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Le domaine de la biologie structurale s’est développé pour devenir un puissant système de compréhension de la biologie à travers les détails atomiques des structures biomoléculaires, enrichissant notre compréhension des voies biochimiques et de la base moléculaire des maladies, et offrant un outil indispensable pour la recherche translationnelle.
Au fil des ans, la biologie structurale est allée bien au-delà de la fourniture de structures statiques, pour rendre compte également des interactions moléculaires, à la fois dans la solution et dans les cellules, en examinant les échelles de temps et la dynamique. Des informations peuvent être obtenues pour expliquer des processus à différentes échelles de taille, à savoir des atomes et des molécules individuelles à des particules virales et des cellules entières. Différentes technologies offrent un ensemble synergique d’approches expérimentales, y compris des méthodes de diffusion basées sur les rayons X, les neutrons ou les électrons, par exemple, la cristallographie des rayons X (MX) ou la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ; la résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide et en solution ; et la reconstruction de particules uniques par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Des méthodes telles que la cryo-tomographie EM, la tomographie cryo-molle à rayons X et la RMN intracellulaire s’ajoutent à cet arsenal d’approches pour étudier les systèmes macromoléculaires, en particulier en lien avec d’autres outils d’imagerie. Associée à d’autres méthodes biophysiques qui fournissent des informations complémentaires sur les affinités et les échelles de temps de l’interaction moléculaire, la biologie structurale intégrative offre aujourd’hui un formidable ensemble de connaissances pour comprendre la vie et développer des médicaments, des produits biologiques (anticorps, nanocorps, vaccins), des biomatériaux et d’autres agents biologiques, tels que des enzymes qui peuvent être utilisés pour dégrader le plastique et aider l’environnement.
Très tôt, la Commission européenne (CE) a reconnu les avantages de la recherche en biologie structurale pour la société et, depuis les années 1980, l’Europe a fortement investi dans l’ouverture gratuite d’équipements coûteux de biologie structurale à l’ensemble de la communauté scientifique. Cette démocratisation de l’accès à des installations de plusieurs millions d’euros a été un moteur et une pierre angulaire pour le développement du domaine de la biologie structurale à l’échelle internationale. Cela a placé l’Europe à l’avant-garde du domaine, permettant ainsi un secteur industriel fort et contribuant aux économies locales.
La CE entretient une longue et impressionnante tradition d’accès et de formation de chercheurs externes dans le domaine des technologies de biologie structurale. Suite au succès du programme iNEXT (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research) qui a permis à la biologie structurale d’accéder gratuitement à des installations haut de gamme et à tous les chercheurs européens jusqu’à la fin de 2019, le projet Horizon2020 iNEXT-Discovery a démarré en février 2020 pour une autre période de quatre ans d’accès entièrement financé aux infrastructures de biologie structurale. En parallèle, Instruct-ERIC est un point de repère du Forum stratégique européen sur les infrastructures de recherche, constituant un bastion durable en biologie structurale pour les communautés scientifiques européennes et internationales. Ensemble, ils aspirent à impliquer les sciences de la vie et d’autres personnes dans la recherche en biologie structurale, et pour cela, ils offrent l’accès à certaines des meilleures expertises, technologies et installations en biologie structurale au monde, aux chercheurs du milieu universitaire et de l’industrie. En collaboration avec d’autres partenaires, ils organisent également des ateliers et des formations pratiques.
En raison de la pandémie de Covid19, les déplacements vers les installations de recherche iNEXT-Discovery et Instruct-ERIC ont été largement entravés, interdisant essentiellement les possibilités de formation pratique. Pour compenser en partie cela, iNEXT-Discovery et Instruct-ERIC ont tous deux organisé une série de webinaires (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), ainsi que ce numéro spécial Méthodes du Journal of Visualized Experiments. Vous trouverez ici des descriptions détaillées non seulement pour plusieurs de nos procédures d’accès courantes, mais aussi pour des routines spécialisées en cours de développement dans le domaine de la biologie structurale intégrative. Si nos méthodes sont décrites en détail dans ce numéro, certaines nécessitent une expertise et un équipement difficiles à mettre en place localement. Les installations d’Instruct-ERIC et d’iNEXT-Discovery sont disponibles pour fournir ces méthodes, y compris la production des biomolécules nécessaires aux études structurales, avec l’aide et la supervision d’un personnel local hautement qualifié.
Méthodes améliorées de détermination des structures macromoléculaires
Au cours de la dernière décennie, la cryo-EM est devenue une technologie très populaire pour déterminer les structures macromoléculaires complexes. L’équipe de l’Université de Leeds (Royaume-Uni) donne un aperçu de toutes les étapes de l’analyse EM à particule unique, en se concentrant sur les variables qui peuvent être optimisées pendant le flux de travail et le dépannage des problèmes courants1. L’utilisation du microscope en ligne par des utilisateurs externes devenant la norme, des protocoles pour une utilisation et une imagerie à distance efficaces sont nécessaires. Grâce à l’analyse à particules uniques, des échantillons vitrifiés sont imagés pour produire des films montrant des particules dans des orientations aléatoires. Un flux de traitement d’images identifie les paramètres de reconstruction de l’échantillon étudié. Le logiciel Scipion du CSIC (ES) fournit tous les outils pour créer ce flux de travail, permettant également une traçabilité simple des résultats2.
La collecte de données de diffraction des rayons X sur de très petits échantillons cristallins offre de grandes opportunités de recherche ainsi que des défis techniques. L’équipe Diamond (Royaume-Uni) présente l’utilisation d’outils de cryo-EM pour préparer des centaines de microcristaux sur une seule grille avec un minimum de liquide environnant sur un support à faible bruit, avant de collecter des données dans un environnement de ligne de faisceau dédié qui comprend un vide dans le trajet des rayons X avant et après l’échantillon3. La collecte de données en série de rayons X dans les synchrotrons est également essentielle pour l’étude d’autres systèmes cristallins difficiles. Dans une autre contribution, Diamond montre des instructions étape par étape, des figures et des vidéos pour la collecte de données à l’aide d’une variété de systèmes de distribution de cristaux, à travers une série d’exemples4.
La biologie structurale intégrative moderne dans la découverte de médicaments
La cristallographie aux rayons X est bien établie pour la découverte de médicaments à base de fragments et est déjà couramment utilisée pour identifier des résultats qui peuvent être développés en douceur sur des candidats principaux. Les équipes de Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) et MAX IV (SE)6, ainsi que de l’unité de Grenoble de l’EMBL (FR)7 décrivent leurs derniers développements en matière d’automatisation des flux de travail pour la cristallisation efficace des cibles, le trempage des fragments, le montage des cristaux, le criblage de fragments piloté par la cristallographie et le dépôt de structures. Leurs pipelines sont assez automatisés et sont utilisés par des chercheurs externes dans le monde entier. Ils ont déjà été appliqués à plus de 100 cibles (souvent à distance) afin d’identifier les résultats pour la conception de composés et le développement de prospects assisté par structure.
La RMN est également couramment utilisée pour le criblage de fragments dans les campagnes de développement de médicaments, ciblant soit des protéines, soit des polynucléotides, solubles ou liés à une membrane. L’Université Goethe de Francfort (DE) présente des pipelines de criblage RMN optimisés, réduisant ainsi les interventions manuelles lors de l’expérimentation et des analyses8. Leurs passeurs d’échantillons traitent des centaines d’échantillons RMN en une seule fois pendant plusieurs jours d’expérimentation ininterrompue et d’analyse automatisée.
De plus, les méthodes biophysiques sont complémentaires aux rayons X et à la RMN. L’équipe de l’Institut néerlandais du cancer (NL) présente un flux de travail utilisant la calorimétrie à balayage nano-différentiel pour les tests de décalage thermique afin de mesurer les changements de température de fusion cible lors de l’ajout de fragments9. Les conditions préalables concernant la qualité et la concentration des protéines sont suivies d’un protocole analytique pour la conception expérimentale, la collecte de données et l’analyse.
Vers la biologie structurale cellulaire
La cryotomographie électronique est souvent la méthode de choix pour examiner les complexes macromoléculaires dans les cellules. Des images d’échantillons vitrifiés sont acquises à différents angles d’inclinaison, et un tomogramme 3D est reconstruit, à partir duquel des sous-volumes sont extraits pour donner une résolution plus élevée par moyenne de sous-tomogramme. Comme les électrons interagissent fortement avec la matière, de telles études nécessitent des échantillons de moins de 200 nm d’épaisseur. L’équipe CEITEC (CZ) présente un protocole10 pour la préparation des lamelles cellulaires après congélation en plongée. Même si l’automatisation de la cryo-ET a fait des progrès impressionnants, des heures de collecte de données sont nécessaires avant l’acquisition de la série d’inclinaison, et les cibles sont généralement encore identifiées par une inspection visuelle de la grille. Un protocole d’automatisation a été préparé par l’EMBL Heidelberg (DE) pour cartographier les grilles et les carrés de grille, sélectionner les cibles et mettre en place l’acquisition de séries d’inclinaison11.
Les synchrotrons ALBA (ES) et Diamond discutent ensemble des pièges et des avantages d’une alternative à la cryo-tomographie EM qui permet d’examiner des cellules intactes, à savoir la cryo-tomographie à rayons X mous (cryo-SXT)12. L’adaptation des techniques de super-résolution aux températures cryogéniques permet d’obtenir des images corrélatives avec la cryo-ET et la cryo-SXT. De plus, la microscopie à illumination cryostructurée à haut débit (cryo-SIM) double la résolution de la fluorescence conventionnelle, ce qui permet de localiser spécifiquement des molécules ou des structures dans des échantillons épais. Cela peut être corrélé avec le cryo-SXT pour identifier des caractéristiques spécifiques dans le contexte cellulaire13.
L’équipe de l’Université d’Utrecht (NL) rapporte la préparation d’échantillons et des expériences de RMN à l’état solide à haute sensibilité qui peuvent être utilisées pour étudier des systèmes physiologiques difficiles, y compris les membranes naturelles et les systèmes protéine-lipide-glycane14. De plus, la RMN en solution cellulaire évolue rapidement pour élucider les processus fonctionnels. L’équipe CERM/CIRMMP (IT) décrit comment assembler et faire fonctionner des bioréacteurs qui permettent de reconstituer les nutriments et l’oxygène des cellules vivantes à l’intérieur de la sonde RMN au cœur d’un aimant à haut champ15. Cela permet des mesures étendues et des expériences résolues en temps, par exemple pour surveiller les interactions protéine-ligand intracellulaires.
Remarques finales
Ce numéro de JoVE est entièrement consacré aux développements récents de la biologie structurale et à ses applications dans les infrastructures de recherche européennes. Ensemble, iNEXT-Discovery et Instruct-ERIC permettent aux spécialistes de la biologie structurale, mais aussi de plus en plus aux spécialistes des sciences de la vie et à d’autres chercheurs, de poursuivre leurs objectifs de recherche en offrant des services de pointe.