Summary
تعد إصابة الكبد التي يسببها الدواء (DILI) سببا رئيسيا لفشل الدواء. تم تطوير بروتوكول للتنبؤ بدقة بمسؤولية DILI لمركب باستخدام نظام ميكروفيزيولوجي للكبد (MPS). يستخدم نموذج الكبد الزراعة المشتركة للخلايا الكبدية الأولية ونقاط النهاية ذات الصلة بالترجمة لتقييم الاستجابات الخلوية للعلاج.
Abstract
DILI هو سبب رئيسي للاستنزاف في تطوير الأدوية مع أكثر من 1000 دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية معروف أنه يحتمل أن يسبب DILI في البشر. لسوء الحظ ، لا يتم اكتشاف DILI في كثير من الأحيان حتى تصل الأدوية إلى المراحل السريرية ، مما يعرض سلامة المرضى للخطر ويؤدي إلى خسائر كبيرة لصناعة الأدوية. مع الأخذ في الاعتبار أن نماذج 2D القياسية لها قيود في اكتشاف DILI ، من الضروري تطوير نماذج في المختبر أكثر تنبؤا لتحسين قابلية ترجمة البيانات. لفهم السببية والجوانب الميكانيكية ل DILI بالتفصيل ، تم تطوير MPS للكبد البشري يتكون من خلايا متنية الكبد الأولية البشرية وغير المتنية (NPCs) والمستزرعة في أنسجة دقيقة 3D على سقالة هندسية تحت التروية. تم استزراع خلايا الكبد البشرية الأولية المحفوظة بالتبريد (PHHs) وخلايا كوبفر (HKCs) كأنسجة دقيقة في منصة MPS لمدة تصل إلى أسبوعين ، وتم تناول كل مركب مهم بشكل متكرر على الأنسجة الدقيقة للكبد بسبعة تركيزات اختبار لمدة تصل إلى أربعة أيام. تم تحليل نقاط النهاية الوظيفية الخاصة بالكبد (بما في ذلك المؤشرات الحيوية السريرية مثل ألانين أمينوترانسفيراز ، ALT) لتقييم وظائف الكبد. يمكن تقييم التعرض الحاد والمزمن لمركبات من شدة DILI المختلفة من خلال مقارنة الاستجابات للأنسجة الدقيقة أحادية ومتعددة الجرعات. تم التحقق من صحة المنهجية مع مجموعة واسعة من المركبات الشديدة والسامة للكبد بشكل معتدل. نعرض هنا بيانات بيوجليتازون وتروجليتازون ، وهي مركبات سامة للكبد معروفة تم سحبها من السوق للتسبب في فشل الكبد. بشكل عام ، ثبت أن نموذج MPS للكبد يمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم DILI وارتباطه بالتغيرات في وظيفة الكبد. يمكن أيضا استخدام النموذج لتقييم كيفية تصرف المركبات الجديدة في مجموعات فرعية متميزة من المرضى وكيف يمكن أن تتأثر ملامح السمية بحالات أمراض الكبد (على سبيل المثال ، التهاب الكبد الفيروسي ومرض الكبد الدهني).
Introduction
لا يزال DILI هو السبب الأكثر شيوعا لفشل الكبد الحاد في الولايات المتحدة الأمريكية وأوروبا وهو سبب رئيسي لاستنزاف المركبات في عملية تطوير الدواء1. يمكن أن تسبب جميع فئات الأدوية تقريبا سمية كبدية ، حيث تكون عوامل الجهاز العصبي المركزي والمضادات الحيوية هي العلاجات الأكثر شيوعا التي تسبب DILI في المرضى2. تحدث السمية الكبدية التي يسببها الدواء بسبب تفاعل معقد من العوامل الوراثية وغير الجينية والبيئية ، مما يؤدي إلى موت خلايا الكبد وأنواع خلايا الكبد الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الصفراوية والخلايا البطانية 1,3.
يمكن تصنيف العوامل المسببة ل DILI بطريقتين: تلك التي تسبب تلفا في الكبد يمكن التنبؤ به يعتمد على الجرعة أو تلك التي تسبب DILI الخاص النادر ويتطور بشكل مستقل عن جرعة الدواء أو الطريق أو مدة الإعطاء ، ولكنه مسؤول عن ما يصل إلى سدس جميع حالات فشل الكبد الحادة في الولايات المتحدة الأمريكية فقط4. لسوء الحظ ، لا يتم اكتشاف DILI في كثير من الأحيان حتى تصل الأدوية إلى المراحل السريرية لعملية تطوير الدواء. تتكون رتبة إصابة الكبد التي يسببها الدواء (أو DILIrank) من أكثر من ألف دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) مقسمة إلى أربع فئات وفقا لقدرتها على التسبب في DILI ، ويجب مراقبة استخدامها في المرضى عن كثب5.
لا تزال دراسة آليات السمية الكبدية للأدوية صعبة للغاية ، وبالتالي ، تم تطوير العديد من النماذج قبل السريرية لاستكشاف آليات DILI. النماذج الحالية في المختبر وفي الجسم الحي المستخدمة للتنبؤ ب DILI في التطوير قبل السريري لها العديد من القيود على تقديم نظرة ثاقبة للتفاعلات المعقدة والمتعددة الأوجه في جسم الإنسان الحي. لا تزال خطوط الخلايا الكبدية السرطانية (أي HepG2 ، HepaRG) المزروعة في 2D تستخدم في المراحل المبكرة من تطوير الدواء لتقييم سمية المركبات المرشحة6. ومع ذلك ، تأتي خطوط الخلايا هذه من متبرعين فرديين وتظهر مستويات غير طبيعية من وظائف الكبد ، ولا تظهر دائما حساسية عالية للكشف عن DILI 7,8. كبديل لخطوط الخلايا الكبدية السرطانية ، تمثل PHHs بشكل أفضل فسيولوجيا الكبد البشري إذا تمت زراعتها بشكل مناسب في المختبر ، على الرغم من وجود العديد من القيود مع ثقافتها ، مثل وقت الحضانة القصير مع الأدوية ، والعمر القصير نسبيا ، وفقدان التعبير الجيني الكبدي ، والتغيرات في وظائف التمثيل الغذائي للدواء9،10،11 . يمكن استزراع PHHs على بروتينات مصفوفة خارج الخلية في لوحات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية ، ولكن كجانب سلبي ، فإن الانخفاض السريع في وظيفتها يعني أن لديهم حساسية منخفضة (<50٪) لتنبؤ DILI12.
من ناحية أخرى ، فإن الاختبار على النماذج الحيوانية بطيء ومكلف ويحتاج إلى ترجمة عبر الأنواع لاستقراء التنبؤ للبشر. تفشل معظم الأدوية المطورة حديثا في الحصول على الموافقة مما يجعل هذه العملية مكلفة ومحفوفة بالمخاطر5. علاوة على ذلك ، لاختبار طرائق جديدة خاصة بالإنسان ، تكون النماذج الحيوانية أقل ملاءمة بسبب تسلسل الجينات أو اختلافات الاستجابة المناعية مقابل البشر13.
وبالتالي ، نما الاهتمام بنماذج الكبد ثلاثية الأبعاد (3D) الأكثر تقدما في المختبر بشكل كبير. يمثل استزراع PHHs كهياكل كروية ناتجة عن تجميع الجاذبية في قطرات معلقة أو على أسطح ارتباط منخفضة للغاية طريقة عالية الإنتاجية لتقييم الالتزامات المركبة14. تم استخدام كرويات PHH لتقييم DILI في خلفية مريضة (على سبيل المثال ، تنكس دهني وركود صفراوي)15. تم تطوير مجموعة متنوعة من النماذج لتشمل الثقافات المشتركة المطلية ذات الأنماط الدقيقة لخلايا الكبد مع الخلايا الليفية اللحمية16 ، وأنسجة الكبد المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد 17 ، والثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد مع أو بدون خلايا كبدية غير متنية15. ومع ذلك ، لا تزال جميع هذه الطرق لها عيوب ، ويمكن أن يوفر لها زراعة PHHs في بيئة دقيقة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية مستويات أعلى من الوظائف لفترات طويلة من الوقت لتمكين التحقيق في التعرض المطول للمواد السامة الكبدية المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين الأهمية الانتقالية لأي ثقافة PHH متقدمة في المختبر ، يجب استخدام نقاط النهاية الوظيفية ذات الصلة سريريا أو المؤشرات الحيوية لمخرجات السمية للسماح بمقارنة البيانات في الجسم الحي أو السيناريوهات السريرية18.
في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم ما إذا كان يمكن استخدام MPS ، المعروف أيضا باسم Organ-on-a-Chip (OOC) ، في نموذج الكبد في المختبر لفهم الجوانب الميكانيكية التفصيلية لسمية الكبد. وقد ثبت سابقا MPS للحفاظ على الأنسجة الدقيقة الكبد 3D وظيفية للغاية، تحت التدفق، لمدة تصل إلى 4 أسابيع19. تم اختبار النظام مؤخرا من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وثبت أنه يتمتع بقابلية عالية للتكاثر عند إجراء سمية الدواء والتمثيل الغذائي والتراكم داخل الخلايا20. علاوة على ذلك ، عند مقارنتها بالثقافات الكروية والساندويتش ، كان للنظام وظيفة أكثر استقرارا وحساسية أعلى في الكشف عن سمية العديد من الأدوية20. حتى الآن ، تم استخدام MPS في مجموعة واسعة من التطبيقات التي تغطي ADME21 ، ونمذجة الأمراض (HBV22 ، NAFLD 23،24،25) ، والتفاعلات الدوائية26 ، مما قد يجعلها مناسبة للغاية لتقييم DILI الحاد والمزمن. تقدم التكنولوجيا المقدمة هنا بديلا لسد الفجوة بين مزارع الخلايا التقليدية والنماذج الحيوانية والتجارب السريرية البشرية ، والتقدم نحو محاكاة الظروف البيولوجية البشرية لدعم تقييم سمية الكبد للمركبات المرشحة في المراحل قبل السريرية من عملية تطوير الدواء.
Protocol
وقد أجريت جميع الأعمال في المختبر باتباع إجراءات صارمة للصحة والسلامة ووفقا لتقييمات المخاطر المختبرية والإجراءات التشغيلية الموحدة الخاصة به. تتم صيانة جميع المعدات المستخدمة وفقا لإرشادات التصنيع. تتم صيانة خزانات السلامة الميكروبيولوجية (MBSCs) سنويا ، ويتم اختبار Ki-Discus (يوديد البوتاسيوم) وفقا للمعايير البريطانية. يتبع البروتوكول مدونة ممارسات وتوجيهات هيئة الأنسجة البشرية في المملكة المتحدة (HTA) ويستخدم خلايا بشرية أولية من مصادر أخلاقية يوفرها البائعون والتي تمتثل تماما للمتطلبات العامة للموافقة المستنيرة (45 CFR §46.116 و §46.117) والممارسة السريرية الجيدة (GLP) ، (ICH E6) ، واللجان التنظيمية والأخلاقية.
1. تحضير وسائط زراعة الخلايا
ملاحظة: تحضير وسط DMEM المتقدم للبذر في اليوم -1 وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بإعداد متوسط الصيانة المتقدم DMEM في اليوم الأول وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- البذر وسط DMEM المتقدم ل PHHs و HKCs الاستزراع المشترك: تكملة زجاجة واحدة من 500 مل من وسط DMEM المتقدم (جدول المواد) مع 18 مل من الكوكتيل A (التركيز النهائي 3.6٪) ومع 25 مل من FBS (التركيز النهائي 5٪).
- صيانة متوسطة DMEM المتقدمة ل PHHs و HKCs الاستزراع المشترك: استكمل زجاجة واحدة سعة 500 مل من وسط DMEM المتقدم (جدول المواد) ب 20 مل من الكوكتيل B (التركيز النهائي 4٪) و 500 نانومتر هيدروكورتيزون.
ملاحظة: سيتم صنع الهيدروكورتيزون طازجا في يوم الاستخدام ، والخطوات الخاصة بكيفية تحضير محلول المخزون والتخفيفات المطلوبة مذكورة أدناه. - تحضير 500 نانومتر هيدروكورتيزون في صيانة متقدمة DMEM المتوسطة
- تحضير محلول مخزون البدء (20 مللي مول): يزن 7.24 مجم من الهيدروكورتيزون (جدول المواد) في قارورة زجاجية سعة 1 مل. سجل الكمية الدقيقة من الهيدروكورتيزون الذي تم وزنه وحدد حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) باستخدام الحساب التالي:
- تحضير محلول مخزون الهيدروكورتيزون 100 ميكرومتر: أضف 5 ميكرولتر من محلول مخزون 20 مللي متر إلى 995 ميكرولتر من DMEM المتقدم.
ملاحظة: يؤدي تخفيف 25 ميكرولتر من محلول DMSO من الخطوة 1 في الماء أو الوسائط إلى تركيز DMSO بنسبة 0.5٪. في الحل النهائي ، سيكون تركيز DMSO 0.0025٪. في هذه الحالة ، ينتج عن الحجم الإضافي البالغ 5 ميكرولتر تغيير ضئيل في الحجم الكلي. - تحضير محلول الهيدروكورتيزون 500 نانومتر العامل في DMEM المتقدم: لتحضير 1 مل من محلول هيدروكورتيزون 500 نانومتر في DMEM المتقدم ، أضف 5 ميكرولتر من محلول المخزون من 100 ميكرومتر هيدروكورتيزون إلى 995 ميكرولتر من وسيط الصيانة المتقدم DMEM.
- تحضير محلول مخزون البدء (20 مللي مول): يزن 7.24 مجم من الهيدروكورتيزون (جدول المواد) في قارورة زجاجية سعة 1 مل. سجل الكمية الدقيقة من الهيدروكورتيزون الذي تم وزنه وحدد حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) باستخدام الحساب التالي:
2. إعداد MPS والتحضير (اليوم -1)
- قم بتوصيل وحدة التحكم بمنزل محطة الإرساء الخاص بها في حاضنة زراعة الخلايا وتأكد من إضافة مجفف طازج (جدول المواد) إلى جرة التجفيف الموجودة في الجزء الخلفي من وحدة التحكم.
ملاحظة: تقوم وحدة التحكم بسحب الرطوبة من الحاضنة بمرور الوقت ويتم الاحتفاظ بها جافة باستخدام مجفف طازج. - قم بتشغيل وحدة التحكم عن طريق الضغط على مفتاح هزاز القارب الموجود خلفها وانتظر لمدة 5 دقائق حتى يستقر النظام ويصل إلى الضغط. ثم تحقق من الشاشة بحثا عن التقرير الهوائي لضمان: (i) وصل خرج خزان الضغط إلى ~ 2000 mBar و (ii) وصل خرج خزان الفراغ إلى ~ 850 mBar.
- قم بإزالة كل لوحة من العبوة وافحص بصريا كل بئر للتحقق من العيوب المحتملة (السقالات المفقودة والشقوق وما إلى ذلك).
- أدخل برنامج تشغيل (مع لوحة) في محطة الإرساء للتحقق من أن محطة الإرساء ووحدة التحكم تتعرفان على برنامج التشغيل. تحقق من انخفاض ناتج خزان الضغط بأقل من 100 مللي بار ، وزاد خرج خزان الفراغ بأقل من 500 مللي بار.
- قم بتجهيز كل بئر بإضافة 500 ميكرولتر من وسط Seeding Advanced DMEM (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى جانب الخزان.
- حدد برنامج Prime على شاشة وحدة التحكم (التدفق لأعلى لمدة 3 دقائق عند 2.5 ميكرولتر / ثانية) حتى يأتي السائل من خلال دعامات المرشح. ملاحظة: "التدفق لأعلى" هو إعداد على وحدة التحكم يسمح للوسائط بالتدفق من الخزان لأعلى عبر السقالات الموجودة في لوحة LC12.
- املأ جميع الآبار ب 1.1 مل إضافية من وسط Seeding Advanced DMEM لتغطية القناة السطحية. ستكون جميع الآبار بعد ذلك في حجم عملها الكامل البالغ 1.6 مل.
- ضع السائقين مع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، والاتصال بمحطة الإرساء وتشغيل برنامج احتضان .
ملاحظة: جميع البرامج المستخدمة في التجربة (Prime ، Incubate ، Seed ، Media Change) محددة مسبقا في نظام MPS. قم بتجهيز الألواح في الحاضنة حتى تصبح جاهزة للبذر.
3. بذر خلايا الكبد في MPS (اليوم 0)
- التحقق المسبق من صحة جميع PHHS و HKCs. يتم التحقق مسبقا من صحة جميع PHHs و HKCs Lots داخليا قبل إجراء تجربة زراعة الخلايا (انظر المواد التكميلية).
- قم بإذابة قوارير خلايا PHHs و HKCs (جدول المواد) عن طريق تثبيت القوارير بثبات في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تبقى قطعة صغيرة فقط من الجليد.
- ماصة PHHs مباشرة في أنبوب من وسائط CHRM المتوسطة المحفوظة مسبقا (37 درجة مئوية) لاستعادة خلايا الكبد المحفوظة بالتبريد (قارورتان كحد أقصى لكل أنبوب).
- ماصة الخلايا برفق ، ثم استخدم 1 مل من CHRM لغسل أي خلايا متبقية من أنبوب التبريد. كن لطيفا جدا مع الخلايا عند الذوبان والانتقال إلى أنبوب مخروطي.
تنبيه لا تقم بتحريك القوارير أثناء الذوبان ، ولا تقم بماصة محتواها لأعلى ولأسفل. - ماصة HKCs الخلايا بلطف من أنبوب التبريد إلى 10 مل من البذر المثلج البارد وسط DMEM المتقدم في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
ملاحظة: يمكن الجمع بين ما يصل إلى 2 قارورة من HKCs. - جهاز طرد مركزي لكلا النوعين من الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) عند 100 × جم لمدة 10 دقائق. إزالة طاف .
- أعد تعليق PHHs في وسط DMEM المتقدم للبذر الدافئ و HKCs في وسط DMEM المتقدم للبذر البارد (للمساعدة في تقليل تكتل الخلايا) ، باستخدام 1 مل لكل قارورة من الخلايا المضافة إلى الأنبوب ووضع الخلايا على الجليد. استخدم إجراء هزاز لطيف لإعادة تعليق الخلايا.
تنبيه: لا تقم بإعادة تعليق PHHs عن طريق عمل الماصة ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا. - اجمع بين معلقات الخلايا من أنابيب متعددة (إن أمكن - أي إذا كانت جميع PHHs من نفس المتبرع) ، ولكن لا تخلط أنواع الخلايا.
- عد الخلايا. سجل الصلاحية (يجب أن تكون أعلى من 85٪ لكلا النوعين من الخلايا ، PHHs و HKCs) والعدد الإجمالي للخلايا. إذا انخفضت صلاحية الخلية إلى أقل من 85٪ ، فقم بإذابة قارورة جديدة من الخلايا ، وأعد تقييم صلاحية الخلية.
- احسب صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية:
- احسب الحجم المطلوب لمعلق الخلية للبذر في كل بئر والحجم الإضافي لوسط Seeding Advanced DMEM اللازم لرفع إجمالي حجم البذر إلى 400 ميكرولتر. أرقام الخلايا لكل بئر: 0.4 × 10 6 PHHs و 0.04 × 10 6 HKCs لكل بئر ، وكثافة الخلية 0.25 × 10 6 PHHs / مل ، على التوالي 0.025 × 106 HKCs / مل.
- افصل السائق عن محطة الإرساء وضعه في MBSC.
- قم بشفط الوسائط من السقالة أعلاه إلى نقطة التوقف (النزول إلى الشق العميق على حلقة الاحتفاظ) والقناة والخزان. اترك "حجما ميتا" يبلغ 0.2 مل في بئر الثقافة ، ليصل إلى أعلى السقالة مباشرة. يجب الحرص على عدم إزالة الوسط الكلي من فوق السقالة لتجنب تكوين فقاعات الهواء.
- أضف 400 ميكرولتر من وسط Seeding Advanced DMEM إلى غرفة البئر ، وأعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج Media Change لمدة 3 دقائق. سيتوقف البرنامج تلقائيا بعد 3 دقائق.
- بمجرد الانتهاء، افصل السائق عن محطة الإرساء وضعه مرة أخرى في MBSC.
- قم بشفط الوسائط من السقالة أعلاه وصولا إلى نقطة التوقف وفي نهاية الخزان لكل بئر.
- أعد تعليق PHHs بعناية عن طريق هز الأنبوب برفق ، ثم أضف الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى كل بئر مزرعة. ماصة بعناية تعليق الخلية ، تأكد من أن الخلايا تتفرق بالتساوي عبر سقالة اللوحة.
ملاحظة: لضمان تغطية جيدة في جميع أنحاء السقالة ، استخدم حركة دوامية بطيئة لخلايا الماصة لأسفل على السقالة. - وبالمثل ، أعد تعليق HKCs بعناية وأضف معلقات الخلايا إلى كل مزرعة جيدا.
ملاحظة: استخدم حركة دوامة بطيئة لزرع HKCs لضمان تغطية جيدة في جميع أنحاء السقالة. يمكن فصل الخطوتين الفرعيتين للبذر ، أو يمكن خلط نوعي الخلايا مسبقا بكثافة مناسبة وبذرهما بشكل متزامن. - بمجرد احتواء جميع الآبار على كلا النوعين من الخلايا ، ضع برنامج تشغيل MPS على محطة الإرساء في الحاضنة دون توصيله فعليا واتركه للوقوف لمدة 1 ساعة.
- بعد 1 ساعة ، املأ كل بئر بالحجم المطلوب من وسط Seeding Advanced DMEM الإضافي للوصول إلى 400 ميكرولتر وتشغيل برنامج البذور .
- بعد دقيقتين ، سيتوقف البرنامج تلقائيا ، ويزيل السائق من الحاضنة ويضيف ببطء 1000 ميكرولتر من وسط Seeding Advanced DMEM إلى القناة (أقرب إلى نهاية الخزان من غرفة البئر) لتحقيق حجم إجمالي قدره 1.4 مل (مع حجم ميت إضافي 200 ميكرولتر في القنوات).
- انقل الألواح إلى الحاضنة وقم بتشغيل بقية برنامج البذور لمدة 8 ساعات.
ملاحظة: سيتحول Flow تلقائيا إلى برنامج Incubate بعد 8 ساعات.
4. تغيير وسائل الإعلام (اليوم 1)
- افصل السائق عن محطة الإرساء وضعه في MBSC.
- قم بإجراء تغيير الوسائط عن طريق إزالة وسيط DMEM المتقدم للبذر في غرفة البئر وصولا إلى نقطة التوقف.
- أضف 400 ميكرولتر من وسيط الصيانة المتقدم DMEM إلى غرفة البئر ، وأعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج تغيير الوسائط لمدة 3 دقائق. سيتوقف البرنامج تلقائيا بعد 3 دقائق.
- افصل السائق عن محطة الإرساء ، وفي MBSC ، قم بشفط الوسائط بعيدا عن حجرة الخزان والقناة ونقطة التوقف فوق السقالة. في هذه المرحلة ، سيتم إرجاع بئر الثقافة إلى الحجم الميت.
- قم بتعبئة حجرة الخزان ب 1.4 مل من وسط DMEM المتقدم للصيانة الطازجة (37 درجة مئوية).
- أعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج Incubate .
5. مراقبة جودة الأنسجة الدقيقة للكبد (QC) ، وجمع الوسائط ، وتغيير الوسائط ، وجرعات الأدوية (اليوم 4)
- في اليوم 4 ، قم بإجراء تغيير الوسائط باستخدام وسيط الصيانة المتقدم DMEM وفحوصات مراقبة الجودة لضمان نجاح البذر.
ملاحظة: مراقبة الجودة هي عملية تستخدم للتحقق من صحة الأنسجة الدقيقة المشكلة عن طريق قياس نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) واليوريا. - قبل تشغيل مراقبة الجودة ، قم بإعداد حلول مخزون جديدة لكل مركب لاختبارها (إما في وسيط الصيانة المتقدم DMEM أو وسيط الصيانة المتقدم DMEM الذي يحتوي على 0.1٪ DMSO ، اعتمادا على قابلية ذوبان كل مركب). تحضير التخفيفات وفقا لذلك للحصول على تركيزات اختبار لكل مركب.
- افصل السائق واللوحة عن محطة الإرساء وانقلها إلى MBSC.
- انقل 50 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر باستخدام ماصة إلى لوحة بئر 96 لإجراء فحص LDH (جدول المواد) قبل أخذ العينات و 25 ميكرولتر لفحص اليوريا (جدول المواد).
ملاحظة: سيتم إجراء فحوصات LDH واليوريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة. - استمر في التجربة بعد مراقبة الجودة إذا كانت قراءات LDH أقل من 2 AU / 10 6 خلايا واليوريا أعلى من 40 ميكروغرام / يوم / 106 خلايا.
ملاحظة: لا يتم استخدام الألبومين كمراقبة الجودة لأنه اختبار طويل للتشغيل في اليوم وسيتم فحصه لاحقا بمجرد اكتمال التجربة من العينات المسحوبة في اليوم 4. - إذا فشلت أي آبار في مراقبة الجودة ، فقم بإزالتها من التصميم التجريبي.
- بمجرد تأكيد التخطيط التجريبي ، قم بأخذ عينات من الوسائط المتبقية من كل بئر ، مع التأكد من عدم إزعاج ثقافة الخلية عن طريق لمس السقالة. قم بتخزين الوسائط التي تم جمعها (المسمى كعينات ما قبل الجرعة) عند -80 درجة مئوية للمقايسات اللاحقة.
- قم بإجراء تغيير الوسائط في MBSC باتباع الخطوات 4.3-4.5. قم بتغيير الآبار إلى وسيط DMEM المتقدم للصيانة مع تركيز الدواء المناسب وفقا للتصميم التجريبي.
- بمجرد الانتهاء ، أعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج Incubate .
6. جمع الوسائط وتغيير الوسائط وجرعات المخدرات (اليوم 6)
- قم بإعداد حلول مخزون جديدة لكل مركب لاختبارها (إما في وسيط DMEM المتقدم للصيانة أو وسيط DMEM المتقدم للصيانة الذي يحتوي على 0.1٪ DMSO ، اعتمادا على قابلية ذوبان كل مركب). تحضير التخفيفات وفقا لذلك للحصول على تركيزات اختبار لكل مركب وفقا لخطة اللوحة.
- افصل السائق واللوحة عن محطة الإرساء وانقلها إلى MBSC.
- اجمع الوسائط من كل بئر (~ 1 مل) يدويا باستخدام ماصة مع التأكد من عدم إزعاج ثقافة الخلية عن طريق لمس السقالة ، مقايسة LDH واليوريا. قم بتخزين بقية الوسائط التي تم جمعها عند -80 درجة مئوية للمقايسات اللاحقة ، وقم بتسميتها بعد 48 ساعة من العينات.
- أعد جرعة كل بئر بنفس تركيز الدواء كما في اليوم الرابع ووفقا لخطة اللوحة عن طريق إجراء تغيير الوسائط باتباع الخطوات 4.3-4.5.
- بمجرد الانتهاء ، أعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج Incubate .
7. إنهاء التجربة (اليوم 8)
- افصل السائق واللوحة عن محطة الإرساء وانقلها إلى MBSC.
- قم بأخذ عينات من الوسائط من كل بئر يدويا باستخدام ماصة ، مع التأكد من عدم إزعاج ثقافة الخلية عن طريق لمس السقالة.
- فحص الوسائط المسحوبة ل LDH واليوريا وتخزين بقية الوسائط المجمعة عند -80 درجة مئوية للمقايسات اللاحقة.
- تشغيل فحص CYP3A4-glo.
- قم بقياس آثار الأدوية التي تم اختبارها على نشاط السيتوكروم P450 CYP3A4 في PHHs في نهاية التجربة باستخدام هذا الفحص.
- أعد تشكيل كاشف الكشف (لفحص CYP3A4 ، انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. إذا كان كاشف الكشف قد تم إعادة تشكيله وتجميده مسبقا ، فقم بإزالته من الفريزر -20 درجة مئوية واتركه يذوب عند RT.
- قم بإعداد معيار D-luciferin للمخزون 20 مللي متر باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- تحضير وسط الركيزة الإنمائية العاملة بتخفيف 1: 1000 من Luciferin IPA في وسط DMEM المتقدم للصيانة (2 مل من وسط الركيزة المضيئة لكل بئر).
- قم بإجراء تغيير الوسائط كما هو موضح في الخطوات 4.3-4.5 باستخدام وسيط الركيزة المضيئة. وفر 500 ميكرولتر من وسط الركيزة المضيئة في قارورة زجاجية سعة 1.5 مل (جدول المواد) كمواد إدخال.
- أعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة وقم بتشغيل برنامج Incubate لمدة 1.5 ساعة.
- قم بإعداد منحنى D-luciferin القياسي في وسط الاستزراع في أنابيب سعة 1.5 مل باتباع تعليمات الشركة المصنعة وماصة 50 ميكرولتر من كل معيار مكرر على لوحة بيضاء غير شفافة ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد) ، باستخدام وسيط الاستزراع فارغا أو 0 ميكرومتر.
- بمجرد انقضاء الوقت ، قم بإزالة برنامج التشغيل من محطة الإرساء وعينة الوسائط لفحص CYP3A4 باتباع الخطوات 7.4.9-7.4.13.
- بعد الحضانة ، انقل 50 ميكرولتر من وسط العينة من كل بئر ومواد الإدخال إلى لوحة مقياس الإنارة البيضاء غير الشفافة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على معايير. احرص على ترك صفين فارغين على الأقل على اللوحة المعتمة بين المعايير والعينات لتجنب ترحيل الضوء بين المعايير العليا وقراءات العينات.
- أضف 50 ميكرولتر من كاشف الكشف عن لوسيفيرين إلى كل بئر لبدء تفاعل الإنارة.
- احتضان اللوحة في RT على شاكر لوحة لمدة 20 دقيقة في الظلام لتثبيت إشارة الإنارة.
- سجل التلألؤ باستخدام مقياس الإنارة أو كاميرا CCD.
- ارسم المنحنى القياسي بأخذ متوسط كل نقطة ثم طرح متوسط الفراغات. استخدم معادلة الخط لحساب معدل الأيض (pmol / min / 106 خلايا) في بقية العينات ، مع تذكر تضمين أي تخفيفات تم إجراؤها.
- قم بإزالة السقالات من الألواح باستخدام زوج من الملقط وضعها في صفيحة بئر 24 تحتوي على 500 ميكرولتر من D-PBS (بدون Ca++ و Mg ++) في كل بئر ، مع الحرص على عدم إزعاج الأنسجة الدقيقة.
- التقط لقطات لكل سقالة باستخدام مجهر ضوئي مقلوب عند التكبير 10x.
- تشغيل مقايسة ATP (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة:
- قم بإذابة الكاشف في RT.
- اغسل السقالات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من D-PBS (بدون Ca ++ و Mg ++) لكل خطوة غسيل.
- أضف 120 ميكرولتر من الكاشف و 120 ميكرولتر من PBS إلى كل سقالة ونفس الأحجام إلى بئر فارغ (سيكون هذا بمثابة فارغ). ضع اللوحة المغطاة بورق الألمنيوم على شاكر ورجها بقوة (500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق تليها 30 دقيقة من الحضانة لتثبيت إشارة التلألؤ.
- انقل 100 ميكرولتر من العينات المحللة في نسختين إلى لوحة فحص 96 بئر واضحة مسطحة القاع للقياس. تأكد من عدم وضع الآبار الفارغة بجانب آبار القياس الأخرى ذات التلألؤ العالي.
- سجل التلألؤ باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.
- قارن تلألؤ العينات بتلألؤ المعايير لتحديد ATP الذي اكتشفه الكاشف في العينات.
Representative Results
تصف المخطوطة نموذج MPS للكبد المستخدم لتقييم DILI. يسهل MPS توليد أنسجة الكبد الدقيقة ثلاثية الأبعاد التي يتم الحفاظ عليها وظيفية للغاية تحت التدفق لمدة تصل إلى 4 أسابيع. يتم زرع PHHs / HKCs على سقالات مغلفة بالكولاجين لتشكيل أنسجة دقيقة للكبد يتم تقطيعها بوسط نمو ، وبعد اجتياز فحص مراقبة الجودة ، يتم جرعاتها بالمركبات. هنا ، نعرض بيانات عن troglitazone و pioglitazone ، وهما مركبان متشابهان هيكليا ولكن مع شدة DILI مختلفة.
في اليوم 4 ، قبل جرعات الدواء ، يتم تقييم فحص مراقبة الجودة للأنسجة الدقيقة المشكلة للكبد ويتكون من إطلاق LDH وتوليف اليوريا (الشكل 1 أ). تهدف مراقبة الجودة إلى التأكد من أن MPS الكبد ينتج أنسجة دقيقة للكبد متسقة للغاية وتعمل. يتم إنشاء البيانات المقدمة هنا من ثلاث تجارب وتظهر مستويات جيدة من التكاثر مع تباين منخفض داخل الدراسة وفيما بينها. بعد زراعة لمدة 8 أيام ، يتم تقييم مقاييس صحية وكبدية متعددة (الألبومين ، اليوريا ، CYP3A4 ، ATP) وتظهر الأنسجة الدقيقة الضابطة مستويات عالية من وظائف الكبد وقابلية التكاثر (الشكل 1B ، C). يظهر الفحص المجهري لمرحلة التباين وتلطيخ IF للأنسجة الدقيقة للكبد (انظر المادة التكميلية) اتساقا عاليا في البذر في جميع أنحاء القنوات الدقيقة للسقالة ويكشف عن توزيع HKCs في الأنسجة الدقيقة PHH (الشكل 1D)
الشكل 1: تنتج MPS للكبد بيانات قابلة للتكرار بدرجة عالية وأنسجة دقيقة متسقة. (أ) مقاييس مراقبة الجودة للأنسجة الدقيقة للكبد ثلاثية الأبعاد في اليوم 4 ، وتقييم الوظائف في نهاية الدراسة في اليوم 8 - (ب) الألبومين واليوريا ، (ج) CY3A4 و ATP). يتم جمع البيانات من 3 تجارب. في كل تجربة ، كان هناك 3 نسخ مكررة للتحكم في السيارة. البيانات المعروضة هي متوسط ± SD ، N = 9. (د) الفحص المجهري لتباين الطور (10x و 20x) و IF للأنسجة الدقيقة للكبد ثلاثية الأبعاد الناتجة عن استزراع PHHs و HKCs في منصة MPS للكبد لتقييم DILI. لتصور HKCs ، قبل البذر ، تم تحويل HKCs مع ناقل فيروسي غدي يعبر عن eGFP (انظر المواد التكميلية). يتم عرض الصور المجهرية التمثيلية. تم إجراء النقل والتصوير كتجربة قائمة بذاتها لإثبات توطين الخلية ولم يتم إجراؤها باستخدام بروتوكول DILI الموصوف. يتم التحقق من صحة خلايا HKCs مسبقا داخل الشركة قبل استخدامها في زراعة الخلايا التجريبية ويجب أن يكون لها مستويات منخفضة من التنشيط بعد الذوبان ؛ يتم تقييم ذلك عن طريق قياس المؤشرات الحيوية IL-6 و TNF-alpha. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
من المعروف أن تروجليتازون يسبب DILI الشديد. بعد ترخيصها لعلاج مرض السكري من النوع 2 ، تم سحبها من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بعد 3 سنوات في السوق بسبب تكرار إصابة الكبد المرتبطة باستخدامه. حتى الآن ، فشلت الدراسات الحيوانية المنشورة في التنبؤ بقدرة تروجليتازون على التسبب في إصابة شديدة في الكبد. كما لم يتم الكشف عن سمية هذا المركب في المقايسات الكبدية القياسية 2D في المختبر 14.
تم إعطاء الأنسجة الدقيقة للكبد في MPS جرعة من troglitazone لمدة 96 ساعة ، وتسبب في استجابة سامة حادة ، مدفوعة ب Cmax ، والتي تم اكتشافها عن طريق إطلاق ALT و LDH وانخفاض سريع في إنتاج الألبومين واليوريا ، في حوالي 15 × Cكحد أقصى ، بعد التعرض الحاد للتروجليتازون (الشكل 2 أ). كانت نقطة النهاية الخلوية (محتوى ATP) ونشاط CYP3A4 (لتقييم التحول الحيوي الأيضي) ، التي تم أخذ عينات منها بعد التعرض لمدة 96 ساعة ، والسمية المؤكدة الأخرى الناجمة عن قيم troglitazone و EC: 50 قابلة للمقارنة إلى حد كبير مع نقاط النهاية الأخرى (الشكل 2B). تكشف صور الفحص المجهري لبرايتفيلد التي تم التقاطها بعد زراعة لمدة 8 أيام في MPS عن نسيج دقيق صحي للكبد ، يتم بذره بشكل موحد في جميع أنحاء السقالة (التحكم في السيارة) على عكس موت / تدهور الأنسجة المعمم كما هو موضح في النسخ المتماثلة المعالجة بالتحكم الإيجابي و troglitazone في أعلى تركيزين للاختبار (الشكل 2C).
الشكل 2: تحديد خطر DILI من troglitazone باستخدام نقاط نهاية متعددة سامة للكبد. تم تعريض الأنسجة الدقيقة للكبد لسبعة تركيزات اختبار من troglitazone لمدة 96 ساعة ومقارنتها ب (A) إطلاق LDH ، وإطلاق ALT ، وإنتاج الألبومين ، وتخليق اليوريا ، ونشاط CYP3A4 ، ومحتوى ATP. الخطوط الزرقاء - التعرض لمدة 48 ساعة (نقاط نهاية الوسائط فقط) ، الخطوط الحمراء - التعرض لمدة 96 ساعة. كان التحكم الإيجابي 100 ميكرومتر كلوربرومازين. يتم قياس جميع نقاط النهاية من نفس مزارع MPS الكبد. البيانات المعروضة هي متوسط ± SD ، N = 3. (ب) ملخص أرقام E:50 الناتجة عن البيانات. N.D. = البيانات غير قابلة للرسم. الخط = لم يتم فحصه. (ج) الفحص المجهري التمثيلي للأنسجة المجهرية للكبد بعد زراعة لمدة 8 أيام (التكبير 10x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
كما تم التحقيق في سمية الكبد بعد التعرض للبيوجليتازوني. Pioglitazone هو مركب معروف بأنه منخفض القلقDILI 4 ولم يمارس سمية كبدية في ثقافات خلايا الكبد الأولية الكلاسيكية ثنائية الأبعاد وحتى في بعض النماذج ثلاثية الأبعاد الأكثر تقدما10,11. لوحظت تأثيرات سامة كبدية خفيفة في كلتا النقطتين الزمنيتين المختبرتين (الشكل 3). لم يتم الكشف عن إطلاق LDH أو ALT ؛ ومع ذلك ، بعد 48 ساعة ، لوحظ انخفاض طفيف في إنتاج الألبومين واليوريا ، عند حوالي 25x Cكحد أقصى (الشكل 3A). كما لوحظ انخفاض طفيف جدا في محتوى ATP عند تركيزات عالية من البيوجليتازون ، لكن هذا لم يكن كبيرا. يتم عرض قيم EC: 50 الناتجة عن منحنيات الاستجابة للجرعة في الشكل 3B. كشف الفحص المجهري عن تغيير طفيف في الأنسجة الدقيقة بعد التعرض لمدة 96 ساعة للبيوجليتازون عند أعلى تركيزين تم اختبارهما (الشكل 3C). تظهر النتائج قدرة MPS الكبد على اكتشاف سمية المركبات ذات القلق الخفيف DILI.
الشكل 3: تحديد خطر DILI من بيوجليتازون باستخدام نقاط نهاية متعددة سامة للكبد. تم تعريض الأنسجة الدقيقة للكبد لسبعة تركيزات اختبار من بيوجليتازون لمدة 96 ساعة ومقارنة ب (A) إطلاق LDH ، وإطلاق ALT ، وإنتاج الألبومين ، وتخليق اليوريا ، ونشاط CYP3A4 ، ومحتوى ATP. الخطوط الزرقاء - التعرض لمدة 48 ساعة (نقاط نهاية الوسائط فقط) ، الخطوط الحمراء - التعرض لمدة 96 ساعة. كان التحكم الإيجابي 100 ميكرومتر كلوربرومازين. يتم قياس جميع نقاط النهاية من نفس مزارع MPS الكبد. البيانات المعروضة هي متوسط ± SD ، N = 3. (ب) ملخص أرقام EC:50 المستمدة من البيانات. N.D. = البيانات غير قابلة للرسم. الخط = لم يتم فحصه. (ج) الفحص المجهري التمثيلي للأنسجة المجهرية للكبد بعد زراعة لمدة 8 أيام (التكبير 10x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
من خلال تقييم جميع نقاط النهاية الوظيفية والمؤشرات الحيوية لمخرجات السمية التي قد تمثل في الجسم الحي أو السيناريوهات السريرية (إطلاق LDH ، تخليق اليوريا ، إنتاج الألبومين ، نشاط CYP3A4 ، محتوى ATP ، إطلاق ALT) وتأكيد البيانات المتولدة لكل من المركبات المختبرة بجرعات في نطاق جرعة من سبع نقاط لمدة 48 ساعة و 96 ساعة ، تم إنشاء خريطة حرارية للحصول على "توقيع السمية الكبدية" ، المساعدة في تحديد المركبات ذات المستوى المتفاوت من قلق DILI (الشكل 4).
الشكل 4: تحديد "توقيع السمية" مع MPS الكبد. خريطة حرارية تظهر تروجليتازون وبيوجليتازون من ست نقاط نهاية وظيفية خاصة بالكبد (إطلاق LDH ، تخليق اليوريا ، إنتاج الألبومين ، إصدار ALT ، نشاط CYP3A4 ، ومحتوى ATP) بعد التعرض لمدة 48 ساعة و 96 ساعة لنطاق جرعة من سبع نقاط. يتم إنشاء كل قيمة ك المتوسط ، N = 3 ، ويتم تسويتها للتحكم في العينات. تمثل القيم الموجودة على أشرطة الألوان زيادة أضعاف على عناصر التحكم الأساسية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
المواد التكميلية: تصوير المجهر الفلوري للأنسجة الدقيقة وتقييم التأهيل المسبق للخلايا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تم تصميم MPS لتلخيص الوحدات الوظيفية للأعضاء البشرية في المختبر وقد تم تطويرها لمعالجة قيود نماذج زراعة الخلايا التقليدية3D 27. الكبد هو واحد من أكثر الأعضاء على غرار باستخدام MPS ، وقد تم تطوير مجموعة واسعة من الأنظمة. الكبد البشري مسؤول عن استقلاب الدواء وتوليد مستقلبات الأدوية السامة ، ووظيفته هي عنصر أساسي لنمذجة تطوير الأدوية ، بما في ذلك تقييم مسؤولية DILI للمركبات28. هنا قدمنا طريقة جديدة لتقييم DILI باستخدام MPS الكبد. يتيح البروتوكول البحث عن رؤى ميكانيكية لكل مركب يتم فحصه لتحديد كيفية تسببه في DILI بالإضافة إلى كونه مقايسة شديدة الحساسية وقوية. تتشكل الأنسجة الدقيقة للكبد في صفائح MPS ، وهي عبارة عن استزراع مشترك ل PHH و HKCs وتعمل بشكل كبير مع مستويات عالية من إنتاج الألبومين واليوريا بالإضافة إلى نشاط CYP3A4 العالي مقارنة بنماذج الكبد القياسية في المختبر 20.
على الرغم من أن نموذج DILI الموصوف هنا يمكن أن يكون بمثابة أداة مفيدة في المراحل اللاحقة من الاختبارات قبل السريرية في عملية تطوير الدواء ، إلا أنه يحتوي أيضا على العديد من القيود. نظرا لأن غالبية MPS متوفرة حاليا في السوق ، فهي منصة منخفضة الإنتاجية ، وبالتالي ، يصعب استخدامها في أنشطة فحص المخدرات على نطاق واسع. يتكون نموذج DILI من أنسجة دقيقة تم تشكيلها عن طريق استزراع PHHs و HKCs ، كما لا يمكنه التقاط تعقيد الكبد البشري بالكامل ، وسيكون المزيد من التحسين من خلال دمج أنواع مختلفة من الخلايا (مثل الخلايا المناعية) مفيدا لإضافة قيمة إلى النموذج الحالي. يمكن أيضا دمج MPS أحادي العضو هذا مع منصات الأعضاء الأخرى التي يمكن أن تشترك في وسيط مشترك وتسمح بالحديث المتبادل للأعضاء على المستوى الخلوي أو الغدد الصماء ، والتي يمكن أن تساعد في فهم أفضل للرؤى الميكانيكية للسمية التي لا تقتصر فقط على الكبد نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التكنولوجيا، شأنها شأن أي تكنولوجيا جديدة نسبيا، يمكن اعتبارها مكلفة ومن ثم يمكن الوصول إليها بشكل محدود.
MPS عبارة عن منصة تستخدم لتطوير نماذج نمطية عضوية للأنسجة المفردة أو المتعددة البشر. يتكون النظام من وحدة تحكم وكابل سري وسائق MPS يتم إدخال اللوحة فيه (الشكل 5 أ). تحتوي كل صفيحة MPS للكبد على 12 بئرا مفتوحة مستقلة لزراعة خلايا الكبد الأولية في 3D على سقالات هندسية. باختصار ، يتم فحص النظام لمراقبة الجودة ، ويتم تحضير الألواح في اليوم -1 ، ويتم تصنيف PHHs و HKCs على الألواح في اليوم صفر (الشكل 5B ، انظر 1). تسهل المضخات الدقيقة المدمجة تداول وسائط زراعة الخلايا من خلال السقالات لتسهيل تكوين الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (الشكل 5 ب ، انظر 2). الأنسجة الدقيقة المشكلة هي QC'd في اليوم 4 ، وجرعات بتركيزات مختلفة من كل مركب كل 48 ساعة لمدة 4 أيام ، وفحصها للمؤشرات الحيوية لنقطة النهاية في اليوم 8 (الشكل 5C). تم تصوير الجدول الزمني التجريبي لمقايسة DILI في لوحة MPS في الشكل 5D.
الشكل 5: النظام الفيزيولوجي المجهري والجدول الزمني التجريبي لفحص DILI القياسي. (أ) النظام الفيزيولوجي المجهري بمكوناته: وحدة التحكم (1) ، الكبل السري (2) ، محطة الإرساء (3) ، سائق MPS (4) ولوحة LC12 (5). (ب) بذر PHHs و HKCs على لوحة LC12 في اليوم الأول (1) والمضخات الدقيقة المدمجة تسهل تداول وسائط زراعة الخلايا بمعدلات تدفق قابلة للضبط من خلال الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد المصنفة على السقالات (2). (ج) إنزال السقالات في نهاية الدراسة. (د) الجدول الزمني التجريبي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
عند تنفيذ البروتوكول ، من المهم إجراء فحص قوي لمراقبة الجودة للنظام قبل البدء ، والتحقق من أن النظام يعمل بالهواء المضغوط بشكل صحيح ويتم فحص الألواح القابلة للاستهلاك بصريا وتجهيزها بكفاءة لضمان وظائف متساوية في جميع الآبار. يعد وجود خلايا بشرية أولية عالية الجودة أمرا ضروريا لهذا البروتوكول ، حيث من المعروف أن خلايا الكبد تلتصق باستمرار في تجارب زراعة الخلايا وتشكل تفاعلات 3D. يعد إذابة هذه الخلايا أيضا خطوة حاسمة ، حيث لا ينبغي إعادة تعليق خلايا الكبد الأولية عن طريق عمل السحب لأن هذا يمكن أن يؤدي بسرعة إلى موت الخلايا. وجود بقاء الخلية فوق 85٪ أمر بالغ الأهمية لنجاح البذر ، حيث أن كميات كبيرة من الحطام الخلوي سوف تتداخل مع تكوين الأنسجة الدقيقة 3D. يعد فحص مراقبة الجودة للأنسجة الدقيقة للكبد المشكلة في اليوم 4 مهما أيضا ، ويحتاج المستخدم إلى التأكد من قياس المستويات المقبولة من LDH واليوريا ، حيث قد تكون المعلمات خارج النطاق مؤشرا على تكوين أنسجة رديئة الجودة وتسمح باستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل مباشر. أخيرا ، يجب تحضير الهيدروكورتيزون المستخدم في وسائط زراعة الخلايا طازجا في يوم الاستخدام لمنع أي تدهور غير مرغوب فيه قد يؤثر على وظيفة زراعة الخلايا ، حيث إنه مطلوب للحفاظ على وظيفة التمثيل الغذائي لخلايا الكبد.
على الرغم من وجود تعقيد كبير ، لا يحتوي MPS الكبد على جميع أنواع خلايا الكبد البشري. من الممكن إضافة أنواع أخرى من الخلايا إلى النموذج24,29 لزيادة الأهمية الفسيولوجية ، ولكن يجب إضافتها فقط مع تبرير واضح لسياق الاستخدام. لدراسة DILI PHH هي نوع الخلية الرئيسي ، ويسمح دمج HKCs في هذا النموذج بتحديد بعض الاستجابات المناعية. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن PHHs المعزولة من الكبد البشري و PHHs المحفوظة بالتبريد المتاحة تجاريا تميل إلى إظهار بعض الاختلافات من دفعة إلى أخرى. لقد أثبتنا هنا أن هذا البروتوكول ينتج نتائج قابلة للتكرار عند استخدامه مع مستحضرات عالية الجودة للخلايا. ومع ذلك ، من المتوقع حدوث بعض الاختلاف في الكثير ، ويمكن التغلب على ذلك باستخدام الكثير من المانحين المتعددين. يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام خلايا تشبه خلايا الكبد متمايزة عن iPSC التي تلخص العديد من الخصائص الوظيفية ل PHHs والتي تم استخدامها في عملية تطوير الدواء30. تظهر HKCs أيضا الكثير من التباين ومستوى عال من التنشيط عند ذوبان الجليد ؛ لذلك ، يتم التحقق من صحة الجهات المانحة HKCs مسبقا داخليا قبل استخدامها في زراعة الخلايا التجريبية (الاستزراع المشترك مع PHHs التي تم التحقق من صحتها) ويجب أن يكون لديها مستويات منخفضة من التنشيط بعد الذوبان ؛ يتم تقييم ذلك عن طريق قياس المؤشرات الحيوية IL-6 و TNF-alpha (انظر المواد التكميلية).
تؤكد البيانات المقدمة هنا أن الفحص يمكنه اكتشاف DILI بدقة ، مما يساعد على تحديد المواد السامة للكبد التي قد لا يتم اكتشافها بواسطة 2D10,11 وحتى بعض النماذج ثلاثية الأبعاد. لا تزال البيانات الناتجة عن MPS غير مستخدمة كمعيار من قبل صناعة المستحضرات الصيدلانية لتقديم الطلبات التنظيمية أو أغراض فحص الأدوية بسبب الافتقار إلى توحيد العملية ومواءمتها ، بما في ذلك قابلية التكرار بين المواقع20. تتناول البيانات والأساليب التجريبية الموضحة هنا هذا الأمر ، مما يدل على أنه يمكن استخدام نموذج الكبد بشكل روتيني وقوي في شاشات DILI للتنبؤ بدقة بمسؤولية المركبات الجديدة.
من خلال قياس مجموعة من نقاط النهاية لإنتاج "توقيع السمية الكبدية" ، مما يساعد على تحديد المركبات ذات المستويات المختلفة من قلق DILI (بما في ذلك المركبات التي لا يمكن اكتشافها بواسطة طرق أخرى في المختبر) وآليات سميتها المكشوفة. يمكن لهذه التكنولوجيا سد الفجوة بين زراعة الخلايا التقليدية والنماذج الحيوانية من جانب والتجارب السريرية البشرية ، والتقدم نحو محاكاة الظروف البيولوجية البشرية للتقييم قبل السريري لسمية الكبد كجزء من عملية تطوير الدواء.
Disclosures
جميع المؤلفين هم موظفون في CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
قامت شركة CN Bio Innovations Ltd. بتمويل هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S.
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
