Summary
ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。
Abstract
酸化還元バランスは、細胞の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしている。活性酸素種(ROS)の生成の増加は、タンパク質、脂質、およびDNAの修飾を促進し、最終的に細胞機能の変化および細胞死につながる可能性がある。したがって、Keap1 / Nrf2のような抗酸化経路を活性化するか、酸化還元捕捉剤(ビタミンA、C、およびE、β-カロチン、およびポリフェノールなど)を改善することによって、有害な侮辱に応答して抗酸化防御を高めることは細胞にとって有益である。炎症および酸化ストレスは、糖尿病性網膜症(DR)および未熟児網膜症(ROP)などの網膜症の病因および進行に関与している。ミュラーグリア細胞(MGC)は神経網膜組織の恒常性維持において重要な役割を果たしているため、これらの細胞保護機構を研究するための理想的なモデルと考えられています。この意味で、再現性のある簡単な方法でROSレベルを定量することは、抗酸化細胞防御機構に関与する経路または分子の寄与を評価するために不可欠である。この記事では、DCFH-DAプローブによるROSの測定とMGCのフローサイトメトリーに必要な手順について詳しく説明します。ソフトウェアによるフローサイトメトリーデータ処理の主要な手順がここに提供されるため、読者はROSレベル(FITCの幾何学的手段)を測定し、蛍光ヒストグラムを分析できます。これらのツールは、細胞侮辱後のROSの増加を評価するだけでなく、細胞に保護効果をもたらすことができる特定の分子の抗酸化効果を研究するのに非常に役立ちます。
Introduction
神経網膜は、明確に定義されたニューロン層を提示する非常に組織化された組織である。これらの中で、ニューロン(神経節、アマクリン、双極性、水平、および視細胞)は、互いに、またミュラーグリア細胞(MGC)およびアストロサイトと相互接続され、適切な光伝達および視覚情報の処理をもたらす1,2。MGCは、網膜部分全体にわたっており、したがって、複数の保護プロセスを調節するすべての細胞型と相互作用することができるため、網膜恒常性の維持に重要な役割を果たすことが知られている。MGCは、ニューロンにエネルギーを供給する解糖系、ニューロン老廃物の除去、神経伝達物質のリサイクル、神経栄養因子の放出など、網膜ニューロンの維持と生存のためにいくつかの重要な機能を有することが報告されている3,4,5。
一方、炎症、酸化ストレスおよびニトロソストレスは、網膜症6、7、8、9、10、11を含む多くのヒト疾患の病因および進行に関与している。細胞内の酸化還元バランスは、ROSレベルの厳密な調節に依存する。ROSは、主に好気呼吸の結果として生理学的条件下で絶えず生成される。ROSファミリーの主要メンバーには、スーパーオキシドアニオン(O2͘͘͘•−)、ヒドロキシルラジカル(•OH)、様々な過酸化物(ROOR')、ヒドロペルオキシド(ROOH)、および無ラジカル過酸化水素(H2O2)12,13などの反応性フリーラジカルが含まれる。ここ数年で、ROSが重要なプロセスを制御することによって細胞内で重要なシグナル伝達役割を果たすことが明らかになりました。MGCは、転写核因子エリスロイド-2関連因子2(Nrf2)の活性化およびその後の抗酸化タンパク質の発現によって強力な抗酸化防御を有し、病理学的条件下でのROSの過剰産生を排除する14、15、16。ROSの誇張された産生またはROSを除去する能力の欠陥のために細胞が酸化還元バランスを失うと、酸化ストレスの蓄積はタンパク質、脂質、およびDNAの有害な修飾を促進し、細胞ストレスまたは死に至る。網膜抗酸化防御系の増加は、ROPおよびRD17、18、19、20、21、22、23、24などの網膜障害の分解能および予防を改善する。したがって、リアルタイムでのROS生産の測定は強力で便利なツールです。
細胞内のROS産生または酸化ストレスを測定するためのいくつかの方法がある。これらの中でも、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)プローブは、細胞25、26、27、28の酸化還元状態を直接定量するために最も広く使用されている技術の1つである。このプローブは親油性であり、非蛍光性である。細胞膜を横切るこのプローブの拡散は、2つのエステル結合における細胞内エステラーゼによる切断を可能にし、比較的極性が高く細胞膜不透過性の生成物である2',7'-ジクロロフルオレセイン(H2DCF)を生成する。この非蛍光分子は細胞内に蓄積し、その後のROSによる酸化は高蛍光生成物DCFを生成する。プローブの酸化は、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡(530nmでの発光および485nmでの励起)によって検出することができる複数のタイプのROS(ペルオキシ亜硝酸塩、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、または過酸化物)の作用の産物である。この技術の限界は、スーパーオキシドおよび過酸化水素がH2DCF25,29と強く反応しないことである。この記事では、DCFH-DAプローブを使用して、フローサイトメトリーによってROSを測定および定量します。そのため、蛍光プローブを細胞に負荷する前に、MGCをROS誘導剤AまたはBで刺激することにより、ROS産生を誘導します。また、酸化防止剤化合物を使用しています。最後に、このプロトコルを使用して得られた代表的で信頼性の高いデータを示します。
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Protocol
メモ: バッファーの構成については、 表 1 を参照してください。
細胞培養製剤
注:ここで記載されているのは、自発的に不死化されたヒトミュラーグリア細胞株であるMIO-M1細胞の培養調製である(Moorfield's/Institute of Ophthalmology-Müller 1)。常に適切な無菌技術を使用し、層流フードで作業してください。
- ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)完全培地を調製する。4.5 g/L D-グルコースおよび110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含むDMEMに、10%熱失活FBS、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2 mM L-グルタミン、および50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを加える。新鮮な培地を用意し、当日にMIO-M1細胞を解凍する。
- 凍結MIO-M1細胞を1日目に解凍する。
- これを行うには、10%DMSOを含むFBS中の5 x 105 MIO-M1細胞を含むクライオビアを液体窒素貯蔵から取り出し、直ちに37°Cの水浴に入れる。
注:液体窒素中に貯蔵されたクライオビアルは解凍時に爆発の危険性があるため、フェイスマスクまたは安全ゴーグルを常に着用してください。 - バイアルに氷が少しだけ残るまで、37°Cの水浴中でバイアルを温めることによって、MIO-M1細胞を急速に(1分未満で)解凍する。
- バイアルの外側を70%エタノールで拭き取り、層流フードに移す。
- バイアルから解凍した細胞を滅菌15mLチューブに移し、次いで、予め加温した完全DMEM培地6mLを滴下して加える。
- 細胞懸濁液を約600 x g で5分間遠心分離する。遠心分離後、透明な上清と完全なペレットが視覚化されます。細胞ペレットを乱すことなくピペットで上清を捨てる。
- ペレットを穏やかに解離させ、細胞を10mLの完全DMEM培地に再懸濁する。この細胞懸濁液を直径100mmの組織培養プレートに移し、プレートを37°C、5%CO2で約2日間インキュベートした。
- これを行うには、10%DMSOを含むFBS中の5 x 105 MIO-M1細胞を含むクライオビアを液体窒素貯蔵から取り出し、直ちに37°Cの水浴に入れる。
- MIO-M1細胞が4日目に80%-90%コンフルエントになったら、以下の手順を実行します。
- プレートをインキュベーターから層流フードに移す。上清を慎重に取り出し、5mLの滅菌および予め加温したPBSで2xを洗浄する。PBS を吸引します。
- 1 mLの0.5%トリプシン-EDTA溶液を分注し、CO2インキュベーター内で37°Cで3〜5分間インキュベートし、細胞を剥離した。
- 7mLの完全DMEM培地を加えて、トリプシン作用を阻害する。クラスター化されたトリプシン処理MGCをゆっくりと上下にピペッティングすることによって分解する(P1000)。細胞懸濁液を15mLチューブに集める。
- 600 x g で5分間遠心分離する。上清を捨てる。細胞ペレットを2mLの完全DMEM培地中に穏やかに再懸濁する。この細胞懸濁液1mLを、予め加温した完全DMEM培地9mLを含む100mmプレートに移す。
- 別の100 mmプレートでこの操作を繰り返します。プレートを5%CO2インキュベーター中で37°Cで約1日間インキュベートする。
- 両方のプレートが80%〜90%合流したら(6日目)、プレートを層流フードに移します。ステップ 1.3 に従ってください。細胞ペレットを得た。
- ペレットを穏やかに解離させ、細胞を5mLの完全DMEM培地に再懸濁する。血球計数器(ノイバウアーチャンバー)およびトリパンブルー溶液を用いてMIO-M1細胞を計数し、以下の手順に従っている。
- ガラスカバーをノイバウアーチャンバー中央部に置きます。チャンバーを平らな面(例えば、テーブルまたは作業台)に置く。
- 等量のトリパンブルー染色剤を細胞と混合する。例えば、60 μL のトリパンブルーと 60 μL の細胞を 1:2 の希釈のために混合します。
- この混合物から、マイクロピペットで10μLをノイバウアーチャンバーにロードする。
- 装填されたノイバウアーチャンバーを顕微鏡ステージ上に置きます。次に、ライトをオンにして明るさを調整します。
- 顕微鏡ステージを最適な位置に移動し、細胞の鮮明な画像が得られるまで焦点を調整します。
- 血球計数の角に位置する4つの正方形(16に細分)の内側の細胞を数えます(体積:それぞれ0.1mm3)。
- 以下の式を用いて細胞濃度を計算する。
濃度 = (セル数 x 10.000)/平方数
濃度 = (セル数 x 10.000)/4
濃度 = セル数 x 2500
注:細胞希釈が行われる場合、得られた濃度は希釈前の元の濃度に変換する必要があります。
濃度 = (細胞数 x 2500 x 2) = (細胞数 x 5000 細胞/mL) - 細胞懸濁液を完全DMEM培地中で1 x 105 cells/mLに調整し、この細胞懸濁液2 mLを6ウェルプレート(2 x105細胞/ウェル)にプレートします。プレートを優しく振って、細胞を均質に分配する。6ウェルプレートを5%CO2インキュベーター中で37°Cで一晩インキュベートする。
アッセイ条件および対照
- 各実験に次の実験対照を含める。
- 自己蛍光制御(DCFH-DAプローブを含まない細胞、フローサイトメーターパラメータを設定するための制御)。
- 基礎制御(非刺激細胞)。
- 陽性対照(ROS誘導物質AまたはBで処理した細胞)。
- ネガティブコントロール(抗酸化化合物で処理した細胞)
- 試料(抗酸化化合物およびROS誘導物質、AまたはBで処理した細胞)。
アッセイの実施
注:アッセイは7日目に行われる。常に適切な無菌技術を使用し、特に指示がない限り、層流フードで作業してください。
- 低血清DMEMを調製する。4.5 g/L D-グルコースおよび110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含むDMEMを0.5%熱不活化FBS、10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、および50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンで補足する。MIO-M1が処理される日に新鮮な培地を準備してください。
- 6ウェルプレート(60%〜70%コンフルエント)をインキュベーターから層流フードに移す。上清を吸引し、細胞1xをPBSで洗浄した。1ウェルあたり2mLの低血清DMEMを添加し、6ウェルプレートを37°C、5%CO2で2時間インキュベートした。これは細胞を飢えさせるために行われます。
- 血清飢餓後、抗酸化化合物で細胞を6時間処理する。
- 上清を吸引し、希釈原液2mLを以下の条件に加える:陰性対照(抗酸化化合物で処理した細胞)および試料(抗酸化化合物およびROS誘導剤で処理した細胞、AまたはB)。
- 6ウェルプレートを37°C、5%CO2で6時間インキュベートする。
注:別の抗酸化化合物またはROS阻害剤を使用する場合は、刺激に最適な時間と濃度を標準化してください。
- 6時間のインキュベーション後、細胞をROSインデューサーAまたはBで30分間処理する。
- ポジティブコントロール(ROS誘導物質AまたはBで処理した細胞)およびサンプルウェル(抗酸化化合物およびROS誘導物質で処理した細胞、AまたはB)に刺激を加える。
注:ストックソリューションを氷の上に保管してください。 - 6ウェルプレートを37°C、5%CO2で30分間インキュベートする。
注:別のROSインデューサを使用する場合は、刺激に最適な時間と濃度を適切に標準化してください。
- ポジティブコントロール(ROS誘導物質AまたはBで処理した細胞)およびサンプルウェル(抗酸化化合物およびROS誘導物質で処理した細胞、AまたはB)に刺激を加える。
- セルにDCFH-DAプローブをロードします。
- 上清を吸引し、6ウェルプレート3x内の細胞をPBSで洗浄し、すべての刺激を除去した。
- 層流フードのライトを消し、暗闇の中で作業してください。5 mM DCFH-DAプローブストック溶液を1:1000に希釈し、15 mLチューブ内のフェノールレッドを含まないDMEM中の終濃度5 μM DCFH-DAを得た。
- 渦を用いて穏やかに混合し、この溶液を以下のウェルに1mL加える:基礎対照(非刺激細胞)、陽性対照(ROS誘導物質で処理した細胞)、陰性対照(抗酸化化合物で処理した細胞)、およびサンプルウェル(抗酸化化合物で処理した細胞、およびROS誘導物質、AまたはB)。
- フェノールレッドを含まない1mLのDMEMを自家蛍光制御細胞に加える。
- 6ウェルプレートを37°C、5%CO2で30分間インキュベートする。
メモ:プローブは光に敏感です。未使用のプローブソリューションをすべて破棄します。
4. フローサイトメトリー用細胞製剤
- 6時間後、プレートを氷の上に保ちます。このステップ以降、適切な無菌技術を使用して層流フードで作業する必要はありません。
- 細胞3xを1ウェルあたり2mLの冷たいPBSで洗浄する。0.5 mL の冷剥離バッファーを各ウェルに加えます。P1000ピペットを使用して上下に静かにピペッティングして細胞を回収します。
- 標識した1.5 mLチューブに集め、600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
注: 細胞を回収するときは、P1000 ピペットを 0.4 mL に設定して気泡の発生を避けてください。このステップ以降は、迅速に作業してください。 - 遠心分離が終了したら、細胞を入れた標識した1.5 mLチューブを氷上に置く。上清を慎重に捨て、タッピングで細胞ペレットを穏やかに解離させる。
- 標識した各1.5 mLチューブに1 mLのFACSバッファーを加え、細胞を洗浄した。必要に応じて、細胞ペレットの完全な解離のために、その最低強度で渦を使用する。600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 これらの手順をさらに2倍繰り返します。(全部で3回の洗浄を行う)。
- 最後の洗浄が終了したら、5mLの丸底ポリスチレンチューブ(フローサイトメトリーチューブ)にすべての実験条件について標識する(ステップ2を参照されたい。
- 遠心分離が終了したら、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。渦を用いて各1.5mLチューブ内のペレットを穏やかに解離させる。標識した5mL丸底チューブに移す。チューブがフローサイトメーターで分析されるまで、チューブを氷の上に保管します。
5. フローサイトメーターでのデータ取得
- フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、新しい実験を作成します。これを行うには、メニュー バーの [ 実験 ] に移動し、[ 新しい実験] (Ctrl + E) をクリックします。
- また、メニューバーの[ 表示 ]に移動し、[ ツールバー]、[ ステータスバー]、[ ブラウザ]、[ サイトメーター]、[ インスペクタ]、[ ワークシート]、[ 取得ダッシュボード] 、[ 双指数エディタ] のオプションをクリックして、ワークスペースにこれらのウィンドウを表示します。
- ソフトウェアの左側で、 Specimen_001をクリックします 。これにより、チューブ(Tube_001、Tube_002など)のリストが開きます。チューブにコントロールおよび異なる実験条件のラベルを付けるには、 Tube_001、Tube_002などをダブルクリックし、名前を変更します(ステップ2を参照)。
- 実験の サイトメーター設定 から、分析するチャンネル/パラメータ(FSC、SSC、FITC、APC、または象限を見るための他の蛍光色素)を最初のチューブで選択します。
- 現在のチューブ ポインタアイコンをクリックしてチューブ を選択すると、アイコンが緑色に変わります。「自家蛍光制御」チューブをアスピレーターアームに置き、ベースを左だけ慎重に動かします。
- 「自家蛍光制御」サンプルを実行するには、「集録ダッシュボード」ウィンドウに移動し、「 データの取得」をクリックします。FSC(x軸上)対SSC(Y軸上)のドットプロットを開きます。
- 順方向および側面散乱電圧をすばやく調整して、イベントがグラフに表示されるようにします。「取得ダッシュボード」ウィンドウで、「 取得の停止」をクリックします。この実験では、FSC - 200 V、SSC - 423 Vの電圧設定を使用しました。
- FITC電圧を設定するには、「ポジティブコントロール(ROS誘導剤AまたはBで処理した細胞)」を実行します。すべてのイベントがFITCのヒストグラムに表示されるように電圧を調整します。この場合、280Vの電圧を使用してください。「取得ダッシュボード」ウィンドウで、「 取得の停止」をクリックします。
- 再び「自家蛍光制御」チューブをアスピレーターアームの上に置きます。「集録ダッシュボード」ウィンドウで、「 データの取得」、「 データの記録」の順にクリックし、目的の停止条件 (50,000 イベントなど) を選択します。目的の細胞の周りにゲートを描き、死んだ細胞と破片を除きます。
注: これらは、メインの細胞集団よりもはるかに小さいイベントとして観察され、プロットの左下に表示されます。 - 集録が終了したら、チューブをアスピレータアームから取り外します。機器は自分自身を洗うでしょう。[獲得ダッシュボード]ウィンドウで、[ 次のチューブ ]をクリックし、 基底コントロール(非刺激細胞)を実行します。 「データの取得 」をクリックし、「 データの記録」をクリックします。
- 最初のゲート(死細胞と破片を除外するゲート)から、FITC(x軸上)対APC(y軸上)の別のドットプロットを作成します。象限ゲートを描画し、座標を調整して、FITC対APCプロットの左下の象限のイベントを視覚化します。
- 次のサンプルを記録するには、チューブを取り外し、「 次のチューブ」をクリックして「データを取得」>「データ>記録」をクリックします。
注:ここで使用されるフローサイトメーター( 材料表を参照)は、チューブあたり最大1 x 106 イベントを記録します。 - すべてのチューブの記録が終了したら、データをディスク D にエクスポートします。これを行うには、[ ファイル]>[FCSファイル>エクスポート]>クリックし、[3.0または3.1バージョンを選択]をクリックします。
メモ: このプロトコルでは、1 つのソフトウェアを使用したデータ収集 ( 材料表を参照) について詳しく説明していますが、他のフローサイトメトリーソフトウェアを使用することもできます。集録パラメータ(FSC、SSC、およびFITCなど)は、同じ方法で設定して結果を得ることができます。
6. 取得したデータの解析
- ソフトウェアを開き、[サンプルの追加] アクション ボタンを使用して サンプルを追加します 。タスク バーまたは [ナビゲーション] バンドにあります。
- 「 サンプルの追加」をクリックします。
- ファイル ブラウザーを使用して、実験フォルダーに移動します。
- 「実験」フォルダーを選択し、「 選択」をクリックします。
メモ: サンプルファイルは、「すべてのサンプル」グループの一部としてワークスペースにロードされます。
- ワークスペース内の最初のサンプル「 自己蛍光制御」をダブルクリックします。
メモ: このアクションにより、前方散乱 (X 軸の FSC-A) パラメータと側方散乱 (Y 軸の SSC-A) パラメータに沿ってイベントをプロットするグラフウィンドウが開きます。 - ポリゴン ゲートを描画して、死細胞と破片を除く目的のセルを分離します。
- ポリゴンゲートツール をクリックします。
- プロット内をクリックしてポリゴンゲートを構成します。必要なだけ多くの側面を作成します。
- 最後のポイントをダブルクリックしてポリゴンを閉じ、目的のゲートを作成します。
- 「MIO-M1セル」などのゲートの名前を入力し、「 OK」を押します。
メモ: 新しいグラフプロットウィンドウが表示され、MIO-M1 イベントのみが表示され、デッドセルや破片は表示されません。 - 分析するすべてのサンプルで繰り返します。
- プロットをヒストグラムに変更します。これを行うには、 X 軸パラメーター ラベル をクリックし、[ FITC-A] を選択します。 Y 軸パラメーター ラベル をクリックし、[ ヒストグラム] を選択します。これにより、プロットが 1 次元ヒストグラムに変更されます。
- 「統計の追加」 ウィンドウを使用して統計を追加します。
- ヒストグラムグラフの下にある [ 統計の追加] をクリックします。プログラムは新しい統計ウィンドウを開きます。
- 新しいウィンドウの左側で、統計量 「幾何平均」を選択します。
- 母集団 MIO-M 1 セルを選択します。
- 使用可能なパラメーターのリストから、「 FIT-C」を選択します。
- [ 追加] ボタンをクリックして、解析に適用します。
注: これにより、サンプルゲーティングツリーに新しい統計量「幾何平均:FITC」が作成され、その値がワークスペースに表示されます。
- これらの幾何平均値を統計プログラムに入れて分析します。
- L アイコンをクリックしてレイアウトエディタを開きます。このアイコンは、ワークスペースの [メニュー] タブにあります。ワークスペースウィンドウとレイアウトエディタを並べて配置します。
メモ: レイアウトエディタは、複数のグラフプロットと統計を単純なグラフィカルレポートに表示するためのツールを備えた独立したワークスペースウィンドウです。これは、PDFやJPGなど、お好みの拡張子ファイルでエクスポートできます。- 「ワークスペース」ウィンドウのサンプルのゲーティングツリーから、 MIO-M 1 セル母集団 をレイアウトエディタにドラッグします。
- ゲート内のイベントを含むヒストグラムグラフがレイアウトエディタに表示されていることを確認します。その他の基本情報は、以下のテキストボックスで詳しく説明します。
- すべてのサンプルをドラッグして、同じグラフで比較します。プログラムはそれらと重なります。
- ヒストグラムグラフを右クリックし、[ プロパティ] を選択します。プログラムは新しいグラフ定義ウィンドウを開きます。このウィンドウには 4 つのタブ (注釈、フォント、凡例、および指定) があります。「 指定 」タブをクリックし、Y 軸を「自動」から「モーダル」に変更します。 「適用」をクリックします。
- サンプルを右クリックし、色付け、線のスタイル、線の太さなどを変更してグラフをパーソナライズします。
- イメージを書き出すには、[ファイル] タブをクリックし、その直後に [ドキュメント] バンドの [ イメージの保存 ] を選択します。画像ファイルの種類(PDFなど)を選択します。
メモ: 保存ダイアログボックスが開き、保存場所を選択するように求められます。「 保存」をクリックします。
- 分析をワークスペース (.wsp) ファイルとして保存します。
- 左上隅にある [ サイトメトリー分析 ] アイコンをクリックし、[ 名前を付けて保存] を選択します。
- [ ワークスペースとして保存 (WSP)] を選択して、データと分析を含むドキュメントを保存します。
- ワークスペースファイルの名前を入力します。
- 「 保存」をクリックします。
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Representative Results
プロトコルのセクションで説明したように、我々は、ROS誘導剤AまたはBで刺激されたMIO-M1細胞からの蛍光プローブDCFH-DAによるROS産生のフローサイトメトリー検出を実証する代表的および定量的データを示した。予想通り、我々は、自己蛍光レベルを超える非刺激細胞におけるFITC蛍光の変化を観察した(図1A、「基礎対照」対「自家蛍光制御」の比較、ドットプロットグラフ)。これは、MIO-M1細胞におけるROSの基礎産生のために起こった。(図1Bは、「基底制御」対「自己蛍光制御」を比較し、ヒストグラムグラフ)。
興味深いことに、細胞をROS誘導物質AまたはBで刺激した場合、FITC蛍光の有意な増加が観察された(図1B、「ROS誘導因子A」サンプル対「基礎対照」および「ROS誘導物質B」試料対「基底対照」、ヒストグラムグラフ)。また、細胞をROS誘導剤AまたはBの前に抗酸化化合物で処理した場合、蛍光レベルは基礎レベル付近で減少した(図1B、「ROS誘導剤A」対「抗酸化化合物による前処理6時間+ROS誘導剤Aで30分」、および「ROS誘導剤B」対「抗酸化化合物6時間+ROS誘導剤Bによる前処理30分」を比較し、 それぞれ、ヒストグラムグラフ)。注目すべきは、基礎対照に関して抗酸化化合物(6時間)で処理した細胞において蛍光シグナルに差は認められなかった。(図1Bは、「6h抗酸化化合物」対「基礎対照」を比較する)。
これらの結果は、データがFITCの幾何平均として提示された場合にも明らかであった(図1C)。グラフに見られるように、平均値および対応する標準誤差(SEM)が示されている。
このプロトコルの主な利点は、時間の経過に伴うROSの変化を追従するアプリケーションです。この点に関して、MIO-M1細胞をROS誘導物質Cで2時間、4時間、および6時間処理した場合、ROSの有意かつ時間依存的な増加を観察することができました(図2)。
このプロトコールの最適化のために、我々は細胞を回収するための3つの異なる戦略(0.5%トリプシン-EDTA、アキュターゼ細胞剥離溶液、および剥離バッファー)を試みた(データは示さず)。
図1:MIO-M1細胞におけるDCFH-DAプローブを用いたROS誘導物質AまたはBに応答したROSの測定:(A)「基底対照」対「自己蛍光制御」条件の比較、代表ドットプロットFL1(519nm)対FL2(660nm)。(b)ROS誘導物質AもしくはBによるMIO−M1細胞の刺激時にDCFH−DAプローブによって誘導される蛍光についての代表的なヒストグラム、30分間、またはROS誘導剤A、B、もしくはビヒクルの抗酸化化合物で6時間および30分間前処理する。(c)MIO-M1細胞における全ての刺激に対するFITC蛍光の幾何平均。データはSEM±平均として提示され、一元配置分散分析によって分析され、続いてダネットの事後検定が続きます。**p < 0.01、***p < 0.001 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MIO-M1細胞におけるDCFH-DAプローブを用いたROS誘導物質C処理に応答したROS残業時間の測定:ROS誘導物質Cで2時間、4時間、および6時間処理したMIO-M1細胞にDCFH-DAプローブを負荷し、ROSレベルを決定した。ROS誘導物質CによるMIO−M1細胞の刺激時にDCFH−DAプローブによって誘導される蛍光強度についての代表的なヒストグラムを2時間、4時間、および6時間。上記で詳述した刺激に対するFITC蛍光の幾何平均。データはSEM±平均として提示され、一元配置分散分析によって分析され、続いてダネットの事後検定が続きます。ns、有意ではない、**p<0.01、***p<0.001です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 保管条件 | 手記 | |||||
| 水酸化ナトリウム(NaOH) 10 M, 1 L | 400グラムNaOHペレット | 蒸留水を1 Lに | ティッカー | 「注意」:濃縮NaOH溶液の調製は発熱反応を引き起こす。化学的な火傷やガラスビーカーの破損を避けるために、細心の注意を払わなければなりません。可能であれば、重いプラスチック製のビーカーを使用してください。 | |||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 X, 1 L | 80グラム NaCl | 蒸留水を1 Lに | ティッカー | pHを7.4に調整し、溶液をろ過する。 | |||
| 2 グラム KCl | |||||||
| 11.5 gNa2HPO4·7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 0.5 M pH 8.0, 1 L | 186.1 gNa2EDTA·2H2O | 蒸留水を1 Lに | ティッカー | EDTAの二ナトリウム塩は、NaOHの添加によって溶液のpHが約8.0に調整されるまで、中性の水または溶液に溶解しない。pHを8.0に調整し、溶液を滅菌する。 | |||
| 10% w/v アジ化ナトリウム (NaN3), 100 mL | 10グラムNaN3 | 蒸留水を100mLに | ティッカー | ||||
| 剥離バッファー、100 mL | 180 mgのグルコース | PBS 1X ~ 100 mL | 4°C | ||||
| 0.6 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| フローサイトメトリー染色バッファー(FACSバッファー)、100 mL | 2 mL ウシ胎児血清 (FBS) | PBS 1X ~ 100 mL | 4°C | NaN3は防腐剤として添加される。 | |||
| 1 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| 1 mL 10% w/v アジ化ナトリウム | |||||||
| 5 mM 2',7'-DCFH-DA, 1 mL | 2.4 ミリグラムDCFH-DA | ジメチルスルホキシドを1mLに | -20 °C 光から保護 | 1.5 mL チューブに 20 μL を軽く混合し、アリコートします。複数の解凍/凍結サイクルを避けてください。私たちの推奨事項は、実験日からすべての未使用のプローブ溶液を破棄することです。 | |||
| 0.4% w/v トリパンブルー 10 X, 50 mL | 0.2 g トリパンブルー | PBS 1X ~ 50 mL | 4°C | ||||
表 1: バッファーのレシピ
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Discussion
癌、炎症性疾患、虚血/再灌流、虚血性心疾患、糖尿病、網膜症などのいくつかの病理学的状態、および老化などの生理学的状況は、ROSの過剰産生6、7、8、9、10、11につながる。したがって、ROSの変調に関与する経路の検出、測定、および理解は、多くの疾患にとって重要な標的である。DCFH-DAのようなROSレベルを測定するためのプローブの使用は、科学文献26、27、28でアクセス可能で、広く説明され、受け入れられています。この記事では、MGCのフローサイトメトリーによってROSレベルを測定および定量するための詳細で再現可能なプロトコルについて説明します。
この方法の使用の利点は、DCFH-DAプローブがROSによって酸化され、蛍光DCF生成物を生成すると、これは、プレートリーダー、共焦点顕微鏡、またはフローサイトメーターで測定することができます。プレートリーダーの欠点は、全蛍光を測定することです。その結果、プレートリーダーは、細胞内蛍光と培養液中の化学反応によって生成される細胞外蛍光とを区別しない。共焦点顕微鏡は、細胞にDCFH-DAプローブをロードし、37°Cの培養チャンバーでリアルタイムで見ることができるため、便利なツールです。 細胞内のROSの形態および位置は、この方法論で検出することができるが、ROSレベルは定量的測定を欠いている。フローサイトメトリーの強みは、生細胞における細胞内蛍光を測定する能力にある。蛍光を発する細胞の数に関する定量的データ、ならびに蛍光の幾何学的手段は、25を得ることができる。
DCFH-DAプローブを使用する場合は、実際に測定された内容を考慮に入れることが重要です。前述のように、DCFH-DAは複数のROS種を測定するため、緑色プローブから生じる蛍光はROS種29の種類を区別するために使用することはできません。これに関して、異なるプローブがROSのタイプを識別できることが知られている。例えば、ジヒドロエチジウム(DHE)プローブは、スーパーオキシドによって酸化され、蛍光生成物2-ヒドロキシエチジウム(518nmでの励起および605nmでの発光)を生成するが、この生成物は、HPLC30,31などのより時間のかかる技術の使用なしには区別できない。別のプローブは、ミトコンドリアスーパーオキシド指標(材料表参照)であり、これは、生細胞31、32のミトコンドリアにおけるスーパーオキシドの高度に選択的に検出するための新規な蛍光発生プローブである。しかしながら、侮辱または異なる製品の抗酸化能力の評価後の総ROSレベルの測定およびROSの増加の目的のために、適切な対照と共にDCFH−DAプローブを使用することは便利であり、許容可能である25、28、29。
非常に重要な問題は、適切な実験コントロールの選択と使用です:自己蛍光コントロール(DCFH-DAプローブのない細胞)、基礎コントロール(非刺激細胞)、ポジティブコントロール(ROSインデューサーで処理された細胞)、陰性コントロール(抗酸化化合物で処理された細胞)、およびサンプルの問題(抗酸化化合物およびROSインデューサーで処理された細胞)。有用なヒントは、蛍光プローブとの干渉を減らすためにフェノールレッドを含まない培地を使用することです。
また、実験処理を終了する30分前にDCFH-DAプローブを細胞にロードすることをお勧めします。DCFH-DAの濃度(我々の場合は5μM)の標準化は便利であり、細胞の種類や細胞の活性化状態によって異なる可能性があります。私たちのアドバイスは、5μMと10μMから始めてプローブ濃度を設定し、実験における染色の有効性を確認することです。
要約すると、健康または疾患における酸化還元バランスを分析することは、酸化ストレス応答を測定するための信頼できる方法を確立するために極めて重要である。したがって、このプロトコルは、フローサイトメトリーによって生MGC中のROSレベルを定量するためのシンプルで高速で強力なツールです。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、CIBICI(アルゼンチン、コルドバ、コリセトバ)のマリア・ピラール・クレスポとポーラ・アレハンドラ・アバディに、フローサイトメトリーの支援に、ガブリエラ・フルランとノエリア・マルドナドの細胞培養支援に感謝したい。我々はまた、ビデオ制作と編集のためにビクター・ディアス(FCQの制度コミュニケーション担当長官)にも感謝する。
この記事は、Secretaría de Ciencia y Tecnología、Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021、Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT)、Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (すべてM.C.S.への資金提供を受けたものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
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