Summary
פרוטוקול המתאר את היווצרותם של בלסטואידים אנושיים היוצרים ביעילות, בזמן וברצף תאים דמויי בלסטוציסט.
Abstract
מודל של הבלסטוציסט האנושי שנוצר מתאי גזע (בלסטואיד) יתמוך בהתקדמות מדעית ורפואית. עם זאת, כוח החיזוי שלו יהיה תלוי ביכולתו לשחזר ביעילות, בזמן ובנאמנות את רצפי התפתחות הבלסטוציסטים (מורפוגנזה, מפרט, דפוס), וליצור תאים המשקפים את שלב הבלסטוציסט. כאן אנו מראים שתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תמימים בתרבית בתנאי PXGL ולאחר מכן מעוכבים באופן משולש עבור ההיפו, משנים את גורם הגדילה β, ומסלולי קינאז חוץ-תאיים המווסתים על ידי אותות עוברים ביעילות מורפוגנזה ליצירת בלסטואידים (>70%). בהתאם לתזמון ההתפתחותי (כ-4 ימים), הבלסטואידים פותחים את רצף המפרט הבלסטוציסטי על ידי יצירת אנלוגים של הטרופולסט והאפיבלסט, ולאחר מכן היווצרות אנלוגים של האנדודרם הפרימיטיבי והטרופולסטים הקוטביים. התוצאה היא היווצרות של תאים הדומים לשעתוק לבלסטוציסט (>96%) ומיעוט של אנלוגים לאחר ההשתלה. בלסטואידים מעוצבים ביעילות על ידי יצירת הציר העוברי-אבמבריוני המסומן על ידי הבשלת אזור הקוטב (NR2F2+), אשר רוכש את הפוטנציאל הספציפי להיצמד בכיוון לתאי רירית הרחם מגורה הורמונלית, כמו ברחם. בלסטואיד אנושי כזה הוא מודל מדרגי, רב-תכליתי ואתי לחקר ההתפתחות וההשתלה האנושית במבחנה.
Introduction
מחסור במודלים ניסיוניים הגביל את ההבנה של עובריות אנושיות מוקדמות. הידע הנוכחי על היבטים ספציפיים לבני אדם בהתפתחות העוברית נגזר מעודפי עוברים להפריה חוץ גופית (IVF) שנתרמו למחקר. עם זאת, הזמינות המוגבלת, הקשיים של מניפולציות ניסיוניות ואיכות משתנה של העוברים מעכבים את החקירות המדעיות. להיפך, מודל נאמן במבחנה של עוברים אנושיים יאפשר מניפולציות ניסיוניות מורכבות, ובכך יספק הזדמנות אתית להשלים את המחקר על עוברים אנושיים 1,2,3,4. מודל שפותח בעבר של בלסטוציסטים של עכברים משלב תאי גזע עובריים של עכברים ותאי גזע טרופובלסטים5. בפרוטוקול מפורט זה, שיטה ליצירת מודל של הבלסטוציסט האנושי מתאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים הנאמנים לקריטריונים של בלסטוציסט יסודי מתוארת6.
ארבעה קריטריונים לבלסטואידים אנושיים. כאן, בניסיון לקבוע הגדרה סטנדרטית של בלסטואידים אנושיים, אנו מציעים ארבעה קריטריונים מינימליים. אף על פי שאינם ממצים, קריטריונים אלה עשויים לשמש בסיס להערכת הפרמטרים המאפשרים היווצרות של בלסטואידים אנושיים (איור 1A). (1) בלסטואידים צריכים להיווצר ביעילות במונחים של מורפולוגיה ושל יצירת האנלוגיות של שלוש השושלות כלומר, אפיבלסט (Epi), trophectoderm (TE) ואנדודרם פרימיטיבי (PrE). חוסר יעילות עשוי להצביע על מצב תא התחלתי לקוי או על מצב תרבית (למשל, מדיום בלסטואידי). (2) בלסטואידים צריכים ליצור אנלוגים של שלוש השושלות בהתאם לרצף ההתפתחותי (Epi/TE first, PrE/polarTE אחרון)7,8 והתזמון (אינדוקציה ~ 3 ימים; ימים עובריים 5-7)7,9. (3) בלסטואידים צריכים ליצור אנלוגים של שלב הבלסטוציסט, אך לא של שלבים לאחר ההשתלה (למשל, אפיבלסט לאחר ההשתלה, טרופובלסט או תאי אמניון). (4) לבסוף, בלסטואידים צריכים להיות מסוגלים לשחזר תכונות פונקציונליות של השתלה והתפתחות בלסטוציסט. באמצעות פרוטוקול זה, בלסטואידים אנושיים נוצרים ביעילות באמצעות קווי תאים מרובים (>70%), מסוגלים ליצור את האנלוגיות התאיות הבלסטוציסטיות ברצף ובתוך 4 ימים, והאנלוגיות דומות מבחינה שעתוק לשלב הבלסטוציסט (>96% בהתבסס על מספר ניתוחים)6,10,11. לבסוף, בלסטואידים מייצרים בחוזקה את הציר העוברי-אבמבריוני, המאפשר להם לקיים אינטראקציה עם תאי רירית הרחם מגורה הורמונלית דרך אזור הקוטב, ולהרחיב בחוזקה את השושלות על תרבית מורחבת (שווה זמן: יום עוברי 13).
החשיבות של מצב התא ההתחלתי. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) ניתנים לייצוב במצבים שונים המנסים ללכוד שלבי התפתחות מדויקים. מצבים אלה סובלים על ידי תנאי תרבית אשר, למרות שהם עדיין לא אופטימליים, מגבילים את התאים בשלב טרום ההשתלה ( ~ ימים עובריים 5-7) או לאחר ההשתלה (~ ימים עובריים 8-14) אפיבלסט שלב12. ניתוח תעתיק הראה כי hPSCs בתרבית PD0325901, XAV939, Gö6983, וגורם מעכב לוקמיה (LIF; המכונה PXGL hPSCs נאיביים)13,14 דומים יותר לאפיבלסט הבלסטוציסט בהשוואה ל- hPSCs בתרבית בגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 2 ו- activin15 (המכונה hPSCsראשוניים 12) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מורחבים אנושיים (hEPSCs)16 (ראה ניתוח בהפניות17, 18,19). בהתאם לכך, התמלול של hPSCs ראשוניים מתאים בצורה הטובה ביותר עם אפיבלסט קוף צינומולגוס לאחר השתלה/טרום-גסטרולציה20. קריטריונים מולקולריים נוספים, כמו ביטוי טרנספוזון, מתילציה של דנ"א ומצב כרומוזום X, אישרו כי וריאציות של המצב הנאיבי דומות יותר לאפילסט הבלסטוציסט בהשוואה למצב הראשוני17,21. לבסוף, שורות של hPSCs תמימים נגזרו בהצלחה ישירות מבלסטוציסטים באמצעות תנאי תרבית PXGL22.
תאי בלסטוציסט מוקדמים אנושיים עדיין אינם מבוצעים. מפרט שושלת מורין מתרחש משלב המורולה המקדים את שלב הבלסטוציסט23. להיפך, ניסויי דיסוציאציה וצבירה מחדש הראו כי תאי הטרופיקטודרם האנושיים של בלסטוציסטים מוקדמים עדיין אינם מבוצעים24. בהתאם לכך, ניתוח התאים של בלסטוציסטים אנושיים על ידי ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) הראה כי מפרט השושלת הראשונה (trophoblast/epiblast) מתרחש לאחר היווצרות חלל הבלסטוציסט7. המפרט האנושי הנדחה הזה תואם תצפיות שלפיהן hPSCs חזקים ליצירת טרופולסטים 25,26,27 כאשר PSCs של עכברים מחויבים במידה רבה לשושלת האפיבלסטים. תצפיות משולבות אלה הובילו לאפשרות ש-hPSCs תמימים משקפים שלב בלסטוציסטי ושומרים על הפוטנציאל ליצור את שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. לאחרונה, העוצמה של hPSCs לציין אנלוגים חוץ-אמבריוניים הוצעה לעבור מ trophectoderm לאמניון במהלך ההתקדמות ממצב נאיבי למצב ראשוני27. לפיכך, hPSCs נאיביים דומים יותר לשלב טרום ההשתלה 17,18,21 ויש להם יכולת משופרת ליצור טרופובלסטים בהשוואה ל- hPSCsראשוניים 27, hEPSCs 16, או מצבי תכנות מחדש ביניים28, אשר נוטים ליצור אנלוגים לאחרההשתלה 10 (איור 1B ). מצב התא ההתחלתי הוא אפוא חיוני ליצירת האנלוגיות החוץ-ממבריוניות המתאימות. אף על פי שעדיין נותר לבצע ניתוח יסודי זה לצד זה של אנלוגים טרופיקטודרמים שהומרו, נראה כי מצב נאיבי של PXGL המשקף את הבלסטוציסט המוקדם חשוב ליצירת בלסטואידים בעלי נאמנות גבוהה.
הנחיית אפיון ומורפוגנזה על ידי איתות עיכוב מסלולים. העיכוב של מסלול האיתות של ההיפו הוא מנגנון שמור המניע את מפרט הטרופולסטים בעכברים, פרות ובני אדם 9,29,30. כמו כן, מאז 2013, ידוע כי עיכוב של NODAL (A83-01) ואת קינאז מווסת אותות חוץ תאיים (ERK; PD0325901 או שווה ערך) והפעלת מסלולי האיתות של החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP) מפעילה hPSCs ראשוניים כדי להפעיל את רשת השעתוק הקשורה לשושלת הטרופולסט 25,31,32,33,34. יתר על כן, לאחרונה מספר דיווחים אישרו גם כי עיכוב של מסלול NODAL ו- ERK והפעלה של BMP להקל על ההבחנה trophoblast מ hPSCsנאיביים 25,31,32,33,34. לבסוף, אם מפרט הטרופוגובלסט מופעל ממצב נאיבי, התאים משחזרים היבטים של ההתקדמות ההתפתחותית של הטרופיקטודרם26. עם זאת, קווים המתחדשים בעצמם המשקפים את הגביע הבלסטוציסטי לא יוצבו במבחנה. לאחר אפיון טרופולסט, אינדוקציה של מקדם הגדילה האפידרמלי (EGF) ומסלולי האיתות Wnt יחד עם עיכוב HDAC עשויים להקל על התקדמות התפתחותית של טרופובלסטים34,35 ולייצב תאים לקווים של תאי גזע טרופובלסטים אנושיים (hTSCs) המשקפים ציטוטרופיובלסטים לאחר ההשתלה 18,35. קווים כאלה יכולים להיגזר הן מבלסטוציסטים והן מרקמות שליה35.
השושלת החוץ-אמבריונית השנייה, המכונה PrE, מוגדרת על שם טרופולסטים ומקורה באפיבלסט 7,9. בניגוד ל-murine PrE36, המקבילה האנושית נחשבת כבלתי תלויה ב-FGF המאותת 37,38. קווים המשקפים את האנדודרם החוץ-אמבריוני (המכונה nEnd) נוצרו מ-hPSCs נאיביים על ידי אינדוקציה של מסלולי איתות באמצעות activin A, Wnt ו-LIF39. לא עולה בקנה אחד עם ניסויים בעיכוב עוברים, עיכוב ERK הוכח כמונע היווצרות של תאי nEND כאלה במבחנה39. עד כה, קווים כאלה לא נגזרו ישירות מבלסטוציסטים.
לאחרונה, מודלים של העובר המוקדם נוצרו על ידי שילוב וריאציות של המדיה שפותחה בעבר עבור תאי hTSCs35 ו- nEND39 ובכך באמצעות מפעילים של גורם הגדילה המשתנה - β (TGF-β), EGF ומסלולי איתות Wnt 28,40. מודלים עובריים אלה נוצרים ביעילות נמוכה (10%-20%) ויוצרים תאים הדומים לשלב10 שלאחר ההשתלה ולא לפני ההשתלה, כולל אנלוגים של אפיבלסט לאחר ההשתלה, טרופובלסט, אמניון, גסטרולה, רקמות מזודרמליות (~ יום עוברי 14), וציטוטרופיובלסטים10. להיפך, עיכוב משולש של מסלולי היפופו, ERK ו-TGF-β מנחה ביעילות את היווצרותם של בלסטואידים הכוללים תאים דמויי בלסטוציסט41. יחד עם מצב התא ההתחלתי, אנו מציעים שעיכוב מסלולים משולשים (היפו, ERK, TGF-β) הוא הפרמטר החיוני השני ליצירת בלסטואידים בעלי נאמנות גבוהה (איור 1B).
הערכת מצב התא והשלב המשתקף באמצעות scRNAseq. ניתן להעריך את מצבם של תאים המרכיבים בלסטואידים באמצעות ניתוח scRNAseq. ניתן למדוד את דמיון השעתוק שלהם לשלבים עובריים ספציפיים באמצעות תאים בלסטואידים בלבד ובהשוואה עם hPSCs ראשוניים או hTSCs המשקפים שלבים לאחרההשתלה 20,35. ביצוע ניתוחי אשכולות תוך שימוש ברמות שונות של הגדרה חושף כיצד תת-אוכלוסיות מתמזגות בהדרגה כאשר ההגדרה פוחתת, ובכך חושפת את קווי הדמיון של האשכולות. למרות שניתן למדוד את האופטימיות במספר האשכולות42, אשכולות ברזולוציה גבוהה מודיעים גם על נוכחותם הסופית של תת-אוכלוסיות חריגות קטנות, למשל המשקפות את שלב10 שלאחר ההשתלה. הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין אשכולות יכולים לספק מידע על האנלוגיות שלהם בתהליך הפיתוח על ידי הערכת רמות הביטוי של מערכות גנים ייחוס המגדירות שושלות ספציפיות לבמה. זה מאפשר למדוד את ההעשרה של תת-אוכלוסיות בלסטואידיות באמצעות מפות מרחק לא מפוקחות (למשל, באמצעות גנים מועשרים עליונים) או באמצעות ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)43. באמצעות פרוטוקול בלסטואיד זה, נוצרים רק שלושה אשכולות עיקריים המשקפים באופן שעתוק את שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. אשכול אחד כולל גם את ה-hPSCs הנאיביים הראשוניים וגם את אנלוגיית האפיבלסט של הבלסטואידים. ניתוח תאים בנקודות זמן שונות הראה את האופי הרציף של מפרט השושלות (טרופובלסטים מתחילים לציין תוך 24 שעות, ותאי אנדודרם פרימיטיביים בתוך 60 שעות). אשכולות ברזולוציה גבוהה לכדו תת-אוכלוסייה של תאים (3.2%) המבטאים גנים ספציפיים לעוברים בשלב הגסטרולציה (אולי מזודרם או אמנון). יש לציין כי ה-hPSCs הנאיביים הראשוניים היוו גם 5% מהתאים דמויי ההשתלה לאחר ההשתלה, כפי שתואר קודם לכן44. בניתוח שני, ניתן למזג תאים בלסטואידים בסיליקו עם תאי ייחוס המבודדים מ-concepti בשלבים שונים 45,46,47 על מנת להסיק שקילות שלבים. כאן, תאים שבודדו מתפיסות טרום-השתלה45,46, בלסטוציסטים בתרבית במבחנה 45 ועוברים בשלב ההשתלה47 שימשו כנקודות ייחוס. באמצעות פרוטוקול זה, כומת כי התאים הבלסטואידיים הלא תואמים שנחשפו על ידי אשכולות ברזולוציה גבוהה אכן מתקבצים עם מזודרם ואמניון לאחר ההשתלה. בשלבים עתידיים, יש להשלים את מדידת השעתוק עם ניתוח ביטוי טרנספוזון, מתילציה של DNA ומצב כרומוזום X המספקים גם ציוני דרך של שלבים התפתחותיים21.
הערכת היווצרות צירים ותפקודים אחרים של בלסטואידים אנושיים. בלסטוציסט בוגר מאופיין על ידי היווצרות של הציר העוברי-אבמבריוני דפוס trophoblasts עבור השתלה. באמצעות פרוטוקול בלסטואיד זה, נוצר ציר חזק המודגם על ידי הבשלה של הטרופובילסטים הפרוקסימליים (למשל, NR2F2+/CDX2-) הרוכשים את היכולת להיצמד לתאי האורגנואידים של רירית הרחם רק כאשר הם מגורה הורמונלית48,49. השוואה עם טרופוספרות שאינן יוצרות את האפיבלסט מראה כי תאים פנימיים אלה גורמים לטרופובלסטים קרובים להבשיל כדי לתווך את ההתקשרות הראשונית לאנדומטריום. כאשר הם מתורבתים במדיום תרבותי מורחב המיועד לבלסטוציסטים של קופי צינומולגוס50, כל שלוש השושלות מהבלסטואיד מתרחבות בעקביות במשך שישה ימים נוספים (זמן שווה ערך ליום 13) אם כי הארגון שלהן אינו משקף את השלב ההתפתחותי הזה.
ההשלכה של בלסטואידים אנושיים בעלי יעילות גבוהה ונאמנות גבוהה. שימור העקרונות ההתפתחותיים שהתגלו באורגניזמים מודליים קשה מטבעו לבחון בתפיסה האנושית בשל הגישה המוגבלת והקשיים הטכניים במניפולציה גנטית ופיזית שלה. מודל בלסטואידי בעל יעילות גבוהה ונאמנות גבוהה יאפשר בדיקות גנטיות ותרופות בתפוקה גבוהה, הנמצאות בבסיס תגליות מדעיות וביו-רפואיות. בנוסף, שילוב של שינויים גנטיים מורכבים כדי לשנות ולתעד תהליכים ביולוגיים ישלים מחקרים כאלה. בסך הכל, אנו מציעים כי העיכוב המשולש (היפו, TGF-β, ERK) של hPSCs PXGL נאיביים הוא מוליך להיווצרות יעילה של בלסטואידים אנושיים בעלי נאמנות גבוהה העומדים בארבעת הקריטריונים המינימליים. האופי הניתן להרחבה ורב-תכליתי של פרוטוקול זה הופך אותו למתאים ליצירת השערות ממוקדות שניתן לאמת לאחר מכן באמצעות בלסטוציסטים אנושיים. ככאלה, בלסטואידים אנושיים לא יחליפו את השימוש במושגים אנושיים למחקר במבחנה , אלא עשויים לשמש כדרך רבת עוצמה לתעל את המחקר באמצעות גישות ניסיוניות שלא היו נגישות בעבר בלב תהליך הגילוי המדעי והביו-רפואי. הפרוטוקול מראה כיצד ליצור בלסטואידים אנושיים וגם כיצד לנתח את התאים הכלולים בתוך הבלסטואיד.
Protocol
הקווים המנחים לחקר תאי גזע ותרגום קליני של האגודה הבינלאומית לחקר תאי גזע (ISSCR) ממליצים כי מחקר על בלסטואידים אנושיים מותר רק לאחר בדיקה ואישור באמצעות תהליך סקירה מדעי ואתי מיוחד 3,4. כל ההליכים הניסוייים נערכו על ידי ביצוע ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המכון לביוטכנולוגיה מולקולרית של האקדמיה האוסטרית למדעים (IMBA) באישור Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. עמידה בהנחיות אלה נחוצה לפרסום תוצאות מחקר בכתבי עת מדעיים.
1. תרבית של תאי גזע עובריים נאיבים אנושיים במצב PXGL
הערה: ניתן להשיג hPSCs נאיביים ממעבדות רלוונטיות. קווים המשמשים כאן התקבלו מהמעבדות של יאסוהירו טקשימה (כיום ב- CiRA, קיוטו, יפן) ושל אוסטין סמית '(כיום במכון מערכות חיות, אקסטר, בריטניה). לחלופין, ניתן לאפס hPSCs נאיביים בבית מקווי hPSCs ראשוניים כפי שתואר קודם לכן13,14. hPSCs נאיביים נראים יציבים עבור מעברים מרובים (> 15) אך איכות התרבות יכולה להשתנות עם הזמן. אם האיכות של hPSC נאיבי יורדת, להפשיר בקבוקון חדש של תאים או ליצור hPSCs נאיביים דה נובו מ- PSCs ראשוניים. לכל הרכבי המדיה ראו טבלה משלימה 1.
- הכנת שכבת מזין עוברי עכבר מוקרן (MEFs)
- יום לפני המעבר של hPSCs תמימים, הכינו צלחת תרבית תאים בת 6 בארות עם שכבות MEF מוקרנות על ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן.
- מצפים צלחת תרבית תאים של 6 בארות עם 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין ב-PBS לבאר. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר את תמיסת הג'לטין.
- הכן MEF בינוני ב 37 °C (84 °F).
- להפשיר MEFs באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק גוש קרח קטן. ממיסים את נפח הבקבוקון עם 1 מ"ל של מדיום MEF מוכן באמצעות פיפטה P1000.
- מעבירים את מתלי התא לצינור של 15 מ"ל. סובבו את המתלים ב-200 x גרם למשך 4 דקות. שאפו את הסופרנטנט והחזירו את גלולת ה-MEF על ידי הוספת מדיום MEF טרי (מספיק ל-1.5 מ"ל לבאר).
- ספרו את התאים באמצעות שקופיות ספירת תאים והוסיפו 300,000 תאים לכל באר והעבירו את הצלחת לחממה נורמוקסית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: אם MEFs מתנתקים עם הזמן, ניתן להוסיף MEFs טריים למדיום PXGL במהלך שינוי מדיה שגרתי.
- העברת תאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים אנושיים
- לפני העברת hPSCs, בדוק את המורפולוגיה שלהם תחת המיקרוסקופ. למושבות יש בדרך כלל מורפולוגיה בצורת כיפה עם גבולות בהירים ומוגדרים. אם המושבות הבודדות מראות מורפולוגיה שטוחה יותר או אם מושבות מובחנות מתחילות לצוץ, בצע את ההוראות של שלב 1.2.8.
- לשאוף את המדיום ולשטוף תאים עם PBS פעם אחת. הוסף 500 μL של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של צלחת 6 בארות.
- דגירה של התאים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה P1000 ופיפט את התאים מספר פעמים כדי לנתק את המושבות לתאים בודדים.
- לאסוף את התאים ולהעביר אותם לתוך צינור 15 מ"ל המכיל חיץ כביסה (1 מ"ל לכל באר של צלחת 6 באר ). סובבו את התאים ב-200 x גרם למשך 4 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והחזירו את הכדור בתווך PXGL טרי (מספיק ל-1.5 מ"ל לבאר). שקול יחס פיצול של 1:3-1:6 עבור מעבר שגרתי.
הערה: לאחר כל 3-4 מעברים או אם איכות תרבית התאים יורדת בהתבסס על המורפולוגיה של התא (למשל, הופעתן של מושבות שטוחות באוכלוסייה), הוסף 10 μM Y-27632 ותמצית ממברנת מרתף גורם גדילה (5 μL / well) למדיום במהלך 24 השעות הראשונות לאחר המעבר. - לפני סידור מחדש של ה-hPSCs, הכינו את הצלחות עם MEFs טריים על ידי שאיפת מדיום ה-MEF ושטיפת התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P1000 כדי להעביר 1.5 מ"ל של תרחיף תא hPSCs לכל באר של לוחית 6 בארות המכילה את ה- MEFs.
הערה: ודא שצנרת מובילה לזריעה הומוגנית של התאים על פני אזור הבאר. זה יבטיח צמיחה של מושבות עם גדלים הומוגניים וסינכרון יחסי של התאים. - תרבית hPSCs בתנאים היפוקסיים ב 37 °C (86 °F) בסביבה לחה. לאחר 24 שעות, hPSCs צריך להיות מחובר. מספר גבוה של תאים שאינם דבקים (או צפים) משקפים בעיה של כדאיות או של התקשרות בעת המעבר.
- החלף את המדיום עם 1.5 מ"ל של PXGL בינוני לכל באר יומית. לעבור hPSCs כל 3-4 ימים או להשתמש בהם לניסויים היווצרות בלסטואידים.
הערה: לאחר הפשרת hPSCs, העבר אותם במשך שלושה מעברים לפחות לפני תחילת ניסוי בלסטואיד.
2. היווצרות בלסטואידים
- היווצרות אגרגטים נאיביים של PSC
- הכן וחמם מראש את מדיית PXGL, מדיה בסיסית N2B27, מאגר כביסה, PBS ומדיית צבירה לפני תחילת הניסוי. אל תכלול MEFs בהשעיית hPSCs ליצירת blastoids על ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן.
- להחרגת MEF, הכינו צלחת מצופה ג'לטין על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין לבאר של צלחת בעלת 6 בארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-90 דקות.
- כדי לקצור את התאים, לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS.
- הוסיפו 500 μL של תמיסת ניתוק תאים (לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לעקוב אחר הדיסוציאציה של מושבות לתאים בודדים (כמה גושים רב-תאיים יכולים להיות מנותקים מאוחר יותר על ידי צנרת עדינה).
- דיללו את תמיסת ניתוק התאים ב-1 מ"ל של חיץ כביסה. אסוף את התאים מהצלחת על ידי צנרת עדינה 5 עד 10 פעמים. מעבירים את מתלי התא לצינור של 15 מ"ל. סובבו את התאים ב-200 x גרם למשך 4 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט, הוציאו את התאים ל-1.5 מ"ל של מדיום PXGL (לכל באר של צלחת של 6 בארות) וזרעו את התאים על הצלחות מצופות הג'לטין להרחקת MEF ודגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60-90 דקות.
- לאחר שהתאים הנאיביים נזרעים להחרגת MEF, הסר את ה- PBS מהמיקרו-וולים ושווי המשקל את הבארות עם 200 μL של תווך N2B27 בסיסי (לכל שבב מיקרו-וול אחד) ודגירה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- אספו את הסופרנאטל המכיל את התאים הנאיביים שאינם מחוברים, העבירו אותו לצינור של 15 מ"ל וסובבו את התאים ב-200 x גרם למשך 4 דקות.
- לשאוף את המדיה ולהחיות את התאים ב 1 מ"ל של N2B27 מדיה בסיסית. ספרו את התאים באמצעות שקופיות של ספירת תאים. סובבו את התאים ב-200 x גרם למשך 4 דקות.
- שאפו למדיום והוסיפו כמות מתאימה של 10 μM Y-27632 הכלולה במדיה N2B27 כדי לקבל צפיפות תאים של 30,000 תאים לכל 50 μL.
הערה: מספר תא הזריעה ההתחלתי האופטימלי יכול להשתנות בין קווי התאים השונים. לדוגמה, כדי לזרוע 50-60 תאים/מיקרווול, 30,000 תאים (כולל עודפים בהתחשב בכך שחלק מהתאים נופלים מחוץ למיקרווול) נזרעים בבאר אחת של 96 צלחות באר המכילות 430 מיקרו-וולים. מספר תא התחלתי לא הולם יכול לגרום להיווצרות אגרגטים קטנים ללא חלל או היווצרות של מבנה מקועש המגיע ליותר מ-250 מיקרומטר. - שאפו לתווך ממערכי מיקרוול שיווי משקל והוסיפו 25 μL של מדיה N2B27 עם 10 μM Y-27632. הוסיפו 50 μL של תרחיף התא ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (עד שהתאים נופלים לתחתית המיקרווול). לאחר מכן, הוסף 125 μL של N2B27 בינוני בתוספת 10 μM Y-27632.
- פיתוח בלסטואיד
- תוך 24 שעות, ניתן לצפות באגרגטים של hPSCs נאיביים (יום 0) בשבב המיקרווול. כדי ליזום היווצרות בלסטואיד, הכן את מדיום PALLY ובצע את השלבים המתוארים להלן.
- טרום חם PALLY בינוני ב 37 °C (84 °F) למשך 30 דקות.
הערה: יש להוסיף 1-חומצה ליזופוספטידית (LPA) ו-10 μM Y-27632 ממש לפני השימוש. הריכוז האופטימלי של LPA משתנה בין 0.5-5 μM. זה צריך להיות titrated עבור קווי hPSC בודדים המשמשים עבור blastoids. - לשאוף למדיום הצבירה. הוסף 200 μL של מדיום PALLY מחומם מראש למיקרווולים. הניחו את צלחת תרבית התאים בחזרה לחממה היפוקסית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. חזור על שינוי המדיה ביום הראשון.
- ביום השני, הסר את מדיום PALLY והוסף 200 μL של N2B27 בינוני בתוספת LPA ו- 10 μM Y-27632.
הערה: ביום השני רוב האגרגטים ממשיכים לגדול. עם זאת, אגרגטים מסוימים יוצרים חללים קטנים. ברציפות תרבית בלסטואידים ב- PALLY עד היום ה -4 או במדיום תרבית במבחנה (IVC1) מהיום 2 ואילך. עם זאת, בעקבות שינוי מדיה זה משפר את היווצרותו של PrE בבלסטואידים בוגרים. - חזור על שינוי מדיה ביום 3. היווצרות בלסטואידים מלאה מתרחשת ביום 4.
הערה: בלסטואידים נחשבים כמי שהתפתחו במלואם כאשר הם עברו מורפוגנזה מלאה המבוססת על מורפומטריקה של בלסטוציסטים אנושיים מהיום ה-7 (למשל, טווח קוטר של 150 -250 מיקרומטר; צביר פנימי אחד מוקף באפיתל של תאים דמויי טרופקטודרם) ויצרו תאים דמויי טרופיקטודרם קוטביים (NR2F2+/CDX2-) ותאים דמויי PrE (GATA4+). ניתן להעריך זאת באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS).
3. היווצרות של בלסטואידים במיקרו-לוחות חיבור נמוכים במיוחד של 96 בארות
- הכן מתלי תאי hPSCs תמימים להיווצרות בלסטואידים על ידי ביצוע השלבים שתוארו לעיל מ- 2.1.1 - 2.1.11.
- שאפו למדיום והוסיפו כמות מתאימה של מדיה N2B27 המכילה 10 μM Y-27632 כדי לקבל את צפיפות התאים של 70 תאים לכל 100 μL של המדיום.
הערה: מספר תא הזריעה הראשוני האופטימלי יכול להשתנות בין קווי תאים שונים. לדוגמה, 70 תאים/באר יכולים להיות מספר התא האופטימלי עבור רוב קווי התאים. - צנטריפוגה של הצלחת בגודל 200 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר לתאי אשכול בתחתית הבארות.
- דגירה של הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאי תרבית היפוקסיים. בתוך 24 שעות ניתן לצפות במצטברים של hPSCs נאיביים (יום 0) על הבארות.
- הכן 2x PALLY בינוני. הוסיפו 100 μL של מדיום PALLY 2x מוכן מראש לבארות.
- מניחים את צלחת תרבית התאים בחזרה באינקובטור היפוקסי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, שאפו למחצית מהמדיה (100 μL) והחליפו אותה ב-100 μL של מדיום PALLY מוכן מראש. חזור על השלב עד היום הרביעי. הקפידו לא לשאוף את הצברים.
הערה: ביום השני, רוב האגרגטים ממשיכים לגדול. עם זאת, לחלק מהאגרגטים יש חללים קטנים מלאים בנוזל. ביום ה-4, רוב המבנים המחוררים עוברים מורפוגנזה מלאה ויוצרים מבנים דמויי בלסטוציסט.
4. היווצרות טרופוספירה
- עבור היווצרות טרופוספירה, עקוב אחר פרוטוקול היווצרות הבלסטואידים משלב 2.1.1 (הרחקת MEF) עד שלב 2.1.12 (השלב האחרון של פרוטוקול הזריעה).
- לאחר שנוצרים אגרגטים של hPSCs נאיביים לאחר 24 שעות, החליפו את מדיום הצבירה ב-PALY (ללא LIF) בתוספת 3 μM SC-144 להיווצרות של טרופוספירה המייצגת טרופיקטודרם מוקדם ו-PALLY בתוספת 2 μM XMU-MP-1 להיווצרות של טרופיפוספירה המייצגת טרופיקטודרם בוגר.
- רעננו את המדיום מדי יום. היווצרות טרומוספירה מלאה מתרחשת ביום 4.
5. ניתוח מצב תאי הבלסטואיד והשלב המשתקף שלו באמצעות scRNAseq
- כדי לקלוט בלסטואידים ולבצע דיסוציאציה, חממו את האינקובטור הרועד ל-37 מעלות צלזיוס והגדירו אותה ל-100 סל"ד.
- אספו בלסטואידים מהצלחת הראשונית בת 96 הבארות והעבירו אותם לבארות מרובות של צלחת U-bottom בעלת 96 בארות באמצעות פיפטת פה המצוידת בנימי זכוכית.
הערה: יש לבחור בלסטואידים (> 70%) על סמך הקריטריונים המורפומטריים (גודל = 150-250 מיקרומטר עם אשכול פנימי ייחודי) על מנת למנוע זיהום עם מבנים שאינם בלסטואידים (< 30%). - שטפו פעם אחת עם 200 μL של PBS באמצעות P200 על ידי צפייה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. מעבירים לבאר המכילה 50 μL של קולגן ודגירה למשך 30 דקות באינקובטור הרועד.
- מעבירים את הבלסטואידים לבאר עם 100 μL של 10x טריפסין-EDTA ומערבבים היטב. דגירה במשך 20 דקות באינקובטור הרועד.
- נתקו את הבלסטואידים לתא יחיד באמצעות פיפטה P200. העבירו את התאים לצינור של 15 מ"ל עם מאגר FACS (1% FBS ב-PBS).
- כדי ללכוד יחסים ספציפיים של האנלוגיות של שלוש השושלות, הכתימו את האנלוגיות של TE ו-PrE בנוגדנים TROP2 ו-PDFGFRa בהתאמה.
הערה: מספר תאי ה-PrE בבלסטוציסטים אנושיים קטן יותר בהשוואה לבלסטוציסטים של עכברים, מה שעשוי לשקף פגמים התפתחותיים של בלסטוציסטים שנוצרו באמצעות הפריה חוץ גופית (IVF) או הבדל בין מינים. בבלסטואידים, האנלוגיות PrE פחות נפוצות מהאנלוגיות של TE ו-EPI ומייצגות 7.4% מהתאים בספירת תאי GATA4+ על ידי הדמיית אימונופלואורסצנציה. כמו כן, תהליך הדיסוציאציה עשוי לגרום להטיות בפרופורציות של סוגי התאים השונים כאנלוגיות PrE כדי לייצג 1%-2% מהתאים לאחר דיסוציאציה של בלסטואידים, תיוג PDGFRa וניתוח FACS. - תאים במיון FACS מכל שלושת האנלוגיות של שושלת לתוך 384 לוחות המכילים מאגר ליזה לניתוח חכם-seq2. אל תכלול תאים מתים המסומנים על ידי צביעת DAPI (המבוצעת על פי הוראות היצרן).
- כדי להעריך את מצבי התא (סוג התא והשלב ההתפתחותי), השווה את נתוני השעתוק מבלסטואיד עם הפקדים המתאימים.
6. תרבות מורחבת להערכת התקדמות התפתחותית של בלסטואידים
- תרבית בלסטואידים אנושיים על לוחות מצופים מטריצה של קרום מרתף (תחתית זכוכית).
- מצפים את הצלחת במטריצת קרום מרתף.
- בדיקה חזותית של הבלסטואידים כדי להעריך ולתעד מורפולוגיה.
הערה: רק לבלסטואידים המציגים את המורפולוגיה הקלאסית של בלסטוציסט חלול עם כדור חלול עם ICM קומפקטי יש פוטנציאל לגדול ולהתפתח עוד יותר. - הוסיפו 100 μL של CMRL בינוני-1 לכל באר אחת של לוחית 96 הבאר, והניחו את הצלחת באינקובטור לפחות 2 שעות לפני שהבלסטואידים יעברו לשיווי משקל.
- באמצעות סטריאומיקרוסקופ, לזהות חזותית את הבלסטואידים עם מורפולוגיה טובה, להעביר את הבלסטואידים שנבחרו בבאר של צלחת 96 באר המכילה 100 μl של CMRL medium-1 כדי להסיר את עקבות המדיה הבלסטואידית.
- העבר את הבלסטואידים לבאר המכילה CMRL media-1 שיווי משקל מראש. מניחים את הצלחת באינקובטור ואינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: ניתן לתרגם עד 5 בלסטואידים בבאר אחת של 96 צלחות באר. קיום יותר מדי בלסטואידים בבאר אחת עלול להוביל להיווצרות אגרגטים של בלסטואידים מרובים. - למחרת, בדקו באופן חזותי את הבלסטואידים תחת מיקרוסקופ. אם מחוברים הבלסטואידים, הוסיפו 100 μL של CMRL media-1 שיווי משקל מראש בתוספת מטריצת קרום מרתף של 5%. מניחים את הצלחת באינקובטור ואינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, עקוב אחר הבלסטואידים תחת מיקרוסקופ. הסר מחצית מהמדיה (100 μL) והחלף אותה ב- 100 μL של CMRL media-2 שיווי משקל מראש בתוספת מטריצת קרום מרתף של 5%.
- בימים שלאחר מכן, החלף מחצית מהמדיה (100 μL) ב- CMRL media-3 שיווי משקל מראש בתוספת מטריצת קרום מרתף של 5%. מניחים את הצלחת באינקובטור ואינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזרו על הפעולה כל יום במשך עד 4-6 ימים של תרבות חוץ גופית .
הערה: יש לנו בלסטואידים מתורבתים במשך עד 6 ימים בתנאי תרבית ממושכים התואמים את הזמן המקביל ליום 13 של עוברים אנושיים מתורבתים במבחנה .
7. בלסטואידים של חיסון
- לשאוף למדיום. לשטוף דגימות 3x עם PBS במשך 5 דקות.
- הוסף 200 μL של פרפורמלדהיד קר של 4% (PFA) ב- PBS ותקן דגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר תמיסת PFA ושטיפ דגימות 3x עם PBS למשך 10 דקות.
הערה: אם בלסטואידים עברו תרבית על שבבי מיקרווול, העבירו את הבלסטואידים מהשבב לתוך לוחות U-bottom של 96 בארות בשלבים הבאים. - מחלחלים וחוסמים את הבלסטואידים ב-100 μL של תמיסת חסימה לבאר (PBS מכיל 0.3% Triton-X 100 ו-10% סרום חמורים רגיל) למשך 60 דקות.
הערה: בהתאם למינים המארחים של הנוגדנים, התאימו את הסרום בהתאם. - הסר את פתרון החסימה. הוסיפו 100 μL נוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת חסימה טרייה ודגמו דגימות במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לקבוע את ריכוזי הנוגדנים הראשוניים על סמך הוראות היצרן. - שטיפה מדגימה 3x עם 0.1% Triton-X 100 ב- PBS (תמיסת כביסה) למשך 10 דקות. הוסף 100 μL של נוגדנים משניים בתמיסת חסימה יחד עם 20 מיקרוגרם /מ"ל הכתם הגרעיני Hoechst ודגירה דגימות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הגן על דגימות מפני אור.
הערה: יש לקבוע את ריכוזי הנוגדנים המשניים על סמך הוראות היצרן. - שטיפה דוגמאות 3x עם תמיסת כביסה למשך 10 דקות. לצורך הדמיה, העבר את הדגימות לתחתית הזכוכית μ-החלקה ב- PBS.
הערה: יש לבחור את מדיום ההרכבה על סמך המטרה המשמשת להדמיה. לדוגמה, ניתן להשתמש ב-80% גליצרול ב-PBS להרכבת הדגימות תוך שימוש ביעדי שמן.
Representative Results
בדרך כלל, hPSCs נאיביים המתורבתים בתרבית ב-PXGL (איור 2A) הם מבנים מצטברים ומחוצבים, המתעוררים בין 48 ל-72 שעות לאחר אינדוקציה PALLY ומגיעים לקוטר של 150-250 מיקרומטר תוך 96 שעות (איור 2B). באמצעות מספרי תאי זריעה אופטימליים (1), (2) משך צבירה טרום-תרבית עם N2B27 (0 עד 24 שעות), (3) ריכוז של רכיבים כימיים בודדים (במיוחד LPA), ו-(4) משך הטיפול ב-PALLY, יעילות האינדוקציה מגיעה ל-70%-80% כהגדרתם בהתבסס על פרמטרים מורפומטריים (גודל כולל של 150-250 מיקרומטר, חלל רגיל יחיד, צביר תאים פנימיים יחידים; איור 2C,D) ונוכחותן של שלוש השושלות. מצב תא התחלתי לא אופטימלי ו/או תנאי אינדוקציה יגרמו להיווצרות פחות יעילה או ללא בלסטואידים. כדי להבטיח יעילות מרבית וליצור רק אנלוגים לפני ההשתלה, חיוני להשתמש בתרבות איכותית של PXGL hPSCs נאיביים. ניתן להעריך זאת על ידי מדידה על ידי FACS את אחוז התאים החיוביים עבור סמני פני השטח SUSD2 (מצב נאיבי) ו- CD24 (מצב ראשוני). סמני פני שטח נוספים הספציפיים לשושלות החוץ-אמבריוניות מחוץ למטרה (למשל, אמניון, מזודרם חוץ-אמבריוני) יהיו שימושיים גם כן, אך למיטב ידיעתנו, אינם זמינים כיום. אם יעילות ההיווצרות המתקבלת נמוכה מהתוצאות שדווחו, חשוב לבדוק היטב את כל הרכיבים של מדיום הבלסטואיד, במיוחד LPA המשוחזר ב- PBS ואשר, כליגנד GPCR, יכול להיות לא יציב יותר בהשוואה למולקולות סינתטיות שנוצרו מחדש ב- DMSO. ברוב המקרים, גם אם התשואה אינה מקסימלית, המבנים המקושעים עדיין מורכבים משלוש השושלות הבלסטוציסטיות. ניתן לאשר את הופעתן של שלוש שושלות בלסטוציסטיות והיווצרות ציר עוברי-אבמבריוני על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה של סמנים (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; איור 2E,G). טרופוספירה, המורכבת רק מ- TE, מסייעת לנתח עוד יותר את תפקידה של התקשורת הבין-תאית. טרופוספירה יכולה להיווצר ביעילות של 50%-60% תוך 96 שעות מאינדוקציה (איור 2H,I). ניתן לבצע היווצרות בלסטואידים לא רק במערכים ביתיים של מיקרו-וול, אלא גם בלוחות חיבור נמוכים במיוחד 96 עם אופטימיזציה של תנאי אינדוקציה (ראו פרוטוקול ואיור 2J). לבלסטואידים יש גם את היכולת להמשיך ולהתפתח במשך 6 ימים נוספים, שהם זמן שווה ערך לעובר יום 13, עם פרוטוקול התמיינות חוץ גופית (איור 2K).
על מנת לאפיין עוד יותר את מצב התא של תאי הבלסטואיד, יש להשתמש בטכנולוגיית ריצוף RNA חד-תאית. UMAP מיושם בדרך כלל כדי להמחיש התפלגות של מצבי תאים, וניתוח אשכולות לא מפוקח מבוצע עליו כדי להעריך את הקרבה של מצבי תאים בודדים. פרמטרים שונים בניתוח הנתונים החד-תאיים יכולים להשפיע על אופן הצגת התאים ב-UMAPs, ובכך להוביל לאשכולות עם מיקומים וצורות מרחביים ויחסיים שונים (איור 3A). עם זאת, בניתוח זה, התאים מציגים פרופילי אשכולות מובחנים במידה ניכרת ללא קשר לפרמטרים המשמשים לביצוע האשכולות וההדמיה של הנתונים, מה שמאפשר להבחין בביטחון גבוה בין שלוש השושלות הבלסטוציסטיות. השתמשנו בתאים מעוברים שנקטפו בשלבי התפתחות שונים כהתייחסות. המיזוג של מערכי נתונים אלה מראה כי רוב הטרופיקטודרם האנלוגי מבלסטואיד מקובץ עם trophectoderm לפני ההשתלה אך לא עם trophoblasts לאחר ההשתלה (איור 3B). תוצאות אלה אושרו גם על ידי קונסורציום עצמאי10.
כאשר עוברי קרנגי שלב 7 (CS7) של גזים מוצגים במפת הייחוס, אוכלוסייה קטנה של תאים בלסטואידים (3%) התקבצה עם שושלות המזודרם והאמניון של העוברים האלה (איור 3C). כאשר תאים דמויי אמניון מוצגים במפת הייחוס, אוכלוסייה קטנה של תאים בלסטואידים (< 2%) התקבצה עם תאים דמויי אמנון כאלה.
באופן כללי, רק המבנים הכוללים חלל רגיל יחיד, צביר תאים פנימיים יחיד, גודל כולל הנע בין 150-250 מיקרומטר, הכולל אנלוגים תעתיקיים של שלוש השושלות הבלסטוציסטיות, ובמידה רבה נטולי שושלות אחרות (למשל, אמניון, מזודרם, מזודרם חוץ-ממבריוני) נחשבים לבלסטואידים אנושיים.
איור 1: ארבע תכונות ושתי גישות ליצירת בלסטואידים בעלי נאמנות גבוהה.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בלסטואידים וטרופוספרות שמקורם באגרגטים של hPSC נאיבי. (A) תמונות של ניגודיות פאזה המציגות hPSCs נאיביים המתורבתים במדיום PXGL מתורבתים בשיתוף עם MEF מוקרן. סרגל קנה מידה: 50 μm. (B) תמונות ניגודיות פאזה המראות את השינוי המורפולוגי של אגרגטים תמימים של hPSCs מתורבתים על מערך מיקרווול הידרוג'ל שאינו דבק עם 500 ננומטר LPA (מדיום PALLY). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) בלסטואידים אנושיים שנוצרו על מערך מיקרווול לאחר 96 שעות. סרגלי קנה מידה: 400 μm. (D) כימות של אחוז המיקרו-וולים המכילים בלסטואיד אנושי המושרה על ידי מצב תרבית PALLY עם ריכוז LPA אופטימלי מקווי hPSC נאיביים שונים (n = 3 מערכי מיקרו-וול). (E) צביעה אימונופלואורסצנטית של בלסטואידים אנושיים עם סמני אפיבלסט (EPI) (צהוב) NANOG ו-OCT4; סמני TE (ציאן) CDX2 ו- GATA3; וסמן האנדודרם הפרימיטיבי (magenta) SOX17 ו- GATA4. סרגל קנה מידה: 100 μm. (H-I) כימות של מספר התא (משמאל) ואחוז התאים (מימין) השייכים לכל שושלת בבלסטואיד (96 שעות) בהתבסס על צביעת אימונופלואורסצנציה של OCT4, GATA3 ו- GATA4. (G) צביעה אימונופלואורסצנטית של בלסטואידים אנושיים עבור CDX2 (ציאן) ו-NR2F2 (מגנטה). (F) תמונות ניגודיות פאזה של טרופוספירה בשלב מוקדם ומאוחר על מערך מיקרווול המושרה על ידי תוספת של 3 μM SC144 (H) או 2 μM XMU-MP-1 (I), בהתאמה. (J) תמונות של ניגודיות פאזה המציגות את השינוי המורפולוגי של אגרגטים תמימים של hPSCs המתורבתים בלוחות חיבור נמוכים במיוחד 96 עם 500 ננומטר LPA (מדיום PALLY). (K) תמונת ניגודיות פאזה (משמאל) וכתם אימונופלואורסצנטי (מימין) עבור OCT4 (צהוב), GATA3 (ציאן) ו-GATA4 (מגנטה) בבלסטואיד שגדל במצב תרבית לאחר השרעה במשך 6 ימים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה מותאםמ-6,10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אפיון הרכב הבלסטואידים על ידי ריצוף של תאים בודדים. (A) ניתוח אשכולות לא מפוקח עם פרמטרים שונים על UMAP של תעתיק של תאים בודדים שמקורם בנקודות הזמן השונות של בלסטואיד (24 שעות, 60 שעות, 96 שעות), hPSCs נאיביים, hPSCs ראשוניים ו- hTSC (מייצגים את הציטוטרופיובלסט שלאחר ההשתלה). (B) UMAP של תעתיק של תאים שמקורם בבלסטואיד (96 שעות), hPSCs נאיביים ו-hPSCs ראשוניים המשולבים עם מערכי נתונים שפורסמו מעוברים אנושיים של שלבי טרום-השתלה, פרי-השתלה (בלסטוציסטים בתרבית חוץ גופית ) וגסטרולציה (שלב קרנגי 7, כלומר, בין E16-19). תאים בודדים נצבעים על סמך מקורם בעוברים אנושיים (משמאל), בתאים שמקורם בבלסטואידים או בתאי גזע (באמצע), ותוצאה של ניתוח אשכולות לא מפוקח (מימין). (C) UMAPs של תעתיק של תאים שמקורם בבלסטואידים, hPSCs נאיביים, hPSCs ראשוניים, ומשולבים עם מערך נתונים שפורסם ממעבר שלב גסטרולציה (קרנגי שלב 7, כלומר, בין E16-19). תאים בודדים נצבעים על סמך מקורם בעוברים אנושיים (משמאל), בתאים שמקורם בבלסטואידים או בתאי גזע (באמצע), ותוצאה של ניתוח אשכולות לא מפוקח (מימין). נתון זה מותאם מתוך6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה משלימה 1: כל הרכב המדיה המשמש במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
במחקר הנוכחי, אנו מראים, צעד אחר צעד, כיצד לבסס בלסטואידים אנושיים עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוט וחזק. עם צבירה של PXGL hPSCs נאיביים והעיכוב המשולש שלהם, בלסטואידים נוצרים ביעילות (> 70%) ויוצרים ברצף את 3 האנלוגיות הבלסטוציסטיות תוך 4 ימים. מגבלות ביעילות ובאיכות של הבלסטואידים (למשל, נוכחות של תאים מחוץ למטרה) יכולות להתרחש אם המצב ההתחלתי אינו אופטימלי. יש לציין כי מדדנו כי PXGL hPSCs מכילים כ-5% מהתאים המשקפים את שלבי ההשתלה שלאחר ההשתלה. תאים אלה עשויים להגביל את היווצרותם של בלסטואידים באיכות גבוהה. מעבר למצב PXGL הנאיבי הראשוני המשקף את אפיבלסט הבלסטוציסט, גורם מרכזי נוסף הוא המדיום המשמש להיווצרות בלסטואידים. על מנת ליצור במהירות תאים דמויי בלסטוציסט ולמנוע היווצרות של תאים מחוץ למטרה, דמויי השתלה לאחר ההשתלה, אנו מציעים כי עיכוב מסלולים משולשים (היפו, ERK, TGF-β) הוא חיוני. בעוד שקווי תאים שונים נותנים תפוקות שונות של בלסטואיד על עיכוב ERK/TGF-β (בדרך כלל בסביבות 10%-20%), חשיפה ל-LPA גורמת להיווצרות תפוקת בלסטואידים גבוהה באותה מידה בכל קווי התאים, תוך שימוש בקריטריונים מחמירים למפרט מורפומטרי ושושלת. LPA פועל ככל הנראה על עיכוב מסלול ההיפו, הממלא תפקיד קריטי בהפרדת השושלת הראשונה בין שושלות אפיבלסט וטרופקטודרם בעכבר ובאדם 8,51. השיפור המשמעותי ביעילות הבלסטואידים על ידי LPA מצביע על כך שמנגנוני אפיון התאים הפנימיים-חיצוניים בתיווך מסלול ההיפו הפועלים בבלסטוציסט נבחרים יחד במהלך היווצרות בלסטואידים. מגבלה נוכחית טמונה בעובדה שבשל תת-אופטימליות של הפרוטוקולים המשמשים לתרבית בלסטוציסט אנושי או בלסטואידים ביום המקביל בזמן 7-13 (לאחר היווצרות בלסטוציסט/בלסטואיד), איננו מסוגלים להעריך באיזו מידה אנו יכולים לדגום כראוי התפתחות לאחר ההשתלה.
ניתוח מצב השעתוק של תאי הבלסטואידים יכול להיות מושג בקלות באמצעות scRNAseq, מפות ייחוס נאותות ושיטות ביואינפורמטיות. בעבר, ניתוח התעתיק הראה כי hPSCs שעברו תרבית ב- PXGL דומים יותר לאפיבלסט הבלסטוציסט בהשוואה למצב הראשוני. מגבלות בניתוח הנתונים יכולות להתרחש אם מפת הייחוס כוללת רק תאים בשלב הבלסטוציסט. מפת הייחוס צריכה לכלול תאים שמקורם בעוברים לאחר ההשתלה על מנת להעריך את נוכחותם של תאים פוטנציאליים מחוץ למטרה. בעתיד, על מנת למדוד את תאי הבלסטואיד, מפת ייחוס הכוללת את כל הרקמות של התפיסה האנושית לפני ואחרי ההשתלה תהיה בעלת ערך רב. בנוסף, מפות ייחוס של תאים בודדים מרובי-אומיקה, למשל כולל תעתיק, נגישות כרומטין ומתילציה של דנ"א, יעזרו עוד יותר. לבסוף, שיטות ביואינפורמטיות סטנדרטיות להערכה כמותית של קווי הדמיון בין תאים ממודלים של עוברים ומתפיסות ייחוס, ולזיהוי חיובי של תאים מחוץ למטרה יסייעו עוד יותר לנתח ולהשוות תוצאות ללא משוא פנים.
בסך הכל, בלסטואידים הנוצרים על ידי עיכוב משולש של מסלולי היפופו, TGF-β ו- ERK הם בעלי ארבע התכונות של 1) מורפוגנזה יעילה ביותר, 2) רצף נכון של מפרט שושלת, 3) טוהר גבוה של תאים דמויי בלסטוציסט ברמת השעתוק, 4) יכולת לדגום פיתוח פרי-השתלה. תכונות אלה של בלסטואידים יאפשרו היפותזות בנייה על התפתחות והשתלה של בלסטוציסט, אולם הן אינן משחזרות שלבים מוקדמים יותר של התפתחות עוברית. בניגוד לנגישות המוגבלת והרבגוניות של הבלסטוציסט האנושי, בלסטואידים מקובלים על בדיקות גנטיות ותרופות לצורך חקירות תפקודיות של התפתחות והשתלת בלסטוציסטים. בעתיד, ידע בסיסי כזה עשוי לתרום לשיפור נוסחת המדיה ההפריה החוץ גופית, לפיתוח אמצעי מניעה לאחר הפריה ולניהול טוב יותר של ההריון המוקדם.
Disclosures
המכון לביוטכנולוגיה מולקולרית, האקדמיה האוסטרית למדעים הגיש בקשת פטנט EP21151455.9 המתארת את הפרוטוקולים להיווצרות בלסטואידים אנושיים ואת בדיקת האינטראקציה בין בלסטואיד לאנדומטריום. HK, AJ, HHK ו- NR הם הממציאים של פטנט זה. כל שאר הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק ERC-Co מס '101002317 'BLASTOID: פלטפורמת גילוי לאמבריוגנזה אנושית מוקדמת'). H.H.K. נתמך על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF), תוכנית Lise Meitner M3131-B. אנו מודים ליאסוהירו טקשימה על שיתוף קווי התאים H9 ו-H9-GFP, ולאוסטין סמית', פיטר אנדרוז וגה גואו על שיתוף קווי התאים HNES1, Shef6, niPSC 16.2b ו-cR-NCRM2. אנו מודים ל-Hossein Baharvand על שיתוף האורגנואידים של רירית הרחם. אנו מודים לג'ושוע מ. בריקמן על שיתוף הרנ"א שבודד מתאי התמיינות PrE ותאי nEND. אנו מודים לשנקר סריניווס על שיתוף נתוני ריצוף ה-RNA החד-תאיים של עובר הפרי-גסטרולציה. אנו מודים לאלכסנד ביקוב וללואיזה קוצ'לה על הסיוע הטכני בהכנת ספריית SMARTSeq2. אנו מודים למתקן ה-NGS, הביואופטיקה ותאי הגזע ב-IMBA על הסיוע הקריטי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
References
- Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
- Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
- Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
- Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
- Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
- Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
- Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
- Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
- Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
- Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
- Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Guo, G., et al.
- Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
- Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
- Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
- Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
- Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
- Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
- Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
- De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
- Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
- Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
- Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
- Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
- Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
- Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
- Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
- Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
- Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
- Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
- Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
- Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
- Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).
