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Article de méthode

Isolement de cellules lymphoïdes innées du groupe 2 de la muqueuse nasale de souris pour détecter l’expression de CD226

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DOI :

10.3791/63525

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10 mai 2022

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1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2), impliquées dans l’inflammation de type 2, participent principalement à la réponse à l’infection par les helminthes, aux maladies allergiques, à l’homéostasie métabolique et à la réparation des tissus. Dans cette étude, une procédure pour isoler les ILC2 de la muqueuse nasale murine et détecter l’expression de CD226 est démontrée.

Résumé

Avec de nombreuses recherches sur les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) publiées au fil des ans, les ILC2 sont largement connues pour être impliquées dans la régulation de divers processus pathologiques, y compris l’immunité anti-helminthes, la réparation des tissus, la thermogenèse et les maladies auto-immunes telles que l’asthme et la rhinite allergique (AR). Les ILC2 résident en permanence dans les tissus périphériques tels que la peau, l’intestin, les poumons et les fosses nasales; Cependant, il existe peu d’informations sur leurs fonctions exactes dans l’immunité de la muqueuse nasale. CD226 est une molécule costimulatrice activatrice, principalement exprimée sur les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules T et les monocytes inflammatoires. Cependant, on ne sait pas si les ILC2 expriment CD226 ou jouent un rôle dans la pathogenèse des maladies liées aux ILC2s. Ici, nous avons établi une méthode pour isoler et identifier les ILC2 de la muqueuse nasale et détecté l’expression de CD226 sur des ILC2 obtenues à partir de souris saines et AR. Nous décrivons ici ce protocole pour l’isolement et l’identification des ILC2 de la muqueuse nasale de souris, ce qui aidera à explorer le mécanisme pathologique interne des troubles immunologiques dans les maladies de la muqueuse nasale.

Introduction

Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) ont d’abord été découvertes dans les tissus de la cavité péritonéale de souris et leur présence dans le sang et d’autres tissus périphériques tels que les poumons, la peau et les fosses nasales 1,2,3 a été démontrée. En tant que cellules résidentes des tissus, les ILC2 sont principalement maintenues et proliférées localement et fonctionnent comme les premiers gardes répondant aux stimuli nocifs exogènes en produisant de nombreuses cytokines de type 2 et en induisant une immunité de type 2 4,5,6. Les ILC2 peuvent également exercer leurs effets en trafiquant vers les tissus infectés 7,8.

Semblables aux cellules T-helper 2 (Th2), les réseaux régulateurs complexes des ILC2 assurent leur implication significative dans la progression de diverses maladies inflammatoires de type 2, y compris les maladies allergiques des voies respiratoires 8,9. Dans l’asthme, les alarmines dérivées des cellules épithéliales peuvent activer les ILC2, qui favorisent davantage l’inflammation pulmonaire par la sécrétion d’interleukine (IL)-4, IL-5 et IL-1310. Des études cliniques ont également indiqué que les taux d’ILC2 étaient significativement élevés dans les expectorations et le sang des patients souffrant d’asthme sévère, suggérant une association des ILC2 avec la gravité de l’asthme et leur fonction en tant que prédicteur de la progression de l’asthme11.

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique courante qui touche des millions de personnes chaque année, et les traitements efficaces pour cette maladie sont limités12,13. Les ILC2 jouent un rôle crucial dans la physiopathologie de l’AR, que ce soit dans la phase de sensibilisation ou la génération de symptômes et la phased’inflammation 14. Chez les patients atteints d’EI, les taux d’ILC2 dans le sang périphérique ont été signalés comme étant élevés à la fois localement et systémiquement15. Cependant, certains effets et mécanismes sous-jacents des ILC2 sur la physiopathologie et la progression de l’AR nécessitent encore une exploration plus approfondie.

CD226 - une glycoprotéine transmembranaire qui sert de molécule costimulatrice - est principalement exprimée sur les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules T et d’autres monocytes inflammatoires16,17. L’interaction de CD226 et de ses ligands (CD155 et/ou CD112) ou concurrent (TIGIT) lui permet de participer aux fonctions biologiques de diverses cellules immunitaires18. La liaison des ligands sur les cellules présentatrices d’antigènes à CD226 sur lymphocyte cytotoxique (CTL) favorise l’activation des deux cellules simultanément, tandis que l’activation de CTL peut être davantage supprimée par TIGIT (immunorécepteur des cellules T avec domaines Ig et ITIM), le concurrent de CD22619,20. Une étude ex vivo humaine a révélé que CD226 et CD155 sur les lymphocytes T régulent l’équilibre entre Th1/Th17 et Th2 en modulant différentiellement les sous-ensemblesTh 21. CD226 peut également arbitrer l’adhérence plaquettaire et l’activité de destruction tumorale NK22,23. Pendant ce temps, CD226 est bien étudié dans la pathogenèse de diverses maladies infectieuses, maladies auto-immunes et tumeurs 18,24,25. À l’heure actuelle, CD226 est devenu un nouveau point positif pour l’immunothérapie. Des études ont montré que les vésicules extracellulaires peuvent inverser l’expression de CD226 sur les cellules NK pour rétablir leur activité cytotoxique et intervenir dans la progression du cancer du poumon26. Une étude récente a révélé un sous-groupe d’ILC du groupe 3 intestinal fœtal caractérisé par une expression élevée de CD226 par séquençage d’ARN unicellulaire27, ce qui indique que CD226 pourrait exercer des rôles dans l’immunité à médiation cellulaire lymphoïde innée.

Nos connaissances sur les ILC2 dans l’inflammation des voies respiratoires sont principalement basées sur des études sur l’asthme; Cependant, on sait peu de choses sur leurs fonctions dans l’immunité de la muqueuse nasale. Ainsi, un protocole a été établi pour isoler et identifier les ILC2 de la muqueuse nasale. L’étude se concentre sur l’expression de CD226 sur les ILC2 dans les tissus nasaux et sa variation entre les souris saines et les souris AR. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents de la régulation médiée par ILC2 dans l’immunité locale et servir de base au développement de nouvelles approches pour le traitement des EI.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux Lignes directrices sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures et protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique de la recherche scientifique de la quatrième Université médicale militaire (n ° 20211008).

1. Etablissement modèle de RA murin

  1. Hébergez les souris mâles et femelles de type sauvage (WT) C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes et fournissent de l’eau et de l’eau de laboratoire standard.
  2. Émulsionner 50 μg d’ovalbumine (OVU) dans 0,2 mL de PBS stérile contenant 2 mg d’hydroxyde d’aluminium sur une table propre pour maintenir la stérilité. Les jours 0, 7 et 14, injecter par voie intrapéritonéale à des souris femelles ou mâles 50 μg d’OVULES émulsionnés.
  3. Les jours 21, 22, 23, 24 et 25, instiller par voie intranasale des souris contenant 50 μg d’OVA dissous dans 30 μL de PBS stérile (15 μL par narine) sous anesthésie par inhalation (2-3% d’isoflurane avec un débit d’oxygène ou 0,5 L / min).
  4. Euthanasier les souris 24 h après le dernier défi (jour 26).

2. Isolement des cellules mononucléées (MNC) de la muqueuse nasale

  1. Euthanasier les souris par luxation cervicale sous anesthésie profonde. Trempez la tête des souris dans de l’éthanol à 75% pendant 5 minutes et évitez que l’éthanol ne pénètre dans la narine externe. Placez l’abdomen vers le bas sur la table d’opération.
  2. Coupez les dents antérieures. À la ligne médiane de la tête, faites une incision et coupez la peau à l’aide de ciseaux.
  3. Retirez la mâchoire inférieure, coupez tout le nez le long de l’extrémité du palais et placez le mouchoir dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 5 ml de PBS glacé. À l’aide de ciseaux et de forceps, retirez la chair et les muscles adhérant aux os.
  4. Transférer le nez de la souris dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm contenant 5 ml de PBS glacé. Lavez les os deux fois avec 5 ml de PBS glacé.
  5. Transférer le nez dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  6. Écraser suffisamment et transférer le nez dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de digestion préchauffé (milieu RPMI 1640 complété par 1 mg/mL de collagénase IV et 10 U/mL de DNase I).
  7. Fixez le couvercle et placez le tube verticalement dans un agitateur orbital à 37 °C, avec agitation continue à 120-150 tr/min pendant 40 min.
    REMARQUE: Préchauffez le tampon de digestion à 37 ° C pour obtenir l’activité enzymatique la plus élevée.
  8. Ajouter 5 mL de milieu glacé RPMI 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) pour arrêter le processus de digestion.
  9. Filtrer à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour éliminer les fragments solides.
  10. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min, puis jeter délicatement le surnageant.
  11. Resuspendre la pastille dans un milieu RPMI 1640 glacé et centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Jetez délicatement le surnageant.
  12. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 4 mL de milieu à gradient de densité à 40 % (160 μL de PBS 10x + 1,44 mL de solution mère de gradient de densité + 2,4 mL de milieu RPMI 1640).
  13. Insérez délicatement une pipette Pasteur au fond du tube et ajoutez lentement 2,5 mL de milieu gradient de densité à 80 % (200 μL de 10x PBS + 1,8 mL de solution mère de gradient de densité + 0,5 mL de milieu RPMI 1640).
  14. Régler le taux d’accélération et de décélération de la centrifugeuse à un niveau inférieur au troisième rapport et la centrifugeuse à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (RT).
  15. Enlevez la couche supérieure d’impuretés avant de vider les cellules à l’interface pour éviter toute contamination potentielle. Égoutter délicatement la couche de cellules mononucléaires (MNC) à l’interface de média à gradient de densité de 40 %/80 % dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de PBS glacé à l’aide d’une pipette. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois.

3. Coloration de surface pour l’analyse des matériaux destinés à l’alimentation des producteurs

  1. Récolter les cellules et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendre la pastille de la cellule dans un tampon de coloration (PBS complété par 2% FBS et 0,1%NaN3) et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    ATTENTION : Soyez prudent lors de la préparation du tampon de coloration. Le NaN3 est très toxique et peut endommager les organes s’il est avalé, inhalé ou en contact avec la peau. Évitez également les rejets dans l’environnement.
  2. Remettez les cellules en suspension dans une solution bloquante de 80 μL (anticorps anti-CD16/32 (1:100) dilué dans un tampon de coloration) par tube. Incuber pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
  3. Sans lavage, ajouter 20 μL de la dilution appropriée du cocktail d’anticorps colorant la surface (tableau 1).
  4. Ajouter 1 μL (par test) de colorant de viabilité fixable 520 (FVD) juste avant d’ajouter le cocktail d’anticorps aux échantillons. Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Définissez les anticorps d’isotype correspondant et la fluorescence moins un (FMO) comme témoins négatifs.
  5. Laver les cellules dans 500 μL de tampon de coloration par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 200 μL de tampon de coloration. Ajouter 50 μL de billes de comptage absolu vortex aux cellules colorées et agiter. Soumettez-les à une analyse de cytométrie en flux (FCM).
    REMARQUE : Les données FCM ont été obtenues à l’aide d’un analyseur de cellules spectrales et analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux (FCM).

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Résultats

Un modèle murin induit par OVA a été développé pour explorer le rôle des ILC2 dans la RA. La construction du modèle murin AR était basée sur des études antérieures avec de légères modifications 28,29,30,31. Une vidéo de 10 minutes a été capturée pour mesurer la fréquence des éternuements et des éternuements nasaux après le dernier défi nasal. Les symptômes allergiques des souris AR induites par...

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Discussion

Les ILC2 sont étroitement associées à l’inflammation de type 2 et aux troubles inflammatoires, comme le démontrent un nombre croissant d’études. Les modèles murins et l’observation humaine contribuent à une meilleure compréhension de sa fonction dans les voies respiratoires supérieures. Dans la physiopathologie de l’asthme, les ILC2 sont activées par la lymphopoïétine stromale thymique, l’IL-25 et l’IL-33, qui sont principalement produites par les cellules épithéliales. Ensuite, reflétant les cellules Th2, les ILC2 produ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

R.Z. a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81871258) et des fonds fournis par la quatrième Université médicale militaire (n ° 2020rcfczr). Y.Z. a été soutenu par le Programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du Shaanxi (n ° 2021JM-081).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hydroxyde d’aluminiumMeilun biological Technology21645-51-2
CD11beBioscience11-0112-82Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD11cBioLegend117306Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD16/32BioLegend101302Clone : 93 ; Dilution 1:100
CD226BioLegend128812Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD3eBioLegend100306Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD45BioLegend103128Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD45ReBioscience11-0452-82Utilisé dans le coctail d’anticorps
CD90.2BD Pharmingen553014Utilisé dans l’anticorps coctail
Collagenase IVDIYIBioDY40128
CountPerles de comptage absolues lumineusesInvitrogenC36950perles de comptage absolues
Dnase figure-materials-1BeyotimeD7076
Sérum de veau fœtalgibco10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)eBioscience65-0867-14FVD
HBSS, calcium, magnésiumServicebioG4204-500
KLRG1eBioscience17-5893-81Utilisé dans le coctail d’anticorps
NaN3SIGMAS2002
Logiciel NovoExpressAgilentTechnologiesVersion 1.5.0Logiciel d’analyse de cytométrie en flux (FCM)
OVASIGMA9006-59-1
PBS, 1xServicebioG4202-500
PBS, 10xServicebioG4207-500
PercollYeasen40501ES60 média dégradé
RPMI 1640 milieux de cultureCorning10-040-CVRV
Analyseur de cellules spectralesSONYSA3800
densité

Références

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