Préparation du cœur et des tissus cérébraux des rongeurs pour la macrophotographie numérique après ischémie-reperfusion

Pendant des décennies, la photographie et l’analyse de spécimens de tissus cardiaques et cérébraux ont été une partie importante des expériences en sciences de la vie. Les progrès de la science et de l’innovation conduisent au développement de microscopes coûteux capables de superrésolution. Les photomicrographies sont obtenues dans un environnement lumineux bien contrôlé en suivant des instructions détaillées. En revanche, la macrophotographie (à un grossissement de 1:2 ou plus) est souvent effectuée dans un environnement lumineux incontrôlé à l’aide de configurations d’imagerie inappropriées. Souvent, les techniques de préparation des échantillons et de configuration de la caméra doivent être considérablement optimisées. En conséquence, des photographies macro de qualité limitée ont été largement publiées dans des revues scientifiques. Une résolution d’image et un contraste insuffisants limitent les possibilités de quantification précise de l’image dans les études IR.

Les procédures expérimentales des infarctus du ^myocarde1,2 et du ^cerveau3,4 ont été décrites en détail. Le but de cette étude est de fournir un guide étape par étape sur la façon de mettre en place un système de photographie et d’analyse standardisée des échantillons de tissus cardiaques et cérébraux de rongeurs après des expériences d’infarctus. Cela comprend le tranchage des tissus, la coloration et la macrophotographie d’échantillons de cœur et de cerveau. La préparation d’échantillons de tissus est une partie essentielle de l’expérience, et les résultats de l’analyse d’image planimétrique dépendent fortement de la qualité des images ^obtenues5.

Ces méthodes sont particulièrement utiles pour effectuer des mesures et des analyses planimétriques d’images dans les tissus de rongeurs et pourraient être utiles pour la macrophotographie scientifique générale. De plus, la haute qualité et la cohérence des images permettent d’effectuer une analyse automatisée des photographies numériques, ce qui permet de gagner du temps, d’éviter les entrées de l’utilisateur et de minimiser le risque d’erreurs ou de biais lors de l’analyse d’images. Cela se traduira par la génération de données robustes et fiables et augmentera la traduction des découvertes précliniques en nouveaux traitements antiischémiques dans les cliniques.

Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives de la Communauté européenne et aux lois et politiques locales (directive 2010/63/UE), et toutes les procédures ont été approuvées par le Service alimentaire et vétérinaire de Riga, Lettonie.

1. Coloration et tranchage du cœur

REMARQUE: Les techniques décrites dans ce protocole peuvent être utilisées après des tests isolés de cœur de rat ou de souris perfusés par ^{Langendorff6,7} et des tests in vivo de lésions cardiaques de rat ^IR8,9,10,11. Pour la coloration après un test de lésion IR in vivo, on suppose que le cœur est excisé, monté sur une canule et brièvement perfusé en mode de perfusion de Langendorff.

1. Détachez la canule cardiaque de la seringue remplie de solution de Krebs-Henseleit et connectez-la à une seringue remplie d’une solution chaude (37 °C) de bleu de méthylène à 0,1 % dans une solution de Krebs-Henseleit. Utilisez une seringue de 5 mL pour les cœurs de rats et une seringue de 1 à 2 mL pour les cœurs de souris.
   REMARQUE: Une alternative consiste à remplir l’appareil à pression ou à débit contrôlé (par exemple, Langendorff) avec une solution contenant du colorant bleu. Pendant la procédure de détachement et de montage, il est essentiel de ne pas laisser de bulles d’air dans la canule et de ne pas desserrer la suture utilisée pour la réocclusion de l’artère coronaire.
2. Perfuse également les cœurs de rats avec 4 mL de la solution de bleu de méthylène à un taux d’environ 4 mL / min et perfuser les cœurs de souris avec 1 mL de solution de bleu de méthylène à un taux d’environ 0,5-1 mL / min.
   REMARQUE: D’après l’expérience, les deux techniques sont sûres et fournissent une coloration adéquate; cependant, l’utilisation d’une pompe à pression contrôlée / système de pression hydrostatique est une option plus longue mais plus sûre contre les dépassements de surface pour les scientifiques novices.
3. Débranchez la canule de la seringue et retirez le cœur de la canule.
4. Enlever l’excès de bleu de méthylène en roulant doucement le cœur sur du papier de soie. Desserrez la ligature autour de l’artère coronaire en ouvrant la pince hémostatique et en retirant le tube en plastique de la suture chirurgicale seulement après avoir enlevé l’excès de bleu de méthylène.
   REMARQUE: À ce stade, il est possible de placer le cœur de la souris dans un petit sac en plastique ou un microtube centrifuge de 5 mL au congélateur (-20 ° C) jusqu’à 5-10 min. Le temps de congélation maximal doit être déterminé expérimentalement dans chaque laboratoire. La congélation à court terme d’un cœur de souris peut aider un expérimentateur novice à le couper en tranches de 1 mm d’épaisseur. La congélation des cœurs de rat n’est pas recommandée. Le dégel de plus de 10 min à -20 °C doit être évité.
5. Placez le cœur de rat taché dans une matrice en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) pour le tranchage du cœur (Figure 1A). Ensuite, coupez les ventricules du cœur en tranches de 2 mm d’épaisseur (visez 6 à 7 tranches d’un cœur de rat adulte). Pour les cœurs de souris, coupez les ventricules du cœur en tranches de 1,5 mm d’épaisseur (visez au moins 4 tranches d’un cœur de souris adulte).
   REMARQUE: Des lames de rasoir compatibles avec la matrice de tranchage doivent être utilisées. En général, des lames de rasoir à un seul tranchant compatibles (par exemple, une épaisseur allant jusqu’à 0,01 pouce (0,254 mm)) peuvent être utilisées pour trancher des cœurs de rat. Les lames de rasoir à double tranchant sont généralement utilisées pour les cœurs de souris et ont généralement jusqu’à 0,004 pouce (0,1 mm) d’épaisseur.

Figure 1 : Matrices pour le découpage du cœur et du cerveau du rat. (A) Cœur de rat, (B) cerveau de rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Après la coupe, transférer les tranches dans un tube en plastique de 15 mL. Ajouter 5 mL de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 1 % dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube avec les tranches de cœur, et incuber pendant 10 min au bain-marie à 37 °C.
7. Après l’incubation dans une solution de TTC, lavez les tranches de cœur au moins 2 à 3 fois avec pbS et préparez-vous à la capture d’images.

2. Coloration et tranchage du cerveau

1. Après l’expérience d’occlusion de l’artère cérébrale ^moyenne3,12, retirez le cerveau, y compris le tronc cérébral, du crâne et lavez-le dans du PBS glacé.
2. Choisissez la bonne taille de la matrice cérébrale en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) en fonction du poids des animaux (Figure 1B). Placez le cerveau avec son côté ventral vers le haut dans la matrice cérébrale.
   REMARQUE: Lorsqu’il est assis dans la matrice, la surface ventrale du cerveau doit être parallèle à la surface supérieure du moule.
3. À l’aide de lames, limitez les parties frontale et caudale (2 lames des deux côtés) du cerveau.
   REMARQUE: Des lames de rasoir compatibles avec la matrice de tranchage doivent être utilisées. En général, une lame de rasoir compatible à un seul tranchant (épaisseur allant jusqu’à 0,01 pouce (0,254 mm)) peut être utilisée pour le tranchage du cerveau de rat.
4. Placez les lames partiellement (ne coupant pas complètement le cerveau) dans les canaux entre la première et la dernière lame. Lorsque toutes les lames sont insérées et disposées en parallèle, appuyez sur toutes les lames avec la paume en même temps pour couper le cerveau en tranches coronales de 2 mm.
5. Saisissez fermement les lames le long des côtés avec deux doigts et retirez-les avec le cerveau tranché de la matrice.
6. Disposer les tranches de cerveau une par une dans un plateau (70 mL, 72 x 72 mm). Lors de la disposition des tranches, assurez-vous que la surface antérieure de chaque tranche est toujours tournée vers le haut.
7. Versez la solution chaude (+37 °C) de TTC à 1 % dans du PBS sur les tranches de cerveau et incubez-les pendant 8 min à 37 °C dans l’obscurité.
   REMARQUE: Les tranches de cerveau doivent être complètement immergées dans une solution de TTC pendant l’incubation.
8. Après l’incubation dans une solution de TTC à 1%, transférez les tranches de cerveau dans le plateau en plastique bleu pour capturer des images. Organisez les tranches de cerveau dans l’ordre séquentiel de la partie frontale à la partie caudale et utilisez un scalpel pour séparer les hémisphères dans le plan sagittal.
   REMARQUE: La surface du plateau doit être lavable, mate et d’une couleur qui contraste avec les tranches de cerveau (c’est-à-dire pas rouge, blanc ou rose pâle).

3. Macro photographie

1. Photographiez les tranches de tissu immédiatement après la coloration.
   REMARQUE: Les tranches de cœur peuvent être conservées dans du PBS froid (à +4 ° C) ou une solution de formol jusqu’à 30 min. Les tranches de cerveau peuvent être stockées dans le formol pendant une période prolongée (1-2 semaines).
2. Configurez l’appareil photo de votre choix avec une batterie chargée, une carte mémoire et un objectif connecté sur un support (Figure 2)
   REMARQUE: Allumez les lumières au moins 5 à 10 minutes avant l’acquisition de l’image pour réchauffer l’équipement. Les lumières LED atteignent leur pleine luminosité en microsecondes.

Figure 2 : Appareil photo et lumières configurés pour la photographie macro. La caméra est perpendiculaire à la surface d’imagerie pour s’assurer que le plan focal de la caméra est parallèle aux échantillons. Abréviation : LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. En fonction des sources lumineuses disponibles, sélectionnez les paramètres de balance des blancs appropriés ou effectuez l’étalonnage de la température de couleur conformément aux instructions du manuel de l’appareil photo.
   REMARQUE: La lumière LED blanche (température de couleur 6 500 K) est la source de lumière préférée pour éviter le scintillement de la lumière par les ampoules fluorescentes.
4. Basculez l’appareil photo en mode entièrement manuel, réglez l’ISO 100 et l’ouverture sur f/10 et ajustez la vitesse d’obturation pour une exposition optimale de l’image. Assurez-vous que le plan focal de la caméra est parallèle à la surface où l’échantillon sera placé.
   REMARQUE: La fonction d’histogramme est utile pour s’assurer que les tranches de tissu ne sont pas surexposées.
5. Fixez ou activez un déclencheur à distance filaire ou sans fil pour empêcher le tremblement de l’appareil photo lorsque l’obturateur est relâché.
   REMARQUE: Une alternative consiste à activer une fonction d’obturation retardée, ce qui retardera la gâchette de 2 ou 10 s après avoir appuyé sur le bouton de déclenchement.
6. Immergez complètement les tranches de cœur dans un récipient avec PBS.
   REMARQUE: Les toboggans immergés ont tendance à flotter loin de leur position. Pour minimiser le flottement des tranches, utilisez le plus petit plateau possible dans lequel toutes les tranches peuvent tenir et la quantité minimale de solution d’immersion, en veillant à ce que l’échantillon soit complètement immergé. D’autres méthodes incluent le placement des tranches entre les lames de verre ou l’utilisation d’un filtre polarisant sur la lentille. Un filtre polarisant circulaire est fixé à l’objectif et pivoté jusqu’à ce que les reflets dans un affichage en direct de la caméra disparaissent.
7. Disposez les tranches de cerveau dans un plateau sec sans PBS ni autres liquides.
   REMARQUE: Un filtre polarisant est très pratique pour capturer des images de tranches de cerveau.
8. Placez le récipient avec des tranches sous l’appareil photo avec l’objectif macro et assurez-vous que toutes les tranches s’adaptent parfaitement au champ de vision. Assurez-vous que les tranches sont sur le même plan, c’est-à-dire qu’elles ne sont ni courbées ni roulées.
9. Vérifiez l’exposition et ajustez les paramètres de l’appareil photo si nécessaire.
   REMARQUE: Une fois réglé, ne modifiez pas l’exposition et les autres paramètres pendant toute l’expérience.
10. Capturez le numéro (ou toute autre identification) de l’échantillon et imagez la tranche de tissu à l’aide d’un déclencheur à distance.
    REMARQUE: Un marqueur de taille, tel qu’une règle de mm, doit être inclus dans le champ de vision lorsque la quantification absolue de la taille de l’échantillon est nécessaire.
11. Faites pivoter les tranches et capturez leurs images de l’autre côté.

La figure 3A est une photographie d’une tranche cardiaque colorée au bleu de méthylène et au TTC après un infarctus du myocarde, qui contient suffisamment de détails et d’informations sur la couleur pour une analyse planimétrique plus approfondie de la taille de l’infarctus (figure 3B). Nous avons testé comment la congélation du cœur pendant 24 heures affecte l’intégrité des tissus cardiaques (Figure 3C). La congélation pendant une période prolongée (>1 h, figure 3C) réduit la fonction mitochondriale; ainsi, la coloration du cœur par TTC n’est pas rouge mais rose pâle, et la frontière entre les tissus nécrotiques et viables est floue (figure 3C).

En outre, deux méthodes ont été comparées pour la réduction des réflexions dans les échantillons. L’immersion est la méthode la plus efficace et produit des images détaillées avec un bon contraste (Figure 4A). La deuxième méthode consiste à utiliser un filtre polarisant fixé à la lentille. Le filtre polarisant est également efficace; cependant, le filtre réduit légèrement la résolution et le microcontraste de l’image (Figure 4B). Un exemple d’image d’une tranche de cœur sans immersion ni filtre (Figure 4C) contient de nombreuses réflexions et ne convient pas à une analyse plus approfondie.

Les tranches de cerveau ne sont pas immergées en raison de problèmes de gestion des tranches (flottantes). Dans l’analyse planimétrique, il est important de comparer le côté non affecté (sain) du cerveau (figure 5A) avec le côté affecté par l’AVC (figure 5B). Les tranches de cerveau sont plus faciles à gérer sur une plaque ou un plateau sec, et un filtre polarisant est utilisé pour éliminer les reflets. Un plateau avec fond bleu est utilisé pour la photographie de tranches de cerveau (sélection d’arrière-plan décrite précédemment5).

Les réglages manuels de l’appareil photo ont été utilisés pour assurer un contrôle total de l’exposition et de la balance des blancs. Les réglages de la caméra doivent être ajustés avant ou au début de l’expérience en fonction de la source lumineuse disponible. Cela garantit une exposition et une balance des blancs optimales de toutes les images pour permettre une analyse uniforme (Figure 6A). Les réglages automatiques de l’appareil photo ne sont pas parfaits et peuvent entraîner des paramètres variables de l’appareil photo, provoquant des résultats inappropriés et l’introduction d’une variabilité d’image à image.

La figure 6 montre des exemples d’images surexposées (figure 6B) et sous-exposées (figure 6C) de tranches de cœur. Une attention suffisante doit être accordée aux paramètres de balance des blancs corrects de l’appareil photo pour correspondre à une source lumineuse particulière utilisée dans la configuration de l’éclairage de l’appareil photo. Des réglages de balance des blancs incorrects peuvent entraîner un décalage vers le bleu ou le jaune (Figure 6D) et le magenta ou le vert (Figure 6E) dans l’image.

Figure 3 : Images de tranches cardiaques de rat. (A) Une tranche de cœur fraîche a été analysée dans le logiciel ImageProPlus 6.3 à l’aide de la segmentation des couleurs (B). (C) La coloration TTC fait une mauvaise distinction entre le tissu viable et le tissu nécrotique dans la tranche de cœur congelée (congelée pendant 24 h). Abréviation : TTC = chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Techniques de réduction des réflexions. Image de tranche de cœur de rat capturée immergée dans PBS (A) et utilisant un filtre polarisant (B). (C) Tranche de cœur avec reflets lorsque ni immersion ni filtre n’est utilisé. Abréviation = PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images de tranches de cerveau de rat. Le cerveau du rat a été coupé en sept tranches et coloré avec TTC après ischémie-reperfusion. L’utilisation d’un filtre polarisant permet d’obtenir une image sans réflexion. (A) Tranches de l’hémisphère intact ; (B) Tranches de l’hémisphère affecté par l’AVC. Abréviation : TTC = chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Images de tranches de cœur de rat. Correctement (A) et incorrectement (B-E) capturé des images de tranches de cœur. Des paramètres d’exposition incorrects entraînent une surexposition (B) et une sous-exposition des images (C). Des réglages de balance des blancs incorrects entraînent une diffusion jaune (D) ou verte dans l’image (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.