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Biology

Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con 13C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de 13C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de 31R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Abstract

El metabolismo es la base de procesos importantes en la vida celular. La caracterización de cómo funcionan las redes metabólicas en los tejidos vivos proporciona información crucial para comprender el mecanismo de las enfermedades y diseñar tratamientos. En este trabajo, describimos procedimientos y metodologías para estudiar la actividad metabólica en la célula en un corazón de ratón retrógradamente perfundido en tiempo real. El corazón se aisló in situ, junto con un paro cardíaco para minimizar la isquemia miocárdica y se perfundió dentro de un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN). Mientras estaba en el espectrómetro y bajo perfusión continua, se administró piruvato hiperpolarizado [1-13 C] al corazón, y las posteriores tasas de producción hiperpolarizadas de [1-13 C] lactato y [13C] bicarbonato sirvieron para determinar, en tiempo real, las tasas de producción de lactato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa. Esta actividad metabólica del piruvato hiperpolarizado [1-13C] se cuantificó con espectroscopia de RMN en un modelo de manera libre utilizando el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectivas del producto. 31 La espectroscopia P se aplicó entre las adquisiciones hiperpolarizadas para monitorear la energética cardíaca y el pH. Este sistema es excepcionalmente útil para estudiar la actividad metabólica en el corazón sano y enfermo del ratón.

Introduction

Las alteraciones en el metabolismo cardíaco están asociadas con una variedad de miocardiopatías y a menudo forman la base de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes1. Sin embargo, existen numerosos obstáculos para estudiar el metabolismo en tejidos vivos, ya que la mayoría de los ensayos bioquímicos requieren la homogeneización de la lisis tisular y celular y / o el trazado radiactivo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de nuevas herramientas para investigar el metabolismo miocárdico en tejidos vivos. La resonancia magnética (RM) de sustratos hiperpolarizados marcados con 13C permite mediciones en tiempo real del metabolismo en tejidos vivos2, sin el uso de radiación ionizante, al aumentar la relación señal-ruido (SNR) de MR del sitio (s) marcado en varios órdenes de magnitud3. Aquí, describimos una configuración experimental, un enfoque de adquisición y un enfoque analítico para estudiar el metabolismo rápido en el corazón de ratón aislado y, en paralelo, presentamos indicadores de energía y acidez tisular general. El pH cardíaco es un indicador valioso, ya que el equilibrio ácido-base se interrumpe en las primeras etapas de enfermedades cardíacas y afecciones como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiencia cardíaca6.

La producción hiperpolarizada de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato a partir de piruvato hiperpolarizado [1-13C]ayuda a determinar las tasas de producción de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa (PDH). La mayoría de los estudios previos realizados utilizando sustratos hiperpolarizados en el corazón de roedor aislado utilizaron modelos cinéticos complejos para derivar la actividad enzimática de LDH y PDH, o informaron las relaciones de intensidad de señal del producto hiperpolarizado a un sustrato sin calcular las tasas reales de actividad enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aquí, utilizamos el enfoque de saturación-excitaciones selectivas del producto 15, que permite el monitoreo de la actividad enzimática de manera libre de modelo15,16. De esta manera, se determinaron las tasas enzimáticas absolutas (es decir, el número de moles de producto producido por unidad de tiempo). 31 La espectroscopia P se utilizó para observar las señales de fosfato inorgánico (Pi), fosfocreatina (PCr) y trifosfato de adenosina (ATP). Se utilizó un análisis multiparamétrico para caracterizar la distribución del pH del corazón, como lo demuestra el cambio químico heterogéneo en la señal Pi del tejido.

El corazón de ratón retrógrado perfundido (corazón de Langendorff)17,18,19 es un modelo ex vivo para el corazón latente intacto. En este modelo, la viabilidad cardíaca y el pH se conservan durante al menos 80 min20, y ha mostrado potencial de recuperación después de una lesión isquémica prolongada21,22. Sin embargo, la variabilidad inadvertida durante la microcirugía puede conducir a la variabilidad en la viabilidad del tejido a través de los corazones. Estudios previos han reportado sobre el deterioro de este corazón a lo largo del tiempo19; Por ejemplo, se ha observado una reducción de la función contráctil del 5%-10% por hora18. La señal de trifosfato de adenosina (ATP) ha demostrado previamente que informa sobre el estado energético miocárdico y la viabilidad23. Aquí, notamos que el corazón perfundido ocasionalmente puede mostrar una variabilidad involuntaria en los niveles de viabilidad, como lo demuestra el contenido de ATP, a pesar del hecho de que tuvimos un suministro ininterrumpido de perfusión y oxígeno. Demostramos aquí que normalizar las tasas de LDH y PDH al contenido de ATP del corazón reduce la variabilidad intercardíaca en estas tasas.

En el siguiente protocolo, describimos el procedimiento quirúrgico utilizado para la canulación cardíaca, el aislamiento y la consiguiente perfusión en el espectrómetro de RMN. Cabe destacar que otros enfoques quirúrgicos dirigidos a aislar y perfundir el corazón del ratón se han descrito antes de24,25.

También se describen las metodologías utilizadas para adquirir datos relacionados con las tasas enzimáticas en el corazón latiendo (utilizando espectroscopia 13 C y piruvato hiperpolarizado [1-13C]) y la viabilidad y acidez del corazón (utilizando espectroscopia de RMN 31P). Finalmente, se explican las metodologías analíticas para determinar las actividades enzimáticas metabólicas y la viabilidad y acidez de los tejidos.

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Protocol

El comité conjunto de ética (IACUC) de la Universidad Hebrea y el Centro Médico Hadassah aprobaron el protocolo de estudio para el bienestar animal (MD-19-15827-1).

1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit

  1. Un día antes del experimento, prepare una versión modificada del tampón de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, disolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3 y 1,2 mM KH 2 PO4 en H2O de doble destilación.
  2. Burbujear esta mezcla con 95%/5%O2/CO 2 durante 20 min, y luego añadir 1,2 mM CaCl2.
  3. Ajuste el pH del tampón a 7,4 con HCl o NaOH.
  4. El día del experimento, añadir 10 mM de glucosa y 72 U/L de insulina al KHB preparado en el paso 1.2.
    NOTA: La insulina se añade al tampón de perfusión como se describe en el trabajo de Kolwicz et al.26 y de acuerdo con estudios previos que informan que la insulina aumenta la función contráctil27 y la intensidad de la señal hiperpolarizada [13C]bicarbonato28.

2. Preparación del sistema de perfusión

  1. Mantener un depósito de 200 ml de KHB en un baño maría a 40 °C, y burbujear con 95%/5% deO2/CO2 a un caudal de 4 L/min durante 1 h antes de la perfusión cardíaca. Mantenga el tampón burbujeando continuamente con esta mezcla de gases durante todo el experimento.
    1. Primero, ajuste el baño maría a 40 ° C. Inserte el depósito KHB. Utilice una bomba peristáltica (consulte la Tabla de materiales) y tubos de extensión de grado médico para recircular el KHB entre el depósito intermedio y el tubo de RMN de 10 mm a un caudal constante de 7,5 ml/min.
    2. Conecte tres tubos de silicona curados con platino (3 mm i.d.) a la bomba (un tubo de entrada y dos tubos de salida para el tampón KH). Inserte las líneas de salida y entrada en el tampón KH calentado. Luego, inserte la línea de oxígeno en el tampón KH calentado.
    3. Use líneas delgadas de cetona de éter de poliéter (PEEK, consulte la Tabla de materiales) para que el tampón y el agente hiperpolarizado fluyan hacia y desde el tubo de RMN dentro del orificio del espectrómetro.
  2. Asegúrese de que la temperatura se mantiene a 37-37.5 ° C. Siga los pasos a continuación.
  3. Envuelva la línea de entrada (desde el depósito intermedio hasta el tubo de RMN) con una cinta calefactora ajustada a 42 °C.
  4. Caliente el tubo de RMN dentro del espectrómetro con un flujo de aire caliente regulado por el espectrómetro.
  5. Utilice un sensor de temperatura compatible con RMN (consulte la Tabla de materiales) para medir la temperatura dentro del tubo de RMN. La temperatura se ajusta a 37-37.5 °C.

3. Calibración y preparación del espectrómetro de RMN para su adquisición

  1. El día del experimento, inserte una muestra estándar de 13 C que contenga 1,4-dioxano (Tabla de materiales) en el espectrómetro, y ajuste y haga coincidir la sonda de RMN para 13C. Luego, obtenga un espectro que muestre la señal de equilibrio térmico de 1,4-dioxano con un ángulo de nutación de 90 °.
  2. Ahora intercambie la muestra estándar de 13C con una muestra estándar de 31 P (Tabla de materiales), que contiene 105 mM de ATP en D2O. Sintoniza y combina la sonda de RMN para 31P.
    NOTA: Se obtiene un espectro que muestra las señales de fosfato de equilibrio térmico con un ángulo de nutación de 50°.
  3. Inserte la línea de entrada, la línea de salida y la sonda de temperatura en un tubo de RMN de 10 mm y, a continuación, inserte el tubo en el orificio magnético. Ajuste la cinta calefactora a 42 °C.
  4. Adquirir un espectro de RMN 31Pdel tampón KH circulante para ser utilizado en ese experimento durante 30 min, con un ángulo de nutación de 50° y un TR de 1,1 s (1.640 adquisiciones).

4. Preparación animal, procedimiento quirúrgico y perfusión del corazón en el tubo de RMN

  1. Anestesiar a un ratón macho HSD:ICR (CD-1) con isoflurano al 3,3% en el aire ambiente (Tabla de materiales) a 340 mL/min durante 5 min utilizando un sistema de anestesia con gas (Tabla de materiales) en una cámara de inducción.
  2. Utilizar anestesia nasal para el mantenimiento de la anestesia general con isoflurano al 2,9%.
    NOTA: Se tiene cuidado para minimizar el dolor y la incomodidad del animal.
  3. Asegure las extremidades del animal con cinta adhesiva, asegure un reflejo negativo del dolor del pedal y luego inyecte 300 UI de heparina de sodio por vía intraperitoneal.
  4. Moje bien la pared torácica y el abdomen del ratón con alcohol al 70% para garantizar la limpieza y evitar la contaminación u obstrucción del cabello durante el procedimiento quirúrgico.
  5. A 1 minuto después de la inyección de heparina, corte la piel y el músculo de la cavidad abdominal con tijeras pequeñas.
  6. Coloque la pequeña pinza antimosquitos con bloqueo hemostático de mandíbula curva entre el proceso xifoide y la piel del pecho para levantar el pecho y exponer el diafragma. Pinchar y cortar el lóbulo derecho del diafragma.
  7. Corte el pecho a través de la línea media, retraiga hacia los lados y luego retírelo.
  8. Inyecte el ventrículo izquierdo del corazón con 200 UI de heparina sódica para prevenir la coagulación de la sangre. Luego, inyecte 0.1 mL de 0.5 mol / L KCl helado para lograr un paro cardíaco, como se describió anteriormente25. El paro cardíaco es esencial para poder canular el corazón.
  9. Identifique el timo y retírelo con tijeras para exponer la aorta. Retire el tejido residual de la caja torácica.
  10. Identifique el arco aórtico y use pinzas curvas para colocar un nudo suelto con una sutura de seda 3-0 (Tabla de materiales) alrededor de la aorta ascendente. Inyecte 3 ml de KHB en el ventrículo izquierdo para eliminar los coágulos de sangre de la aorta.
  11. Use fórceps curvos para retraer el corazón hacia abajo para una mejor visualización de la aorta ascendente.
  12. Realizar la canulación in situ con un catéter intravenoso de 22 G (Tabla de Materiales). Aplique adhesivo de cianoacrilato en la región canulada y luego realice el atado de doble sutura. Inyecte tampón KH adicional en el corazón y verifique que fluya a través del tubo de canulación .
  13. Retire las pinzas curvas. Desconecte el corazón de las vísceras circundantes y perfundirlo retrógradamente con KHB helada (4 °C) a través del catéter intravenoso.
  14. Conecte el corazón a la línea de entrada del sistema de perfusión a través del catéter intravenoso. Al iniciar la perfusión con tampón caliente (37-37,5 °C) a 7,5 ml/min, el corazón comienza a latir espontáneamente.
  15. Fije el tubo de RMN con el corazón latiendo, las líneas de salida y la sonda de temperatura, e insértelo en el orificio del espectrómetro, asegurándose de que el corazón esté en el centro de la sonda de RMN.

5. Adquisición de datos para la energética cardíaca y el pH

  1. Adquirir espectros de 31P durante aproximadamente 1 h con un ángulo de giro de 50° y un TR de 1.1 s.

6. Polarización y disolución del espín DNP

  1. Preparar una formulación de 28,5 mg de [1-13C]piruvato. Esta formulación consiste en 11.1 mM a 14.0 mM OX063 radical en el ácido puro.
  2. Preparar 4 mL de medio de disolución. El medio de disolución consiste en tampón TRIS-fosfato, que contiene 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mMNa2HPO4, 33 mM TRIS y2mM HCl. Esta composición del medio se ajusta de tal manera que tras la adición de 28,5 mg de [1-13C]formulación de ácido pirúvico a 4 ml de este tampón (en la fase de disolución), el pH de la solución resultante será 7,4.
  3. Realice la polarización de espín y la disolución rápida en un dispositivo de polarización de espín de disolución-DNP (dDNP) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Aplicar irradiación de microondas a una frecuencia de 94,110 GHz para la polarización de la formulación de ácido pirúvico [1-13C]a 1,45 K a 1,55 K durante aproximadamente 1,5 h.
  4. Mezcle rápidamente los 4 ml de medio hiperpolarizado del dispositivo dDNP con una solución bien oxigenada que complemente el medio de disolución hiperpolarizado para obtener una composición que coincida estrechamente con el medio de perfusión.
    NOTA: El volumen final del medio que perfunde el corazón durante las inyecciones hiperpolarizadas con piruvato hiperpolarizado de 14 mM es de 26 ml. La composición final del medio inyectado (después de la mezcla) contiene 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucosa, 1,2 mM CaCl2y 72 U/L insulina.
  5. Administrar el medio hiperpolarizado que contiene piruvato [1-13C] al corazón aislado utilizando una configuración de flujo continuo29.
    NOTA: Esto se hace para asegurar que la perfusión del corazón no se altere en ningún momento durante el experimento y que el medio hiperpolarizado se administre a una velocidad conocida y durante un período conocido.

7. Espectroscopía hiperpolarizada de 13C

  1. Adquirir datos hiperpolarizados de 13 C utilizando pulsos de excitación de saturación selectiva del producto 15 aplicando pulsos de seno cardinal (Sinc) de 2,5 ms, como se describió anteriormente15,16. Excitar selectivamente [1-13 C]lactato y [13C]bicarbonato consecutivamente a intervalos de 6 s para obtener un intervalo de 12s para cada metabolito.
  2. Para la detección de [1-13 C]lactato, centre el pulso selectivo de Sinc en la frecuencia de hidrato de piruvato [1-13 C](179.4 ppm), lo que da como resultado una relación de intensidad de señal (lac) de 0.113 para las señales C 1 de [1-13 C]piruvato a [1-13C]lactato.
  3. Para la detección de [13 C]bicarbonato, centre el pulso selectivo Sinc a 157,7 ppm, que es 214 Hz de campo inferior de la señal de [13C]bicarbonato (161,1 ppm); esto da como resultado una relación de intensidad de señal (bic) de 0,139 para la señal C 1 de [1-13C]piruvato a [13C]bicarbonato.

8. Determinación del peso y volumen húmedo del tejido

  1. Al final del experimento, separe el corazón del sistema de perfusión y séquelo suavemente con papel de seda. Posteriormente, pesar el corazón para obtener el peso húmedo del tejido.
  2. Determinar el volumen del corazón utilizando un factor de densidad de 1,05 g/cm3, como se determinó previamente para el corazón del ratón30.

9. Cuantificación del contenido de ATP

  1. Integrar la señal γ-ATP de una sola adquisición de la muestra estándar de ATP y una adquisición de 30 min (TR de 1,1 s y 1.640 adquisiciones) del corazón aislado.
  2. Cuantificar el contenido de ATP del corazón comparando la integral de la señal de γ-ATP del corazón con la del estándar (Tabla de materiales), donde este último tiene una concentración conocida (105 mM), y corregir el número de adquisiciones y efectos de relajación.

10. Resolver la señal Pi del corazón

NOTA: Para evaluar el pH del tejido, primero es necesario desconconvertir la señal Pi del corazón de la señal Pi total (Pit). Esto se hace omitiendo la señal del KHB Pi (PiKH) de la del Pit.

  1. En un espectro de 31P de KHB que muestra una sola señal Pi (PiKH, Figura 1A), ajuste la señal PiKH a una función lorentziana usando Excel (Tabla de materiales).
  2. El volumen visible para la sonda de RMN (Vp, 1.375 mL), contiene más KHB cuando el tubo de muestra no contiene el corazón. Para corregir este efecto de relleno, calcule la señal de búfer atenuada (Pib) utilizando la Ec. 1A.
    Equation 1Ec. 1A
    donde Vh es el volumen del corazón, como se determinó en el paso 8.
  3. Resta esta señal del Pit de acuerdo con la Ec. 1B para obtener la señal Pi que surge únicamente del corazón perfundido (Pih, Figura 1B).
    Equation 2Ec. 1B

11. Análisis de pH multiparamétrico

  1. Realizar la conversión de la distribución del desplazamiento químico de la señal Pih al pH con referencia al desplazamiento químico de PCr utilizando la Ec. 231.
    Equation 3Ec. 2
    donde Δδ es la diferencia de desplazamiento químico, pKa es 6.72, δ base libre es 5.69 y δ ácido libre es 3.27, como se describió anteriormente31.
  2. Corregir la curva de distribución de pH resultante para la no linealidad entre la escala de desplazamiento químico Pih y la escala de pH según Lutz et al.32. Una distribución típica de pH resultante de este cálculo se presenta en la Figura 1C.
  3. Analizar la distribución del pH tisular con un enfoque multiparamétrico utilizando siete parámetros estadísticos siguiendo el trabajo de Lutz et al. 32. Cuatro de estos parámetros se presentan aquí, ya que parecen ser los más descriptivos del pH tisular: 1) pH máximo global; 2) pH medio ponderado; 3) pH mediano ponderado; y 4) asimetría de la gráfica de pH (Figura 1C).

12. Cálculo de las actividades de LDH y PDH

NOTA: Las tasas de producción de los metabolitos hiperpolarizados [1-13 C]lactato y [13C]bicarbonato se utilizan para calcular las actividades de LDH y PDH, respectivamente. En el enfoque de excitación saturante-selectivadel producto 15, sólo los metabolitos hiperpolarizados recién sintetizados son detectados por cada excitación selectiva.

  1. Utilice la señal hiperpolarizada [1-13C]piruvato como referencia para determinar el nivel de producción de metabolitos correspondiente.
    1. Durante la perfusión con el medio hiperpolarizado, la concentración de piruvato [1-13 C] en el tubo de RMN aumenta (lavado), luego se estabiliza (a una concentración máxima de 14mM) y luego disminuye (lavado).
    2. Para identificar los puntos de tiempo en los que la concentración de piruvato alcanzó un nivel constante (meseta), corrija la señal de piruvato [1-13C] para la disminución de la señal resultante de la relajación de T1 y la pulsación de RF utilizando la constante de relajación efectiva, Teff.
    3. Para cada inyección, defina elT eff en función de su capacidad para corregir la curva de desintegración del piruvato [1-13 C] para mostrar esta dinámica de flujo (Ec.3).
      Equation 4Ec. 3
      donde Equation 5 es la señal de [1-13 C]piruvato que se adquirió durante la adquisición de [13C]bicarbonato. Se encontró que el Teff promedio en los experimentos descritos en este documento era de 35.8 s ± 2.3 s (n = 5 corazones).
    4. Seleccione los puntos de datos en los que la concentración está dentro del 10% de la señal máxima corregida de piruvato [1-13C] para su posterior análisis.
  2. Utilizar los datos correspondientes de la producción de [1-13C]lactato y [13 C]bicarbonato para los puntos temporales seleccionados en la etapa 12.1para el cálculo de las tasas de producción de metabolitos utilizando la Ec. 4A y la Ec. 4B, siempre que la SNR de la señal del metabolito sea mayor que 2 (umbral para el análisis). Un ejemplo típico de tal selección de puntos de tiempo se muestra en la Figura 2B (ventana temporal resaltada).
  3. Calcule las tasas de producción de cada uno de los puntos de datos seleccionados utilizando la Ec. 4A y la Ec. 4B:
    Equation 17Ec. 4A
    Equation 6Ec. 4B
    donde Equation 7 y son las tasas de producción de [1-13 C]lactato o [13 C]bicarbonato en cada punto temporal, respectivamente. y son factores que representan la excitación relativa de [1-13 C]piruvato y Equation 8 Equation 10 los productos [1-13 C]lactato o [13C]bicarbonato, respectivamente. Equation 9 Estos factores fueron determinados previamente en 0,113 y 0,139, respectivamente29. Vp es el volumen detectado por la sonda de RMN (1.375 mL), TR denota el intervalo de tiempo entre dos excitaciones saturantes selectivas consecutivas del producto (12 s para cada producto), Equation 11 y son las señales de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato, respectivamente, y y Equation 14 son las señales de [1-13 C]piruvato que se adquirieron durante el [1-13 C]lactato y Equation 12 Equation 13 [13 C]excitaciones de bicarbonato, respectivamente. [Pyr] es la concentración de piruvato [1-13 C], que fue de 14mM durante la fase de meseta.
    1. Determine la tasa para cada punto y luego el promedio por inyección hiperpolarizada.

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Representative Results

Los espectros 31P registrados desde un corazón de ratón perfundido con KHB y solo desde el tampón se muestran en la Figura 1A. Las señales de α, β y γ-ATP, PCr y Pi se observaron en el corazón. La señal Pi estaba compuesta de dos componentes principales: en el campo más alto (lado izquierdo de la señal), la señal Pi se debía principalmente al KHB a un pH de 7,4; en el campo inferior (lado derecho de la señal), la señal Pi era más amplia y menos homogénea debido al ambiente más ácido. Este último patrón surge del tejido cardíaco. La señal Pi del tejido cardíaco se extrae restando la señal Pi del KHB (Figura 1B) y luego se convierte de la escala ppm a la escala de pH (Figura 1C). El pH se investiga mediante un análisis multiparamétrico de la señal Pi tisular mediante el cálculo de la media ponderada, la mediana ponderada, el máximo global y la asimetría (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Espectros típicos de 31 P, la distinción entre la señal Pi del KHB y el corazón, la conversión del cambio químico a los ejes de pH y los parámetros estadísticos de la distribución del pH. (A) El panel superior muestra un espectro típico de RMN de 31P obtenido de un corazón de ratón perfundido con KHB en el espectrómetro, mientras que el panel inferior muestra un espectro obtenido solo de KHB. La región espectral marcada con guiones se muestra ampliada en el panel B. Abreviaturas: Pi = fosfato inorgánico; PCr = fosfocreatina; ATP = trifosfato de adenosina; ADP = difosfato de adenosina. (B) El espectro original se muestra en negro (Pit); la curva discontinua muestra la señal Pi sólo del búfer (Pib). Este último se obtuvo ajustando una forma de línea lorentziana con su centro en el componente KHB correspondiente de la señal Pit y ajustando la cantidad de KHB en la sonda después de la inserción del corazón (de acuerdo con la Ec. 1A). La señal Pi atribuida al corazón (Pih) se muestra en naranja, y esto se obtiene restando la señal Pib de la señal Pit (según la Ec. 1B). (C) Conversión de la distribución de desplazamiento químico de la señal Pih que se muestra en (B) a una distribución de pH y análisis de pH multiparamétrico. La no linealidad entre el cambio químico y las escalas de pH fue corregida como se describió anteriormente32. Los resultados del análisis multiparamétrico de pH están marcados por las líneas verticales. Para esta distribución específica, se proporcionan los valores de los parámetros estadísticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectiva de productos hiperpolarizados15, es posible realizar una cuantificación absoluta de las actividades enzimáticas LDH y PDH. La figura 2 resume los pasos de adquisición y procesamiento necesarios para esta determinación. La Tabla 1 muestra el contenido de ATP y las tasas de LDH y PDH en cinco corazones diferentes. La normalización de las actividades de LDH y PDH al contenido de ATP de cada corazón redujo la variabilidad en las mediciones de LDH y PDH en todo el grupo, como se puede ver en las columnas de actividad enzimática en la Tabla 1, que se expresan en unidades de nmol / s / μmol ATP.

Figure 2
Figura 2: Procesamiento hiperpolarizado de 13 C MRS y análisis del metabolismo del piruvato de [1-13C]. (A) Espectros representativos de RMN 13 C adquiridos con el enfoque de excitaciones de saturación selectivas del producto durante una inyección de 14 mM de piruvato hiperpolarizado [1-13C] en el corazón de ratón perfundido. Asignación de señal: 1 = [1-13 C]lactato (183,2ppm); 2 = [1-13C]piruvato (171 ppm); 3 = [13C]bicarbonato (161,1 ppm); * = impurezas derivadas de la formulación de piruvato [1-13C]33. (B) Curso temporal de las intensidades de señal hiperpolarizadas mostradas en A. Las intensidades integradas de [1-13C]piruvato (gris) se ajustaron para la desintegración de T1y la pulsación de RF con una constante de tiempo Teff de 32 s (negro), y esto produjo la dinámica de flujo esperada para el sustrato (lavado, meseta, lavado). Se realizó un análisis adicional en los puntos de datos dentro de la ventana de tiempo en la que la señal ajustada de [1-13 C] piruvato mostró una concentración constante y máxima de [1-13C] piruvato en el tubo de RMN (resaltada en azul claro). Las tasas de producción de LDH y PDH (Equation 18 y ) para los puntos de tiempo seleccionados se calcularon de acuerdo con la Ec. 4A y la Ec. 4B y Equation 19luego se promediaron. Los valores medios para esta inyección (Equation 1 y Equation 1 ) se proporcionan en unidades de nmol/s. Para fines de visualización, el [1-13 C] piruvato ajustado, el [1-13 C] lactato y el [13 C] bicarbonato se multiplicaron por 0.143, 10 y 80, respectivamente, en relación con la señal de [1-13C]piruvato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Corazón No. ATP (μmol) Tasa de LDH (nmol/s) Tasa PDH (nmol/s) Tasa de LDH (nmol/s/μmol ATP) Tasa de PDH (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Media (DE) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % Media 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabla 1: Contenido de ATP y tasas de LDH y PDH en cinco corazones. Abreviaturas: SD = desviación estándar; SD % Media = porcentaje de la desviación estándar de la media.

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Discussion

Demostramos una configuración experimental que está diseñada para investigar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato [1-13C], la energética de los tejidos y el pH en un modelo de corazón de ratón aislado.

Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes: 1) asegurar que el pH del tampón sea 7.4; 2) garantizar que se incluyan todos los componentes del búfer; 3) evitar la coagulación de la sangre en los vasos cardíacos mediante inyecciones de heparina; 4) evitar el daño isquémico al corazón mediante la reducción de la actividad metabólica (inyección de KCl y tampón helado); 5) evitar la introducción de burbujas de aire en el corazón en cualquier punto del procedimiento; 6) validar la canulación exitosa de la aorta por el color del tejido, que cambia de rojo oscuro a rosa claro; 7) asegurarse de que la perfusión sea continua una vez que el corazón se mueva al tampón caliente; 8) vigilar de cerca la temperatura dentro del tubo de RMN en el espectrómetro junto al corazón y mantenerla a 37 °C; 9) comprobar la homogeneidad del campo magnético a lo largo de la medición; y 10) utilizando una calibración precisa y actualizada para los pulsos de RF.

Modificaciones y solución de problemas de la técnica
Observamos un par de modificaciones que se hicieron en este estudio: 1) el inicio de la perfusión con KHB helada después de la cirugía se empleó para proteger el corazón; y 2) la validación del pH tampón se realizó en todo momento para asegurarse de que este parámetro estaba bajo control y no era una fuente de variación en los resultados. Esto se hizo en los diversos pasos de preparación y experimentación utilizando un medidor de pH, tiras indicadoras de pH y la señal Pi en el espectro 31P.

Fuentes de variabilidad y cómo corregirlas
El corazón del ratón fue elegido para encajar en un tubo de RMN de 10 mm. Sin embargo, este pequeño corazón proporciona señales bajas, y el delicado procedimiento quirúrgico para aislar y perfundir el corazón es un desafío. En general, esto conduce a la viabilidad variable del tejido y la actividad metabólica. Para tener en cuenta esta variabilidad, normalizamos las tasas metabólicas de LDH y PDH al contenido de ATP (es decir, mol / s / ATP). Un uso similar del contenido de ATP como referencia fue reportado previamente en cortes de tumores de mama xenoinjertos29. Este tipo de normalización es beneficiosa porque permite la comparación con los resultados de otros investigadores y con otras condiciones. Además, mediante el uso de un factor de conversión de la cantidad de ATP a la masa tisular, se puede derivar la actividad enzimática por peso tisular (para el tejido en el que se produce el metabolismo).

Además de la variabilidad entre diferentes preparaciones cardíacas aisladas (es decir, de diferentes animales), el cambio químico del tejido Pi (Pih) mostró una distribución no homogénea en este estudio. Lutz et al.32 demostraron una distribución no homogénea similar en tumores de xenoinjerto, y esta distribución se analizó mediante un enfoque multiparamétrico. En este trabajo, esta metodología se implementó en el corazón de ratón perfundido. Observamos que es probable que la señal Pih informe predominantemente sobre el pH intracelular, como se indicó anteriormente16.

Incertidumbre
Una suposición subyacente en la cuantificación de y es que la solución hiperpolarizada de [1-13C]piruvato está llenando todo el volumen detectado por la sonda de Equation 18 RMN (Vp, Eq. 4A y Equation 19 Eq. 4B). La solución hiperpolarizada de [1-13C]piruvato fluye a través de las arterias coronarias del corazón para llenar los compartimentos extracelular e intracelular. Por lo tanto, se supone que el volumen cardíaco está lleno con la solución hiperpolarizada en la misma medida que el resto de laV p.

Utilizando el enfoque de excitaciones de saturación selectiva de productos hiperpolarizados15,29, la actividad enzimática puede cuantificarse independientemente de cualquier variación en laT1 de los metabolitos y la reversibilidad de la reacción enzimática. Esta determinación es robusta e inmune a las variaciones en T1 y perfiles de excitación y es probable que sea más reproducible en todos los laboratorios en comparación con los análisis de área bajo la curva, que dependen de las condiciones de adquisición específicas y la configuración en cada laboratorio.

Investigar el metabolismo del piruvato [1-13C], que se encuentra en la encrucijada del metabolismo aeróbico y anaeróbico, es de gran valor para estudiar la hipoxia, la isquemia, la lesión por reperfusión, la inanición y la alteración del metabolismo cardíaco, como en la miocardiopatía diabética. Los análogos de piruvato hiperpolarizados marcados con 13C se han probado clínicamente 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 y, por lo tanto, los resultados de dichos estudios son probablemente traslacionales. Lo más importante es que nuestro enfoque permite la cuantificación de la actividad enzimática en la célula en todo el órgano.

La preparación aislada del corazón de roedores y los procedimientos y metodologías involucrados en esta investigación ayudarán a comprender mejor el efecto de una variedad de factores estresantes en la función cardíaca, la energía y el metabolismo, ya que los parámetros medidos en este modelo se atribuyen únicamente al corazón. A diferencia del corazón de rata, el corazón de ratón es adecuado para estudiar modelos transgénicos.

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Disclosures

No hay divulgaciones.

Acknowledgments

Este proyecto recibió financiación de la Fundación Científica de Israel en virtud del acuerdo de subvención Nº 1379/18; la Beca Jabotinsky del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel para Ciencias Aplicadas y de Ingeniería para estudiantes de doctorado directos No. 3-15892 para D.S.; y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención No. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

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Biología Número 194 Metabolismo imágenes metabólicas agente de imagen espectroscopia de resonancia magnética lactato deshidrogenasa piruvato deshidrogenasa [1-13C]piruvato pH fosfato inorgánico
Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [<sup>1-13</sup>C] y espectroscopia de RMN <sup>13</sup>C / <sup>31</sup>P
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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

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