Summary
在这里,我们提出了一种方案,利用柱状磁激活细胞分选在脱髓鞘疾病的动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞。
Abstract
小胶质细胞是大脑中常驻的先天免疫细胞,是中枢神经系统(CNS)炎症或损伤的主要反应者。小胶质细胞可分为静息状态和活化状态,并能响应大脑的微环境迅速改变状态。小胶质细胞将在不同的病理条件下被激活,并表现出不同的表型。此外,活化小胶质细胞有许多不同的亚群,不同亚群之间有很大的异质性。异质性主要取决于小胶质细胞的分子特异性。研究表明,小胶质细胞将被激活,并在炎症性脱髓鞘的病理过程中发挥重要作用。为了更好地了解小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病(如多发性硬化症和神经脊髓炎视谱系障碍)中的特征,我们提出了一种围膜原发性小胶质细胞分选方案。该方案利用柱状磁活化细胞分选(MACS)获得高度纯化的原代小胶质细胞,并保留小胶质细胞的分子特性,以研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的潜在作用。
Introduction
小胶质细胞起源于卵黄囊祖细胞,其很早就到达胚胎大脑并参与CNS1,2的发育。例如,它们参与突触修剪3 和调节轴突生长4。它们分泌促进神经元存活和帮助神经元定位的因子5。同时,它们参与去除异常细胞和凋亡细胞,以确保大脑的正常发育6。此外,作为大脑的免疫感受态细胞,小胶质细胞不断监测脑实质以清除死细胞,功能失调的突触和细胞碎片7。已经证明,小胶质细胞活化在多种疾病中起重要作用,包括炎症性脱髓鞘疾病,神经退行性疾病和脑肿瘤。多发性硬化症(MS)中活化的小胶质细胞有助于少突胶质细胞前体细胞(OPCs)的分化和髓鞘的再生,通过吞噬髓鞘碎片8。
在阿尔茨海默病(AD)中,淀粉样蛋白β(Aβ)的积累激活小胶质细胞,其影响小胶质细胞9的吞噬和炎症功能。神经胶质瘤组织中活化的小胶质细胞,称为胶质瘤相关小胶质细胞(GAM),可以调节胶质瘤的进展并最终影响患者的预后10。激活深刻地改变了小胶质细胞转录组,导致形态学变化,免疫受体的表达,吞噬活性增加和细胞因子分泌增强11。在神经退行性疾病中,活化小胶质细胞有不同的亚群,例如疾病相关性小胶质细胞 (DAM)、活化反应小胶质细胞 (ARM) 和小胶质细胞神经退行性表型 (MGnD)8。
类似地,小胶质细胞的多个动态功能亚群也在炎症性脱髓鞘疾病中共存于大脑中12。了解小胶质细胞不同亚群之间的异质性对于研究炎症性脱髓鞘疾病的发病机制并找到其潜在的治疗策略至关重要。小胶质细胞的异质性主要取决于分子特异性8。准确描述小胶质细胞的分子改变对于研究异质性至关重要。单细胞RNA测序(RNA-seq)技术的进步使得在病理条件下鉴定活化小胶质细胞的分子特征13。因此,分离细胞群的能力对于在特定条件下进一步研究这些靶细胞至关重要。
为了解小胶质细胞的特征和功能而进行的研究通常是 体外 研究,因为已经发现可以从小鼠幼鼠大脑(1-3天大)制备和培养大量原代小胶质细胞,这些小鼠幼鼠附着在培养瓶上并与其他混合神经胶质细胞一起生长在塑料表面上。随后,纯小胶质细胞可以基于混合胶质细胞14,15的不同粘附性来分离。然而,这种方法只能从围产期大脑中分离出小胶质细胞,需要数周时间。细胞培养中的潜在变量可能会影响小胶质细胞特征,例如分子表达16。而且,通过这些方法分离的小胶质细胞只能通过模拟中枢神经系统疾病的状况来参与 体外 实验,不能代表小胶质细胞 在体内 疾病状态下的特征和功能。因此,有必要开发从成年小鼠大脑中分离小胶质细胞的方法。
荧光活化细胞分选(FACS)和磁分离是两种广泛使用的方法,尽管它们有其不同的局限性16,17,18,19。它们各自的优点和缺点将在讨论部分进行对比。MACS技术的成熟为快速纯化细胞提供了可能性。Huang等人已经开发出一种方便的方法来标记大脑中的脱髓鞘病变20。结合这两种技术方法,我们提出了一种快速有效的柱状CD11b磁分离方案,提供分步描述,以分离成年小鼠大脑脱髓鞘病变周围的小胶质细胞,并保留小胶质细胞的分子特征。局灶性脱髓鞘病变是由在开始方案21前3天在胼胝体中立体定向注射2μL溶血卵磷脂溶液(1%LPC在0.9%NaCl中)引起的。该协议为进行 体外 实验的下一步奠定了基础。此外,该协议节省了时间,并且在各种实验中广泛使用仍然是可行的。
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Protocol
所有动物程序均已获得中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会的批准。
1. 材料
- 在开始协议之前,请准备以下解决方案。
- 通过将胎牛血清(FBS,2%)添加到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备上样缓冲液。
- 在PBS中添加中性红(NR)染料(最终1%)。
- 使用市售的成人大脑解离试剂盒准备以下解决方案(参见 材料表)。
- 为了制备酶混合物1,将1.9mL缓冲液Z和50μL酶P移液到15mL离心管中。
- 为了制备酶混合物2,将20μL缓冲液Y和10μL酶A移液到1.5mL微量离心管中。
- 准备碎屑去除溶液。
2. 小鼠灌注和解剖
- 腹膜内(ip)在麻醉前2-3小时在PBS中向小鼠注射500μL1%NR染料。
注意:在脱髓鞘小鼠模型中腹腔注射NR有助于辨别病变(图1)。 - 用戊巴比妥(50mg / kg,ip)麻醉小鼠,并通过检查疼痛反应确保小鼠成功麻醉。
- 打开鼠标的胸腔并露出心脏。
- 小心地切下右心房的一个小角,并从左心室用20-30mL冷PBS心内灌注小鼠。
- 在麻醉下将小鼠斩首。
- 打开小鼠的头骨,小心地将大脑从头骨中解放出来。
- 将大脑转移到小鼠大脑切片模具中,并将大脑切成0.1厘米的切片。
- 取出脑切片并将其置于培养皿(60/15毫米)的冷PBS中。使用显微外科镊子在立体显微镜下用NR染料标记的胼胝体周围标记的病变进行显微切片。
注意:确保解剖组织尽可能完整,以方便随后的转移;总解剖进度应在2小时内完成。 - 将解剖组织转移到含有适当量冷上样缓冲液的15 mL离心管中。
注意:将2-3只小鼠的胼胝体组织在一个管中作为一个样品池化。
3. 组织解离
- 将解剖的组织以300×g离心30秒(达到此速度后)以收集管底部的样品。
- 在培养箱中预热酶混合物1和酶混合物2至37°C。
- 将1,950μL预热酶混合物1加入一个样品中,并在37°C的培养箱中消化5分钟。
- 加入30μL预热酶混合物2并轻轻混合。
- 在37°C的培养箱中消化15分钟,每5分钟轻轻混合一次。
- 消化后将4毫升冷PBS加入管中,轻轻摇匀。
- 将70μm过滤器放在50 mL离心管上,并用500μL冷PBS预湿滤器。通过将消化的组织样品通过过滤器来过滤解离的组织,并将50 mL离心管中过滤的悬浮液转移到15 mL离心管中。
注意:如果组织量太小,请跳过此步骤。 - 将过滤的组织样品在4°C下以300×g 离心10分钟,并缓慢完全地吸出上清液。
注意:除酶消化外,所有步骤都应在冰上进行。
4. 清除碎屑
- 用1,550μL冷PBS轻轻重悬细胞沉淀。
- 加入450μL冷溶液以去除碎屑并充分混合。
- 使用1,000μL移液器非常缓慢且轻轻地用2×1 mL冷PBS覆盖上述混合物。
注意:离心管倾斜45°,并用移液器沿管壁缓慢添加PBS。 - 将管缓慢而轻柔地转移到离心机中,并在4°C和3,000× g 下旋转10分钟。
- 离心后寻找三层。使用1,000μL移液器完全吸出两层顶层(图2)。
- 用冷负载缓冲液填充高达5 mL的试管,并轻轻倒置试管三次。
- 在4°C和1,000× g 下离心10分钟。完全吸出上清液,避免破坏细胞沉淀。
5. 小胶质细胞的磁分离
- 用90μL上样缓冲液重悬细胞沉淀,并加入10μLCD11b(小胶质细胞)珠。
- 充分混合并在4°C下孵育15分钟。
- 加入1mL上样缓冲液,并用1,000μL移液管轻轻上下移液,以在孵育后洗涤细胞。将细胞在4°C和300×g 下离心10分钟,并完全吸出上清液以除去未结合的珠子。
- 将细胞重悬于500μL上样缓冲液中。
- 将 MS 色谱柱与其分离器一起放置在磁场中进行正向选择。
- 用500μL上样缓冲液冲洗色谱柱,以保护细胞并确保基于制造商协议的磁分选效率。
- 将细胞悬浮液施加到MS柱上,并丢弃含有未标记细胞的流出物。
- 向色谱柱中加入500μL上样缓冲液三次,以洗去粘附在柱壁上的细胞并丢弃流出的细胞。
注意:仅当色谱柱储液器完全空时,才添加新的上样缓冲液进行洗涤。 - 洗涤色谱柱后,将色谱柱从分离器中取出,并将其放在 15 mL 离心管上。
- 向色谱柱中加入1 mL上样缓冲液,并将柱塞推至色谱柱底部以冲洗出磁性标记的细胞。重复此步骤三次以完全收集磁性标记的细胞。
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Representative Results
使用CD11b珠分离的小胶质细胞具有高纯度
使用上述方案分离脱髓鞘小鼠模型中病变周围的小胶质细胞,并通过流式细胞术进行测试。用CD11b-荧光素异硫氰酸酯(FITC)和CD45-别叶花青素(APC)荧光标记细胞,以根据制造商的说明在流式细胞术中测定小胶质细胞。有多种文献表明,CD11b和CD45抗体足以检查分离出的小胶质细胞19,22的纯度。使用未染色和单染色的对照样品在流式细胞仪上完成荧光补偿。细胞由前向散射高度(FSC-H)和侧散射高度(SSC-H)门控;单细胞由前向散射区(FSC-A)和FSC-H门控。通过流式细胞术测试磁分离前后小胶质细胞(鉴定为CD11b + CD45中间体)的比例。采用后循环技术,通过确定小胶质细胞的门限来调整流式细胞术分析的门控策略。与每个小鼠大脑磁分离前约3×104 个细胞和6个×103 个小胶质细胞(图3A)相比,MACS通常每个小鼠大脑产生约2.5×10个3 个细胞和2个×103 个小胶质细胞(图3B),约占所有单细胞的85%。然而,近3%的骨髓细胞(被鉴定为CD11b + CD45高)存在于MACS分离的细胞中,并且难以从该方案中的CD11b群体中去除。使用两个磁柱可以将分离的小胶质细胞的纯度提高到95%(补充图S1)。MACS分选可以捕获大脑混合物样本中约33%的小胶质细胞。
使用CD11b珠分离的小胶质细胞具有高细胞活力
荧光染料7-氨基放线菌素D(7-AAD)通常用于在流式细胞术中显示细胞活力。7-AAD+ 细胞代表死细胞19。通过用7-AAD进行细胞染色,MACS分离的小胶质细胞的存活率约为95%(图4)。
MACS分选脱髓鞘病变周围小胶质细胞的形态学分析
形态学分析表明,小胶质细胞未被 MACS 激活。小胶质细胞在MACS后表现出典型的纵向双极细胞体,这与FACS19之后的小胶质细胞形态相似。脱髓鞘病变周围的小胶质细胞将在LPC诱导的脱髓鞘模型中被激活21。由离子化钙结合分子1(Iba-1)染色的小胶质细胞在该方案中显示出活化小胶质细胞的典型阿米巴形态。P2ry12是小胶质细胞静息状态的典型分子。由于解离病变范围的扩大,MACS 前有一小部分支化和 P2ry12+ 小胶质细胞。然而,MACS后P2ry12 + 小胶质细胞的存在也表明MACS不会激活小胶质细胞(补充图S2)。
图1:由中性红色染料标记的局灶性脱髓鞘病变的图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图2:离心形成的三层图像。 在碎屑清除过程中需要去除顶部的两层(层1+层2)(参见协议步骤4.5)。 请点击此处查看此图的大图。
图3:从MACS之前和之后从成年小鼠脱髓鞘病变中分离出的小胶质细胞的流式细胞术 分析的流式细胞术分析。(A)MACS之前流式细胞术分析中使用的门控策略的示意图:FSC-H和SSC-H用于选择细胞,FSC-A和FSC-H用于选择单细胞,CD11b-FITC和CD45-APC用于选择骨髓细胞(向上)和小胶质细胞(向下)。(B)MACS后流式细胞术分析样品所用的门控策略示意图。MACS后小胶质细胞的比例显着增加:FSC-H和SSC-H用于选择细胞,FSC-A和FSC-H用于选择单细胞,CD11b-FITC和CD45-APC用于选择髓细胞(上)和小胶质细胞(向下)。缩写:SSC-H = 侧散射高度;FSC-H = 前向散射高度;FSC-A = 正向散射面积;CD45-APC = 同种子花青素标记的CD45;CD11b-FITC = 荧光素异硫氰酸酯标记的CD11b;MACS = 磁性激活的细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。
图4:MACS后活细胞/死单细胞的FACS门控策略, 7-AAD和SSC-H用于选择MACS之后的活细胞。缩写:SSC-H = 侧散射高度;7-AAD = 7-氨基放线菌素D;MACS = 磁激活细胞分选;FACS = 荧光激活的细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1:从成年脱髓鞘小鼠中分离的小胶质细胞的流式细胞术分析。 (A)MACS前流式细胞术分析样品所用门控策略的示意图。(B)使用两个磁柱的MACS后流式细胞术分析样品中使用的门控策略示意图。(C)使用两个磁柱在MACS后流式细胞术中CD11b-FITC和CD45-APC的单参数直方图。缩写:SSC-H = 侧散射高度;FSC-H = 前向散射高度;FSC-A = 正向散射面积;CD45-APC = 同种子花青素标记的CD45;CD11b-FITC = 荧光素异硫氰酸酯标记的CD11b;MACS = 磁激活细胞分选;CD45Int = 中间 CD45 表达。 请点击此处下载此文件。
补充图S2:MACS之前和之后用Iba-1和P2ry12对小胶质细胞进行免疫荧光染色。 (A)MACS前的小胶质细胞图像。(B)MACS后孤立的小胶质细胞的图像。比例尺 = 20 μm。缩写:MACS =磁性活化细胞分选;Iba-1 =离子化钙结合适配器分子1;DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该方案提出了一种分离脱髓鞘病变周围的小胶质细胞的方法,可以帮助研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的功能特征。使用CD11b珠捕获的小胶质细胞具有高纯度和活力。方案中的关键步骤包括病灶的精确定位和最佳的小胶质细胞纯化。在方案步骤2.1中,有必要在牺牲小鼠之前2小时注射NR溶液,以确保病变可以准确显示20。在方案步骤2.8中,注意将脑组织切片放在冰盒上进行解剖,并尽快完成此步骤,从而提高细胞活力。在步骤2.9中,有必要选择适当的组织作为酶消化和碎片去除的一个样品。步骤3.7当碎屑清除效果不理想时,不能跳过。在步骤4.3中,PBS的添加必须温和以形成不同的层,以确保尽可能多地去除碎屑。除酶消化外,方案中的所有步骤都应在冰上进行,以确保细胞活力并降低小胶质细胞的转录反应。方案中的每个步骤都是温和的并保持高活力的,因此没有必要使用死细胞去除溶液22,23。
该方案中小鼠大脑的酶解离方法已被证明适用于单细胞RNA-seq23。尽管方案中的酶是温和的,但Marsh等人发现,在37°C下的各种酶水解方案可能显着改变小胶质细胞24的转录组。在实验中设置一个健康的对照进行比较,可以帮助鉴定脱髓鞘的差异表达基因,从而消除方案中异常的转录反应。同时,为了防止酶消化后这种异常的转录状态,该方案可以通过在不同步骤中添加放线菌素D,曲托利特和茴香霉素等各种转录和翻译抑制剂来优化方案。使用这些抑制剂可以揭示体内小胶质细胞的真实基因表达 ,而无需设置 对照。因此,将这些抑制剂添加到方案中可以减少实验中所需的动物或标本的数量,并且对于下游分析更经济。然而,应该注意的是,小胶质细胞的某些基因将被这些抑制剂调节,这可能会限制这些抑制剂在未来工作的利用24。使用专门的解离器仪器在加入酶混合物1和酶混合物2进行组织解离后也可以限制方案步骤3中的转录反应23。
此协议有一些限制。该方案中小胶质细胞的纯度仅为约85%,其未能占与其他文献相似的所有单细胞的90%以上19,22。用MS柱替换LS柱,缺少过滤器以及微珠的质量可能是潜在原因。如果分离的小胶质细胞的纯度不能满足要求,延长磁孵育时间或使分选的细胞通过第二个磁柱将提高纯度(补充图S1)。如果细胞数量低,应从更多小鼠中收获组织,并避免由于粗心误吸而导致的细胞损失。如果细胞活力低,用RPMI 1640培养基替换上样缓冲液中的PBS可以显着提高细胞活力。确保方案中使用的所有溶液都是新鲜的,并且方案尽快完成,也有利于细胞活力。对于用户来说,平衡使用该协议获得的小胶质细胞的纯度和数量非常重要。
该协议利用小胶质细胞与CD11b磁珠的结合以及在磁场中的富集来纯化小胶质细胞。因此,纯化的小胶质细胞含有骨髓细胞的污染,这在该方案中是不可避免的。与FACS(分选细胞的黄金标准)相反,MACS分离的小胶质细胞的纯度对于一些复杂的应用(如深度测序)来说不够高,这限制了其广泛使用。此外,用于分选小胶质细胞的FACS可以消除骨髓细胞的污染。然而,MACS是一种更温和的方法,保留了更多神经胶质细胞特别是星形胶质细胞的原始形态学特征,分离小胶质细胞所需的时间更少,并且具有比FACS更高的细胞产量,这表明它可以减少要处死的小鼠数量,并且可能更适合时间敏感的实验19,25.同时,MACS更具成本效益和广泛可用,对实验人员的技术要求更低。MACS已被证明是分离小胶质细胞的最可靠和最一致的方法。形态学分析表明,小胶质细胞不会被MACS激活,RNA-seq已经证明通过这种方法分离的小胶质细胞保持静止状态19,26。
总体而言,该方案对于调查脱髓鞘疾病中的小胶质细胞非常重要,并且通过该方案分离的小胶质细胞可用于各种下游应用,例如定量RT-PCR和RNA-seq。该方案利用中性红色染料来定位脱髓鞘病变,这确保了病变位置的准确性,并减少了取样过程中与正常组织的任何混淆。病变的准确定位有助于关注疾病的影响,并研究小胶质细胞在脱髓鞘疾病中独特的分子表型和功能特征。这将为研究小胶质细胞在脱髓鞘疾病中的机制提供依据。这种使用磁性CD11b磁珠分离小胶质细胞的方法可以在短时间内纯化具有高细胞活力和产量的小胶质细胞,对实验条件的要求最低,这允许在不同条件下广泛用于研究小胶质细胞。
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Disclosures
作者宣布不存在相互竞争的利益。
Acknowledgments
该研究得到了同济医院(HUST)优秀青年科学家基金会(No. 2020YQ06)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
PBS | BOSTER | PYG0021 | |
Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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