/antimycine A, respectivement. Créez huit groupes et nommez-les comme illustré à la figure 4. Sous Plate Map, affectez les groupes aux puits correspondants, puis enregistrez le protocole en tant que modèle prêt à l’emploi. Laissez l’analyseur allumé pour permettre à la température de se stabiliser pendant la nuit. Gardez l’analyseur dans un endroit où la température est stable pour éviter les changements brusques de température.

2. Le jour de l’essai

  1. Remplacement de l’eau par l’étrier : Jetez l’eau de la plaque de service et pipettez 200 μL d’étrier préavertissé par puits dans la plaque d’utilité. Retournez la cartouche dans l’incubateur sans CO2jusqu’au moment du test. Pour éviter l’évaporation rapide de l’étrier, maintenez une source d’humidité à l’intérieur de l’incubateur et éteignez ou réduisez la vitesse du ventilateur au minimum.
  2. Préparation des solutions de travail: Commencez par réchauffer 2x MAS, 5% de BSA et de l’eau stérile à 37 ° C. Pendant ce temps, laissez les stocks d’inhibiteurs atteindre la température ambiante. Utilisez 2x MAS tiède et de l’eau distillée stérile pour préparer 5 mL de la concentration de travail des substrats et des inhibiteurs comme décrit dans le tableau 3.
  3. Chargement des orifices d’injection : Comme le montre la figure 3,chargez 20 μL des substrats dans le port A. Chargez le mélange succinate/roténone dans le port A des rangées A et B. Chargez le mélange pyruvate/malate dans le port A des rangées C et D. Chargez le mélange glutamate/malate dans le port A des rangées E et F. Chargez le mélange palmitoyl carnitine/malate dans le port A des rangées G et H. Pour l’ensemble de la plaque, charger le port B avec 22 μL de préparation d’oligomycine, le port C avec 25 μL de préparation FCCP et le port D avec 27 μL de mélange roténone/antimycine A.
  4. Démarrage de l’étape d’étalonnage : Sous l’onglet Exécuter le test, cliquez sur Démarrer l’essai pour démarrer le test. Insérez la cartouche de capteur chargée et démarrez l’étape d’étalonnage. Attendez la fin de l’étalonnage avant de passer à l’étape suivante.
  5. Préparation du milieu d’essai (MAS-BSA-rPFO) : Pour préparer 20 mL du milieu d’essai, mélanger 10 mL de 2x MAS, 9,2 mL d’eau stérile et 0,8 mL de BSA à 5 % dans un tube de 50 mL. Ajouter 2 μL de 10 μM rPFO pour atteindre une concentration de 1 nM et remettre le mélange en suspension avec un pipetage doux. Évitez de secouer et n’utilisez pas de mélangeur vortex pour le mélange. Incuber le tube à 37 °C jusqu’au moment de l’utilisation.
  6. Lavage des cellules : Lavez les cellules et les puits vides deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préavertissée sans calcium et sans magnésium à l’aide d’une pipette multicanal. Évitez de réutiliser les mêmes embouts pour éliminer le milieu de culture cellulaire et ajouter du PBS. Effectuez cette étape en dehors du flux laminaire pour protéger les cellules du dessèchement par le flux d’air.
  7. Perméabilisation cellulaire dans le milieu d’essai : À l’aide d’une pipette multicanal, jeter le PBS et le remplacer par 180 μL du milieu d’essai préavertissé (MAS-BSA-rPFO).
  8. Démarrage de la mesure : Immédiatement après la perméabilisation, remplacez la plaque utilitaire de la cartouche de capteur étalonnée par la plaque de cellule et commencez la mesure.

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Résultats

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Commencez par normaliser les résultats à la deuxième mesure de la respiration de base pour afficher des valeurs telles que le pourcentage de taux de consommation d’oxygène (OCR). Les résultats de l’essai sont présentés dans les figures 5, figure 6, figure 7 et figure 8. Il est important d’attribuer les puits de fond appropriés pour chaque groupe et d’inactiver les puit...

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Discussion

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Ce protocole est unemodification des études7,8,9,10 publiées précédemment et du guide de l’utilisateur du produit. Contrairement au protocole du fabricant, 2x MAS est utilisé au lieu de 3x MAS, car 2× MAS est plus facile à dissoudre et ne forme pas de précipitations après le gel. Les aliquotes MAS congelées 2x peuvent être conservées jusqu’à six mois et montrent des résultats cohérents. Une aut...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Les auteurs remercient les membres du personnel du Département de physiologie de la Faculté de médecine de Hradec Králové et du Département de physiopathologie de la Troisième Faculté de médecine pour leur aide à la préparation des produits chimiques et des échantillons. Ce travail a été soutenu par les programmes de subventions de l’Université Charles PROGRES Q40/02, la subvention du ministère tchèque de la Santé NU21-01-00259, la subvention de la Fondation tchèque pour la science 18-10144 et le projet INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financé par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque et par l’Union européenne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adénosine 5&prime ; -diphosphate monopotassique sel dihydratéMerckA5285se conserve à -20 ° ; C
Antimycine AMerckA8674magasin à -20 ° ; C
Albumine sérique bovineMerckA3803se conserve à 2 - 8 ° ; C
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazoneMerckC2920se conserve à -20 ° ; C
DiméthylsulfoxydeMerckD8418magasin chez RT
D-MannitolMerck63559magasin chez RT
Solution saline tamponnée au phosphate de DulbeccoGibco14190-144magasin chez RT
Ethylène glycol-bis(2-aminoéthylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétiqueMerck03777magasin chez RT
HEPESMerckH7523magasin chez RT
L(-)Acide malique sel disodiqueMerckM9138magasin chez RT
L-Acide glutamique sel de sodium hydratéMerckG5889magasin chez RT
Chlorure de magnésium hexahydratéMerckM2670magasin chez RT
OligomycineMerckO4876magasin à -20 ° ; C
Palmitoyl-DL-chlorure de carnitineMerckP4509stocker à -20 ° ; C
Hydroxyde de potassiumMerck484016magasin chez RT
Phosphate de potassium monobasiqueMerckP5655magasin chez RT
RotenoneMerckR8875magasin à -20 ° ; C
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilent technologiesTélécharger à partir de www.agilent.com
Analyseur Seahorse XFe96Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent technologies102416-100XFe96 cartouches de capteur et microplaques de culture cellulaire XF96
Pyruvate de sodiumMerckP2256stocker à 2 - 8 ° ; C
Succinate de sodium dibasique hexahydratéMerckS2378magasin chez RT
SaccharoseMerckS7903magasin chez RT
WaterMerckW3500magasin chez RT
XF calibrantAgilent technologies100840-000magasin chez RT
XF Perméabiliseur à membrane plasmaAgilent technologies102504-100Perfringolysine O recombinante (rPFO) - Aliquote et stocker à -20 ° ; L

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

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Mots-clés

Perm abilisation par la perfringolysine OPerm abilisation cellulaireAnalyseur Seahorse XFRespirom trie sur microplaqueRespiration mitochondrialeRespiration induite par substratTraitement la metformineCellules A549

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