Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.
Abstract
Recente verbeteringen in de sequencing van de volgende generatie hebben de kennis van onderzoekers over moleculaire en cellulaire biologie verbeterd, met verschillende studies die nieuwe paradigma's in de vasculaire biologie onthullen. Het toepassen van deze methoden op modellen van vasculaire ontwikkeling vereist de optimalisatie van celisolatietechnieken uit embryonale en postnatale weefsels. Celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid moeten allemaal maximaal zijn om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen van de volgende generatie sequencingbenaderingen. Het neonatale retinale vascularisatiemodel van de muis wordt door onderzoekers gebruikt om mechanismen van vasculaire ontwikkeling te bestuderen. Onderzoekers hebben dit model gebruikt om mechanismen van angiogenese en arteriaal-veneuze lotspecificatie tijdens bloedvatvorming en rijping te onderzoeken. Het toepassen van sequencingtechnieken van de volgende generatie om het retinale vasculaire ontwikkelingsmodel te bestuderen, vereist optimalisatie van een methode voor de isolatie van retinale endotheelcellen die de celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid maximaliseert. Dit protocol beschrijft een methode voor murine retinale weefselisolatie, spijsvertering en zuivering met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De resultaten geven aan dat de FACS-gezuiverde CD31+/CD45-endotheelcelpopulatie sterk verrijkt is voor endotheelcelgenexpressie en gedurende 60 minuten na FACS geen verandering in levensvatbaarheid vertoont. Inbegrepen zijn representatieve resultaten van next-generation sequencing benaderingen op endotheelcellen geïsoleerd met behulp van deze methode, inclusief bulk RNA sequencing en single-cell RNA sequencing, wat aantoont dat deze methode voor retinale endotheelcelisolatie compatibel is met next-generation sequencing toepassingen. Deze methode van retinale endotheelcelisolatie zal geavanceerde sequencingtechnieken mogelijk maken om nieuwe mechanismen van vasculaire ontwikkeling te onthullen.
Introduction
De hoge doorvoercapaciteit van het sequentiëren van nucleïnezuren via next-generation sequencing-benaderingen heeft de kennis van onderzoekers over moleculaire en cellulaire biologie enorm verbeterd. Deze geavanceerde technieken omvatten whole transcriptome RNA sequencing, DNA sequencing van doelgebieden om Single Nucleotide Polymorphisms (SNP's) te identificeren, DNA sequencing van gebonden transcriptiefactoren in Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) sequencing, of open chromatine regio's in Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sequencing, en single-cell RNA sequencing1 . In de vasculaire biologie hebben deze ontwikkelingen onderzoekers in staat gesteld om gecompliceerde mechanismen van ontwikkeling en ziekte op te helderen, samen met onderscheidende genexpressiepatronen langs een continuüm van verschillende fenotypen 2,3. Toekomstige experimenten kunnen complexe mechanismen verder definiëren door de volgende generatie sequencing te combineren met geëvalueerde modellen van vasculaire ontwikkeling, maar de methoden voor monstervoorbereiding moeten compatibel zijn met de geavanceerde sequencingtechnieken.
De kwaliteit, nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de volgende generatie sequencingbenaderingen zijn afhankelijk van de methode van monstervoorbereiding. Bij het isoleren van een subset van cellen of het genereren van eencellige suspensies uit weefsels, zijn optimale verterings- en zuiveringsmethoden essentieel voor het maximaliseren van het celaantal, de levensvatbaarheid en de zuiverheid van de celpopulatie 4,5. Dit vereist een balans in de verteringsmethode: een sterke spijsvertering is nodig om cellen uit het weefsel vrij te maken en voldoende cellen te verkrijgen voor stroomafwaartse benaderingen, maar de levensvatbaarheid van cellen zal negatief worden beïnvloed als de spijsvertering te sterk is 6,7. Bovendien is zuiverheid van de celpopulatie noodzakelijk voor robuuste resultaten en nauwkeurige analyse van gegevens, die kunnen worden bereikt via FACS. Dit benadrukt het belang van het optimaliseren van celisolatiemethoden om next-generation sequencing toe te passen op gevestigde modellen van vasculaire ontwikkeling.
Een goed gekarakteriseerd model voor het onderzoeken van vasculaire ontwikkeling is het murine retinale vasculaire ontwikkelingsmodel. Murine retinale vasculatuur ontwikkelt zich postnataal in een tweedimensionale oppervlakkige plexus, met initiële angiogene kieming uit de oogzenuw zichtbaar op postnatale dag (P)3, angiogene front met stengel- en tipcellen en initiële vaatrijping zichtbaar bij P6, en rijping van de vasculaire plexus zichtbaar na P9 8,9. Tijdens de remodellering van de initiële vasculaire plexus ondergaan endotheelcellen specificatie voor arteriële, capillaire en veneuze fenotypen in verschillende vaten om een bloedsomloopnetwerk te genereren 10,11. Daarom stelt deze methode onderzoekers in staat om angiogene vasculaire plexusvorming en endotheel arteriële-veneuze specificatie en rijping op verschillende tijdstippen tijdens ontwikkeling9 te visualiseren. Daarnaast biedt dit model een methode voor het onderzoeken van de effecten van transgene manipulatie op angiogenese en vasculaire plexusontwikkeling, die is toegepast voor het onderzoek naar vasculaire ontwikkeling, arteriaal-veneuze malformaties en zuurstof-geïnduceerde neovascularisatie 12,13,14,15,16 . Om de volgende generatie sequencingbenaderingen te combineren met het murine retinale vasculaire ontwikkelingsmodel, is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van endotheelcellen uit netvliesweefsel noodzakelijk.
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor het verteren van netvliesweefsel van muizen op P6 om de celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid te maximaliseren. Retinaal weefsel wordt geïsoleerd uit P6-muizen, gedurende 20 minuten verteerd, immunostained voor CD31 en CD45 en gezuiverd door FACS om een eencellige suspensie van endotheelcellen in ongeveer 2,5 uur te isoleren (figuur 1A). Deze endotheelcellen bleken gedurende 60 minuten na isolatie17 een hoge levensvatbaarheid te behouden, waardoor bibliotheekvoorbereidingen voor sequencingmethoden van de volgende generatie mogelijk waren. Daarnaast worden representatieve resultaten verstrekt voor FACS gating en kwaliteitscontroleresultaten van twee afzonderlijke next-generation sequencingmethoden met behulp van dit isolatieprotocol: whole transcriptome RNA sequencing en single-cell RNA sequencing. Deze methode maakt het mogelijk om next-generation sequencingbenaderingen te gebruiken in combinatie met het retinale vascularisatiemodel om nieuwe mechanismen van vasculaire ontwikkeling op te helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Care and Use Committees van Yale University en de University of Virginia hebben alle dierproeven goedgekeurd die in dit protocol worden vermeld.
1. Verkrijg muizenogen voor retinale isolatie
- Bereid 1x ijskoude PBS en voeg 500 μL toe aan elk putje van een 48-well plaat.
- Euthanaseer neonatale muizen op postnatale dag zes (P6) volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen. Voor dit experiment worden nesten van ongeveer 4-8 neonatale muizen geëuthanaseerd op P6 via isofluraaninhalatie gedurende ten minste drie minuten na de ademstilstand, gevolgd door onthoofding.
- Verwijder de ogen van elk van de muizen. Snijd de huid en het membraan over het oog weg door loodrecht op het ooglid te snijden met een dissectieschaar. Gebruik vervolgens een tang om zachtjes boven en onder het oog naar beneden te drukken, zodat het oog uit de oogkas beweegt.
- Knijp voorzichtig onder het oog met de tang en snijd de oogzenuw door die het oog vasthoudt. Plaats vervolgens elk oog in de 48-well plaat in de bereide 1x ijskoude PBS totdat het oogsten is voltooid.
OPMERKING: Gebruik één put per muis, met beide ogen van een enkele muis in dezelfde put.
- Knijp voorzichtig onder het oog met de tang en snijd de oogzenuw door die het oog vasthoudt. Plaats vervolgens elk oog in de 48-well plaat in de bereide 1x ijskoude PBS totdat het oogsten is voltooid.
2. Isoleer netvliesweefsel van muizen
- Vul een petrischaaltje, bekleed met een dissectiepad aan de onderkant, met 500 μL 1x ijskoude PBS om de ogen onder te dompelen en onder een dissectiemicroscoop te plaatsen die is ingesteld op 4,0x vergroting.
- Hang de ogen in het dissectiepad met behulp van een transferpipet met een brede punt om de ogen niet te beschadigen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de ogen volledig bedekt zijn met PBS.
- Hang de ogen in het dissectiepad met behulp van een transferpipet met een brede punt om de ogen niet te beschadigen.
- Gebruik twee fijne dissectietangen om de oogzenuw vast te houden met een van de tangen voor stabilisatie en met de tweede tang een gat door de voorste kamer te prikken waar het hoornvlies en de sclera met elkaar verbonden zijn (figuur 1B). Scheur het gat in een cirkel ongeveer 75% van de weg rond het hoornvlies.
- Terwijl u de oogzenuw nog steeds vasthoudt met een van de tangen, gebruikt u de tweede tang om de sclera voorzichtig van het netvliesweefsel af te scheuren.
- Zoals hierboven, gebruik de tweede tang om voorzichtig het glasachtig lichaam van het netvliesweefsel af te scheuren.
- Nogmaals, verwijder met behulp van de tweede tang voorzichtig de lens en plexus hyaluzolvaten die niet loskwamen toen het glasachtig lichaam werd verwijderd. Om dit te doen, reik je met een open tang naar het netvlies totdat je bijna het netvlies raakt, sluit je de tang om de lens- en hyalievliesplexusvaten te pakken en trek je de tang uit het netvlies. Dit kan worden herhaald totdat alle vaten zijn verwijderd.
OPMERKING: De plexus hyaloid lijkt op een heldere, webachtige structuur.
- Vul 2 ml microcentrifugebuizen met 500 μL 1x ijskoude PBS en plaats de netvliezen in de buizen. Isoleer alle netvliezen van de ogen en plaats ze in ijskoude PBS voordat je verder gaat.
OPMERKING: Gebruik één buis per muis, waarbij twee netvliezen van dezelfde muis een buis delen. Als netvliesweefsel is gescheurd, breng het dan in meerdere stukken over. De totale tijd van retinale weefseldissectie voor een nest muizen moet 15-60 minuten duren, beginnend met euthanasie en eindigend met definitieve retinale weefselisolatie.
Figuur 1: Overzicht van het isolatieprotocol. (A) Schema van de isolatietijdlijn met een geschatte tijd voor elke stap: Isolatie van netvliesweefsel, Digest, Antilichaamkleuring, FACS en Cel levensvatbaarheidsvenster. (B) Stapsgewijze handleiding voor isolatie van netvliesweefsel uit het oog, met genummerde dissectiestappen: 1) hoornvlies doorboren, 2) hoornvlies scheuren, 3) scheursclera, 4) sclera van het netvlies verwijderen, 5) sclera en verbindingsweefsel verder van het netvlies verwijderen, 6) het glasvochtlichaam en de glasvochtvaten van het netvlies verwijderen. (C) Representatieve beelden van netvliesweefsel tijdens verschillende spijsverteringsstappen: Pre-digest, Post-digest, Pellet (zwarte pijlen markeren netvliesweefsel of celpellet). Opnieuw gepubliceerd met toestemming van Chavkin et al. gepubliceerd in S. Karger AG, Basel17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Verwerk netvliesweefsel in een eencellige suspensie
- Bereid 500 μL verteringsoplossing voor elke twee geïsoleerde netvliezen. Voeg FBS en Collagenase Type II toe aan DMEM tot een eindconcentratie van 10% FBS en 1 mg/ml Collagenase Type II. Meng en verwarm de oplossing tot 37 °C met behulp van een waterbad.
- Verwijder overtollige PBS uit de 2 ml microcentrifugebuizen door voorzichtig te pipetteren. Laat voldoende PBS over om het netvliesweefsel volledig te bedekken, ongeveer 100 μL in elke buis.
- Voeg 500 μL van de spijsverteringsoplossing toe aan elke buis met netvliesweefsel (figuur 1C).
- Gebruik een P1000 pipettor en pipetpunt om vijf keer op en neer te pipetteren in het netvliesweefsel in de spijsverteringsoplossing.
- Incubeer het digestiemengsel in een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten.
- Gebruik een P1000 pipettor en pipetpunt om het digestiemengsel elke 5 minuten op en neer te pipeten. Na incubatie is het netvliesweefsel opgelost in een eencellige suspensie, dus het spijsverteringsmengsel moet troebel zijn (figuur 1C).
4. Cellen tellen
- Zet een tafelcentrifuge op 4 °C en plaats de buizen van het digestiemengsel erin. Pelleteer het digestiemengsel door centrifugeren bij 375 x g gedurende 5 min.
- Verwijder de supernatantverteringsoplossing voorzichtig door te pipetteren. Verstoor de celpellet niet (figuur 1C). Suspensie de pellet opnieuw in 500 μL ijskoude 1x PBS door voorzichtig op en neer te mengen met de pipet.
- Tel de cellen met een hemocytometer onder een microscoop.
OPMERKING: Het aantal cellen is ongeveer 1 x 106 cellen per twee netvliezen. - Zorg ervoor dat de cellen op de juiste manier worden geresuspendeerd door voorzichtig mengen en vervolgens 20 μL celsuspensie in drie buizen te gieten voor controlekleuring (buis 1: IgG-controle, buis 2: CD31-controle en buis 3: CD45-controle), zoals eerder beschreven en gebruikt17,18.
- Zet een tafelcentrifuge op 4 °C en plaats er buisjes met cellen in. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 375 x g gedurende 5 min.
5. Immunostain de cellen met antilichamen
- Bereid 100 μL kleuringsbuffer voor per twee netvliezen gekleurd plus vier controlebuizen. Voeg FBS, HEPES en D-Glucose toe aan de HBSS-buffer tot een eindconcentratie van 10% FBS, 10 mM HEPES en 1 mg/ ml D-Glucose.
- Verkrijg fluorescerend geconjugeerde antilichamen tegen CD31 en CD45. Voeg de antilichamen toe bij een verdunning van 1:100 in de kleuringsbuffer (alleen buis 1: IgG-antilichaam, alleen buis 2: CD31-antilichaam en alleen buis 3: CD45-antilichaam). Voeg 1 μL antilichaam toe per 100 μL van de kleuringsbuffer voor een uiteindelijke antilichaamconcentratie van 2 μg/ml.
- Verwijder de PBS voorzichtig uit de gewassen celpellet door te pipetteren.
- Resuspendeer de pellet in 100 μL antilichaamkleuringsoplossing per 0,5 x 106 cellen.
- Incubeer de eencellige suspensie met de antilichaamkleuringsoplossing gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Tik elke 10 minuten op de buisjes om de cellen voorzichtig te mengen.
6. Bereid je voor op het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen
- Zet een tafelcentrifuge op 4 °C en plaats de buisjes met cellen erin. Pelletcellen door centrifugatie bij 375 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer deze cellen in 500 μL van 1x PBS om te wassen.
- Zet een tafelcentrifuge op 4 °C en plaats de buisjes met cellen erin. Pelletcellen door centrifugeren bij 375 x g gedurende 5 min
- Bereid 1,5 ml FACS-buffer (1% FBS in 1x PBS).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 300 μL FACS Buffer door voorzichtig te mengen met een pipettor.
- Voeg propidiumjodide (PI) toe aan de monsterbuizen die de FACS-buffer bevatten tot een eindconcentratie van 0,5 μg/ml. PI wordt gebruikt als een levensvatbaarheidsmarker.
- Breng de celsuspensies over en combineer ze in 5 ml reageerbuizen door een klikdop van een celzeef. De klikdop van de celzeef moet een filter van 35 μm bevatten en de celsuspensies kunnen rechtstreeks op het filter worden gepipetteerd.
- Houd de FACS-buizen in het donker op ijs en breng ze over naar de celsorteerder.
7. Het FACS-instrument instellen
- Installeer een mondstuk van 100 μm in een FACS-instrument.
OPMERKING: Dit formaat mondstuk minimaliseert het verzamelvolume en maximaliseert de geïsoleerde celdichtheid. - Bereid 250 μL 1x PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml als een opvangbuis die in het FACS-instrument moet worden geïnstalleerd.
8. Isoleer levensvatbare endotheelcellen via FACS
- Schakel het FACS-instrument en de computer in. Klik op het pictogram FACS-software om de FACS-software op de computer te openen om het FACS-instrument uit te voeren en te bedienen. Voer routinematige kwaliteitscontroletests uit.
- Laad de met controle bevlekte monsters in het FACS-instrument om de assen aan te passen. Begin met IgG-antilichaam alleen cellen om FSC en SSC te genereren en aan te passen, dan CD31-antilichaam alleen om CD31 te genereren en aan te passen, en dan CD45-antilichaam alleen om CD45 te genereren en aan te passen. Leg gegevens vast uit controlemonsters.
- Laad gekleurde monstercellen in het FACS-instrument en voer het monster uit.
- Poort de cellen op basis van forward-scatter en side-scatter (respectievelijk FSC-A en SSC-A) parameters (figuur 2A).
OPMERKING: De FSC-A- en SSC-A-parameters worden gebruikt om cellen te selecteren op basis van grootte, dichtheid, granulariteit, oppervlakte-eigenschappen en brekingsindex. - Poort cellen door FSC-A en FSC-H om cel doubletten te identificeren en alleen enkele cellen te verzamelen (figuur 2A).
OPMERKING: De FSC-A- en FSC-H-parameters worden gebruikt om afzonderlijke cellen te selecteren op basis van het principe dat celdubbelen tijdens voorwaartse verstrooiing druppels zijn met een grotere oppervlakte-hoogteverhouding. - Poort cellen door PI en SSC-A om levensvatbare cellen te identificeren (figuur 2A).
OPMERKING: Levensvatbare cellen zullen PI-negatief zijn. - Maak een CD31+/CD45-poort met bedieningselementen en poortcellen van CD31 en CD45 (Figuur 2A,B).
- Plaats een opvangbuis met 250 μL FACS-buffer.
- Begin met het sorteren van cellen die CD31-positief/CD45-negatief zijn in de geïnstalleerde opvangbuis.
- Bewaar de verzamelbuizen op ijs voor verdere analyse. Monsters kunnen in deze stap1 worden verwerkt voor sequencingtoepassingen van de volgende generatie.
9. Voer een levensvatbaarheidstest uit
- Meng 10 μL cellen met 10 μL 0,4% trypan blue oplossing om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen.
- Tel levensvatbare cellen door het gekleurde mengsel op een hemocytometerdia te pipetteren. Plaats de dia onder een microscoop voor nauwkeurige tellingen van de levensvatbaarheid. Tel blauwe cellen als niet-levensvatbaar en tel heldere cellen als levensvatbaar.
- Deel het aantal levensvatbare cellen door het totale aantal cellen om het percentage levensvatbaarheid te berekenen.
10. Voer genexpressietest uit
- Verkrijg 10.000-20.000 cellen per monster en voer RNA-isolatie uit om de genexpressie van murine retinale endotheliale cellen te analyseren. RNA-isolatie wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare kit die op ethanol gebaseerde RNA-precipitatie gebruikt, en vervolgens centrifugatie en membraankolommen om gezuiverd RNA uit cellysaat te wassen en te elueren. Monsters kunnen worden verwerkt voor sommige sequencingtoepassingen van de volgende generatie in deze stap1.
- Converteer het RNA naar cDNA met behulp van reverse transcriptase-enzym en ondersteunende reagentia19.
- Kwantificeren met behulp van een DNA-bindende kleurstof en een kwantitatieve PCR (qPCR) machine20. Laad cDNA-monsters in een 384-well qPCR-plaat met primers om interessante genen te versterken. Het reactievolume moet in totaal 10 μL bedragen, inclusief DNA-bindende kleurstof, die zal worden gebruikt om genversterking te kwantificeren.
- Gebruik CD31, VE-Cadherine, CD45 en β-actine voorwaartse en omgekeerde primers om genexpressie te meten.
- Gebruik het voorbeeld voor sequencingtoepassingen van de volgende generatie1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vertering van netvliesweefsel en immunostaining voor CD31 en CD45 resulteert in een identificeerbare populatie van CD31+/CD45-endotheelcellen na gating voor cellen, enkele cellen en levensvatbaarheid (figuur 2A). CD45 immunostaining is nodig om CD31+/CD45+ cellen te elimineren, waaronder bloedplaatjes en sommige leukocyten21. Voor elk experiment moeten controles worden uitgevoerd om de specificiteit van antilichamen aan te tonen en de gatingstrategie te sturen (figuur 2B). Dit percentage is relatief laag, ongeveer 0,5%-1,0% van alle cellen in de verteerde eencellige suspensie.
Levensvatbaarheid en zuiverheid kunnen worden beoordeeld door kwantificering van propidiumjodidekleuring en genexpressieanalyse van RNA geïsoleerd uit verschillende populaties. Variërende verteringstijd beïnvloedt de celopbrengst en het levensvatbaarheidspercentage, waarbij 20 minuten verteringstijd resulteert in een optimale opbrengst met een laag percentage niet-levensvatbare endotheelcellen (figuur 3A). Geïsoleerde endotheelcellen bleven levensvatbaar gedurende 60 minuten na isolatie, zoals gemeten door daaropvolgende propidiumjodidekleuring (figuur 3B). De zuiverheid van de celpopulatie werd beoordeeld door middel van qPCR-analyse van de expressie van endotheelcelgenen (CD31 en VE-Cadherine) in vergelijking met leukocytspecifiek CD45 genormaliseerd tot β-actine (ActB), met een sterke verrijking voor endotheelcelgenen in de CD31+/CD45-populatie (figuur 3C).
Geïsoleerde endotheelcellen uit dit protocol kunnen worden gebruikt in sequencingtechnieken van de volgende generatie. Het zuiveren van RNA uit de geïsoleerde endotheelcellen, het omzetten en versterken van cDNA door middel van bibliotheekvoorbereiding en het sequencen van de cDNA-bibliotheek resulteerde in > 16.000 genen geïdentificeerd in negen onafhankelijke monsters, met een daling in transcripten per miljoen reads (TPM) waargenomen in genen onder deze drempel (figuur 4A). Single-cell RNA sequencing van geïsoleerde retinale endotheelcellen door de 10x Genomics pijplijn resulteerde in een mediaan van 1.171 genen per cel, 15.247 totale gedetecteerde genen en een mediaan van 2.255 unieke moleculaire identificatie (UMI) tellingen per cel in 917 cellen (figuur 4B).
Figuur 2: Fluorescent geactiveerde celsortering gating strategie. (A) Cel sortering voor CD31+/CD45- endotheelcellen door FSC-A/SSC-A voor cellen, FSC-A/FSC-H voor enkele cellen, Propidium Jodide (PI) negativiteit voor levensvatbaarheid, en CD31+/CD45- voor endotheelcellen. (B) Controlekleuring voor PI, IgG-controle, CD31+ controle en CD45+ controle om antilichaamspecificiteit en gatingstrategie voor elke fluorescerende uitlezing te tonen. Opnieuw gepubliceerd met toestemming van Chavkin et al. gepubliceerd in S. Karger AG, Basel17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Levensvatbaarheid en zuiverheid van geïsoleerde endotheelcellen. (A) Aantal levensvatbare en niet-levensvatbare endotheelcellen geïsoleerd na verschillende spijsverteringstijden genormaliseerd tot het aantal muizen dat in elke isolatie wordt gebruikt. (B) Percentage niet-levensvatbare endotheelcellen na isolatie door FACS-sortering in de loop van de tijd. (C) qPCR voor endotheelspecifieke genen (CD31, VE-Cadherine) en leukocytenspecifieke CD45 in CD31-/CD45- (Negatief), CD31+/CD45- (Endotheelcel) en CD31-/CD45+ (Leukocyten) populaties (A.U. = Willekeurige Eenheden). Alle gegevens weergegeven door gemiddelde met foutbalken van standaarddeviatie, statistische tests door ANOVA post-hoc Tukey, p-waarden aangegeven (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ****p < 0,0001). Opnieuw gepubliceerd met toestemming van Chavkin et al. gepubliceerd in S. Karger AG, Basel17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwaliteitscontrole van next-generation sequencing reads voor RNA sequencing en single-cell RNA sequencing na isolatie. (A) Transcripts per million reads (TPM) plotted versus genen gerangschikt op abundantie voor negen onafhankelijke RNA sequencing samples na bibliotheekvoorbereiding en Illumina sequencing, met het gemiddelde aantal sequenties per gen rechts van elk monster. (B) CellRanger-rapport voor eencellige RNA-sequencing van P6 retinale endotheelcellen na isolatie en voorbereiding met behulp van de 10x Genomics-pijplijn. Deze analyse toont Unique Molecular Identifier (UMI) Counts die ruwe sequentie-uitgangen vertegenwoordigen voor elke streepjescode die een individuele gesequencede cel vertegenwoordigt. Belangrijke kwaliteitscontrolemetingen worden weergegeven in het onderste deel van de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van endotheelcellen uit postnatale murine retinale weefsel die is geoptimaliseerd voor een hoog celaantal, zuiverheid en levensvatbaarheid. Celzuiverheid wordt verkregen door FACS-isolatie van endotheelcelpopulaties uit de verteerde eencellige suspensie door CD31 +/CD45-immunostaining. Kwaliteit van isolatie wordt gekwantificeerd in testen op levensvatbaarheid door Trypan blauwe kleuring en genexpressie door qPCR voor CD31, CD45 en VE-Cadherine (hoewel VE-Cadherine niet werd gebruikt voor immunostaining). De kritieke stappen in dit protocol zijn retinale weefselisolatie en weefselvertering. Retinale weefselisolatie moet snel worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel te behouden en nauwkeurig om de celzuiverheid te verhogen. Weefselvertering moet worden uitgevoerd, zoals beschreven, om de celopbrengst en de levensvatbaarheid van cellen te optimaliseren.
Wijzigingen in dit protocol kunnen worden aangebracht bij het toepassen van deze methode op verschillende tijdstippen, muizen met transgene modificaties of verschillende downstream-toepassingen. Dit kan vooral belangrijk zijn bij het onderzoeken van volwassen netvliesweefsel, omdat het weefsel volwassener kan zijn dan het P6-netvliesweefsel en mogelijk meer verteringstijd nodig heeft om zuivere en levensvatbare endotheelcellen te isoleren. Isolatie van netvliesweefsel en verteringstijd moeten worden geoptimaliseerd bij het wijzigen van het protocol. Een lage celopbrengst kan verse spijsverteringsenzymen, langere verteringstijd of nieuwe antilichamen voor FACS vereisen. Lage zuiverheid kan nieuwe antilichamen voor FACS vereisen. Lage levensvatbaarheid kan een snellere isolatie van retinaal weefsel, een kortere verteringstijd of een snellere celsorteersnelheid vereisen. De volgende stappen voor probleemoplossing kunnen helpen bij het verbeteren van de celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Een hoog percentage doubletten of niet-levensvatbare cellen kan het gevolg zijn van een slechte spijsvertering. Een niet-identificeerbare populatie van CD31+/CD45-endotheelcellen kan het gevolg zijn van slechte antilichaamkleuring. Slechte levensvatbaarheid tijdens het sorteren of na isolatie kan het gevolg zijn van een te harde spijsvertering, maar een slechte celzuiverheid kan het gevolg zijn van een zwakke spijsvertering of slechte antilichaamkleuring. Slechte RNA-kwaliteit zal minder unieke genen opleveren in een RNA-sequencing dataset, en slechte levensvatbaarheid zal minder cellen en genen opleveren in een single cell RNA sequencing dataset.
Er zijn verschillende beperkingen aan deze methode. Ten eerste resulteert deze methode in een lage opbrengst van retinale endotheelcellen, wat de downstream sequencingtoepassingen van de volgende generatie kan beperken. De representatieve resultaten verkregen door middel van eencellige RNA-sequencing leverden 917 endotheelcellen op. Een vergelijkbaar aantal cellen is geïsoleerd en gebruikt in andere eencellige RNA-sequencingstudies om de ontwikkeling van retinale endotheelcellen te onderzoeken22; hogere opbrengsten zouden een verder onderscheid van celclusters kunnen onthullen. Dieren en nesten kunnen worden samengevoegd om de celopbrengst te verhogen om de monsterinvoer te bereiken die nodig is voor verschillende toepassingen. Bovendien kan de levensvatbaarheid van endotheelcellen na isolatie andere downstream-toepassingen beperken. Het is moeilijk om het venster van levensvatbaarheid uit te breiden en niet-levensvatbare cellen zullen bepaalde toepassingen verstoren die intacte celmembranen vereisen. Aanpassingen van andere methoden in downstreamtoepassingen kunnen nodig zijn om deze methode te kunnen gebruiken.
Deze methode voor retinale endotheelcelisolatie is een verbetering ten opzichte van eerder gepubliceerde toepassingen die CD31-antilichaam-geconjugeerde magnetische kralen gebruiken om endotheelcellen te zuiveren, omdat dit protocol is geoptimaliseerd voor parameters die nodig zijn om een zuivere en levensvatbare celpopulatie te verkrijgen die het succes van de volgende generatie sequencingtoepassingen zal verbeteren22,23 . Hoge mate van levensvatbaarheid en zuiverheid zijn essentieel voor zowel whole transcriptome RNA sequencing als single-cell RNA sequencing. Daarom is deze methode een aanzienlijke verbetering bij het toepassen van sequencingmethoden van de volgende generatie op het retinale vascularisatiemodel.
Het gebruik van dit retinale endotheelcelisolatieprotocol, in combinatie met next-generation sequencing-toepassingen en bijbehorende computationele analyse, heeft het potentieel om complexe onderliggende mechanismen van vasculaire ontwikkeling te onthullen. Het bestuderen van postnatale retinale vascularisatie bij transgene muizen heeft het onderzoek mogelijk gemaakt van vele signaalroutes die angiogenese en bloedvatrijping beïnvloeden (Egel, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP)24,25,26,27,28,29,30. Deze studies hebben aangetoond dat signaalroutes sterk onderling verbonden zijn in endotheelcellen om het lot van cellen te beheersen 31,32,33. Het gebruik van deze geoptimaliseerde methode voor retinale endotheelcelisolatie van het ontwikkelen van postnataal retinaal weefsel, in combinatie met next-generation sequencingmethoden en biocomputatiebenaderingen 34,35,36,37, kan de mechanismen van onderling verbonden signaalroutes die de vasculaire ontwikkeling reguleren verder ophelderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante onthullingen.
Acknowledgments
Dank aan de Yale Flow Cytometry Facility, de University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, het Yale Center for Genomic Analysis en de University of Virginia Genome Analysis and Technology Core voor hun inspanningen, expertise en advies om bij te dragen aan de gepresenteerde experimenten. Deze studie werd gefinancierd door NIH-subsidies aan N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) en K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M.
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J.
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
