Summary
2型炎症に関与するグループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、主に蠕虫感染、アレルギー疾患、代謝恒常性、および組織修復に応答します。この研究では、マウス鼻粘膜からILC2を分離し、CD226の発現を検出する手順が実証されています。
Abstract
ILC2は、グループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)に関する豊富な研究が長年にわたって発表されており、抗蠕虫免疫、組織修復、熱発生、喘息やアレルギー性鼻炎(AR)などの自己免疫疾患など、さまざまな病理学的プロセスの調節に関与していることが広く知られています。ILC2は、皮膚、腸、肺、鼻腔などの末梢組織に恒久的に存在します。しかしながら、鼻粘膜免疫におけるそれらの正確な機能についての情報は限られている。CD226は活性化共刺激分子であり、主にナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、および炎症性単球に発現します。しかし、ILC2がCD226を発現するのか、それともILC2s関連疾患の病因に役割を果たすのかは不明である。ここでは、鼻粘膜からILC2を単離・同定する方法を確立し、健常マウスやARマウスから得られたILC2のCD226発現を検出しました。ここでは、マウス鼻粘膜からのILC2の単離と同定のためのこのプロトコルについて説明し、鼻粘膜疾患における免疫疾患の内部病理学的メカニズムの探索に役立ちます。
Introduction
グループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、マウスの腹腔組織で最初に発見され、その後、血液および肺、皮膚、鼻腔などの他の末梢組織に存在することが実証されました1,2,3。組織常在細胞として、ILC2は主に局所的に維持および増殖し、多数の2型サイトカインを産生し、2型免疫を誘導することにより、外因性の有害な刺激に応答する最初のガードとして機能します4,5,6。ILC2は、感染した組織に向かって輸送することによってもその効果を発揮することができる7,8。
Tヘルパー2(Th2)細胞と同様に、ILC2の複雑な調節ネットワークは、気道アレルギー疾患を含むさまざまな2型炎症性疾患の進行への重要な関与を保証します8,9。喘息では、上皮細胞由来のアラームンがILC2を活性化し、インターロイキン(IL)-4、IL-5、およびIL-13の分泌を通じて肺の炎症をさらに促進します10。臨床研究では、重度の喘息患者の喀痰と血液中のILC2レベルが有意に上昇していることも示されており、ILC2と喘息の重症度および喘息進行の予測因子としてのそれらの機能との関連が示唆されています11。
アレルギー性鼻炎(AR)は、毎年何百万人もの人々が罹患する一般的な慢性炎症性疾患であり、この病気の効果的な治療法は限られています12,13。ILC2は、感作期であれ、症状発生および炎症期14であれ、ARの病態生理学において重要な役割を果たします。AR患者では、末梢血中のILC2レベルが局所的および全身的に上昇することが報告されています15。しかし、ARの病態生理学と進行に対するILC2の特定の影響と根底にあるメカニズムは、依然としてさらなる調査が必要です。
共刺激分子として機能する膜貫通糖タンパク質であるCD226は、主にナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、およびその他の炎症性単球で発現します16,17。CD226とそのリガンド(CD155および/またはCD112)または競合物質(TIGIT)の相互作用により、様々な免疫細胞の生物学的機能に関与することができる18。抗原提示細胞上のリガンドが細胞傷害性リンパ球(CTL)上のCD226に結合すると、両方の細胞の活性化が同時に促進され、CTLの活性化は、CD22619,20の競合者であるTIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)によってさらに抑制され得る。ヒトのex vivo研究では、T細胞上のCD226とCD155が、Thサブセット21を差動的に調節することにより、Th1 / Th17とTh2のバランスを調節することが明らかになりました。CD226は同様に血小板接着およびNK腫瘍殺傷活性を媒介することができる22,23。一方、CD226は、様々な感染症、自己免疫疾患、および腫瘍の病因においてよく研究されている18、24、25。現在、CD226は免疫療法の新しい明るいスポットになっています。研究によると、細胞外小胞はNK細胞上のCD226発現を逆転させて細胞傷害活性を回復させ、肺がんの進行に介入することができます26。最近の研究では、単一細胞RNAシーケンシング27によって高いCD226発現を特徴とする胎児腸グループ3ILCのサブクラスターが明らかになり、CD226が自然リンパ系細胞媒介免疫において役割を果たす可能性があることが示されました。
気道炎症におけるILC2に関する私たちの知識は、主に喘息に関する研究に基づいています。しかし、鼻粘膜免疫におけるそれらの機能についてはほとんど知られていない。したがって、鼻粘膜からILC2を分離および同定するためのプロトコルが確立されました。この研究は、鼻組織のILC2に対するCD226の発現と、健康なマウスとARマウスの間のその変動に焦点を当てています。これは、局所免疫におけるILC2を介した調節の根底にあるメカニズムへの新しい洞察を提供し、AR治療のための新しいアプローチを開発するための基礎として役立つ可能性があります。
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Protocol
すべての実験は、実験動物の世話と使用のガイドラインに従って実施されました。すべての手順とプロトコルは、第4軍事医科大学の科学研究倫理委員会(第20211008号)によって承認されました。
1. マウスARモデル確立
- 特定の病原体のない条件下で8〜12週齢のオスとメスの野生型(WT)C57BL / 6マウスを飼育し、標準的な実験用飼料と水を提供します。
- 水酸化アルミニウム2 mgを含む滅菌PBS0.2 mLに50 μgのオボアルブミン(OVA)をクリーンベンチで乳化し、無菌性を維持します。0、7、および14日目に、雌または雄のマウスにそれぞれ50μgの乳化OVAを腹腔内注射します。
- 21、22、23、24、および25日目に、吸入麻酔下で30 μLの滅菌PBS(鼻孔あたり15 μL)に溶解した50 μgのOVAをマウスに鼻腔内投与します(酸素流量または0.5 L / minの2〜3%イソフルラン)。
- 最後のチャレンジ(26日目)の24時間後にマウスを安楽死させる。
2.鼻粘膜からの単核細胞(MNC)の分離
- 深い麻酔下で頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。マウスの頭を75%エタノールに5分間浸し、エタノールが外鼻孔に入らないようにします。腹部を手術台の下に置きます。
- 前歯を切り落とします。頭の正中線を切開し、ハサミを使って皮膚を切り開きます。
- 下顎を取り除き、口蓋の端に沿って鼻全体を切り取り、5mLの氷冷PBSを含む60mmのペトリ皿に組織を置きます。はさみと鉗子を使用して、骨に付着している肉と筋肉を取り除きます。
- マウスの鼻を、5 mLの氷冷PBSを含む新しい60 mmペトリ皿に移します。5 mLの氷冷PBSで骨を2回洗います。
- 鼻を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- 鼻を十分に粉砕し、2 mLの予温した消化バッファー(1 mg / mLのコラゲナーゼIVと10 U / mLのDNase Iを添加したRPMI 1640培地)を含む15 mLチューブに移します。
- 蓋を締め、チューブを37°Cのオービタルシェーカーに垂直に置き、120〜150rpmで40分間連続攪拌します。
注:消化バッファーを37°Cに予熱して、最高の酵素活性を達成します。 - 10%ウシ胎児血清(FBS)を含む氷冷RPMI 1640培地5 mLを加えて、消化プロセスを停止します。
- 70 μmのセルストレーナーでろ過し、固体片を除去します。
- 500 x g で5分間遠心分離し、上清を静かに捨てます。
- ペレットを氷冷RPMI 1640培地に再懸濁し、500 x g で5分間遠心分離します。上清をそっと捨てます。
- 細胞ペレットを4 mLの40%密度勾配培地(160 μLの10x PBS + 1.44 mLの密度勾配培地ストック溶液+ 2.4 mLのRPMI 1640培地)に再懸濁します。
- パスツールピペットをチューブの底にそっと挿入し、2.5 mLの80%密度グラジエント培地(200 μLの10x PBS + 1.8 mLの密度グラジエント培地ストック溶液+ 0.5 mLのRPMI 1640培地)をゆっくりと加えます。
- 遠心分離機の加速と減速の速度を3速より低く設定し、室温(RT)で400 x g で15分間遠心分離機を15分間行います。
- 潜在的な汚染を避けるために、界面でセルを排出する前に不純物の最上層を除去してください。ピペットを使用して、40%/80%密度勾配培地界面の単核細胞(MNC)層を、2 mLの氷冷PBSを含む15 mLチューブに慎重に排出します。氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。
3. FCM分析のための表面染色
- 細胞を回収し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞ペレットを染色バッファー(2%FBSおよび0.1%NaN3を添加したPBS)に再懸濁し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。
注意: 染色バッファーを調製するときは注意してください。NaN3は非常に有毒であり、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると臓器に損傷を与える可能性があります。また、環境への放出は避けてください。 - 細胞をチューブあたり80 μLのブロッキング溶液(染色バッファーで希釈した抗CD16/32抗体(1:100))に再懸濁します。4°Cの暗所で30分間インキュベートします。
- 洗浄せずに、表面染色抗体カクテルの適切な希釈液を20 μL加えます(表1)。
- 抗体カクテルをサンプルに加える直前に、固定可能な生存率色素520(FVD)を1 μL(試験あたり)加えます。暗所で4°Cで30分間インキュベートします。一致するアイソタイプ抗体と蛍光マイナス1(FMO)をネガティブコントロールとして設定します。
- 500 μLの染色バッファーで細胞を500 μLの染色バッファーで洗浄し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを200 μLの染色バッファーに再懸濁します。染色した細胞に50 μLのボルテックス絶対計数ビーズを加え、撹拌します。フローサイトメトリー(FCM)分析にかけます。
注:FCMデータは、スペクトルセルアナライザーを使用して取得し、フローサイトメトリー(FCM)分析ソフトウェアで分析しました。
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Representative Results
ARにおけるILC2の役割を調べるために、OVA誘発マウスモデルが開発されました。ARマウスモデルの構築は、以前の研究に基づいており、わずかな変更を加えました28,29,30,31。最後の鼻チャレンジ後のくしゃみと鼻掻きの頻度を測定するために、10分間のビデオをキャプチャしました。OVA誘発ARマウスのアレルギー症状を図1に提示した。ARマウスの鼻こすりとくしゃみの頻度は、対照群よりも有意に高かった。
次に、マウス鼻粘膜から多国籍細胞を分離し、FCM分析を用いてその特性評価を行う手順について説明しました。約2〜3 x 106リンパ球を各マウス鼻から得た。死細胞はFVD染色により除外した。単離された細胞間のILC2のゲーティング戦略は、Lin(CD11b、CD11c、CD3、およびB220)−CD45+ CD90.2+ KLRG1+細胞でした。すべてのゲートは、アイソタイプまたはFMO制御に基づいて描画されました。典型的には、健康な対照マウスの鼻粘膜において、Lin−CD45+細胞の~2%-3%が同定された(図2)。マウス鼻粘膜におけるILC2の絶対数は2,000〜4,000です。
次に、上記の方法を用いてARマウスからILC2を単離した。HCマウスとARマウスの間でリンパ球の絶対数に差はなかった。FCMの結果は、ARマウスのILC2の割合がLin− CD45+ リンパ球の総数の9%〜14%であることを示し、健康な対照マウスと比較してAR鼻粘膜のILC2の数が著しく増加していることを示しています(図3)。
ILC2上のCD226の発現を検出しました。ILC2の51.9%が非免疫条件下でCD226を発現したのに対し、ARマウスでは平均54.8%のILC2がCD226を発現し、対照マウスと比較して有意な増加傾向が見られなかった。細胞頻度に加えて、CD226の細胞表面発現レベルも、FCM分析ソフトウェアによって自動計算された平均蛍光強度(MFI)を使用して決定されました。興味深いことに、CD226のMFIは、対照マウスと比較してARマウスで有意にアップレギュレーションされ(図4)、アレルギー性鼻粘膜のILC2に対するCD226の発現の上昇を示しています。
図1:OVA誘発マウスAR モデル。 (A)マウスARモデル確立の模式図。10分間の鼻こすり(B)とくしゃみ(C)の頻度。値は、平均値±標準偏差(SD)(n = 3)として表されます。2つのグループを比較するために、スチューデントの t検定が実行されました。 P < 0.05は統計的に有意であると考えられた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ILC2のFCMゲーティング戦略。MNCは上記のように単離された。(A)密度図は、FSC軸とSSC軸に沿った孤立した多国籍企業の分布を示しています。(B)シングレットはFSC特性に基づいてゲーティングされました。(C)Lin−細胞は、多国籍企業の骨髄系細胞、B細胞、およびT細胞を除外するために、CD11b、CD11c、CD3、およびB220陰性発現と定義されました。 死細胞は、固定可能な生存率色素(FVD)染色によって除外されました。(D)ILCはLin−CD45+によって特徴付けられる。(E)ILC2は、ILCの中でCD90.2+ KLRG1+によってゲーティングされます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:健常マウスおよびARマウスの鼻粘膜におけるILC2 。 (A)代表的なFCM画像は、健常対照(HC)およびAR群の鼻腔粘膜からのILCにおけるILC2の割合を示す。(B)HC およびARグループのLin−CD45+ 細胞におけるILC2の割合。値はSD±平均値として表されます(n = 3)。スチューデント のt検定は、2群比較のために実施した。 P < 0.05は統計的に有意であると考えられた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:鼻粘膜ILC2におけるCD226発現。ILC2は、上記の戦略を用いて特徴付けられた。ILC2上のCD226の発現をFCMを用いて評価した。(a)HC群およびAR群におけるCD226発現の代表的なヒストグラム;青色の領域は、CD226 FMO コントロールを表します。(B,C)CD226陽性ILC2の割合と、HC群およびAR群におけるCD226の平均蛍光強度(MFI)。値はSD±平均値(n = 3)として表されます。2つのグループ間の比較のために、学生のt検定を実行しました。P < 0.05は有意であると考えられた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗体 | 蛍光色素 | クローン | 希釈 |
| CD11b | フィット | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | フィット | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/シアニン7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | フィット | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | アレクサフルーア700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | フィット | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | ペ | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | ティッカー | 2F1 | 1:160 |
表1:表面染色抗体カクテル。
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Discussion
ILC2は、ますます多くの研究によって実証されているように、2型炎症および炎症性疾患と密接に関連しています。マウスモデルと人間の観察の両方が、上気道におけるその機能のより良い理解に貢献します。喘息の病態生理学では、ILC2は主に上皮細胞によって産生される胸腺間質リンパオポエチン、IL-25、およびIL-33を介して活性化されます。次に、Th2細胞をミラーリングすると、ILC2はIL-4、IL-5、およびIL-13を産生して2型炎症を悪化させます32。さらに、ILC2の異なるサブセットもIL-10およびIL-17を産生する33,34,35。ARは、2型細胞によって引き起こされる気道アレルギー性炎症の一種でもあります。AR病態生理学におけるILC2の関与が最近実証された14。しかし、ARの下でのILC2の潜在的な調節メカニズムはほとんど知られていない。
証拠は、異なるILC2間の相互作用が表面分子36に依存し得ることを示している。例えば、ILC2上に発現するICOSおよびICOSリガンドの両方が、それらの生存および機能に必要である37。さらに、ILC2はICAM-1およびLFA-1も発現し、細胞遊走および細胞間相互作用に重要な効果を及ぼします7,38。さらに、ILC2は、これらの細胞表面分子を介して他の免疫細胞とクロストークすることができます。たとえば、OX40Lは、肺炎症におけるCD4+ T細胞とILC2との間の相互作用の主要なメディエーターです39。CD226は膜貫通共刺激分子として様々な免疫細胞に発現するため、本研究では健常マウスとARマウスの鼻組織におけるILC2sでの発現も評価した。
一般的なOVA誘発ARモデリングは、腹腔内全身感作および鼻腔内局所刺激を含み、これらは通常、満足のいくモデリング結果を達成するために少なくとも3〜4週間を必要とする31。別のOVA誘発経鼻のみの送達ARモデルは、一般的なモデル法と同様の時間を取り、おおよそのレベルである2型炎症およびAR症状40を達成する。ただし、これら2つのARモデリング手法による鼻ILC2の数と機能については、まださらなる研究が必要です。AR症状を評価するためにくしゃみと鼻こすりを評価した。鼻漏の評価を含める方が説得力があるが、評価時にマウスの行動に干渉せずに鼻漏を見ることは難しいことがわかったため、残念ながらこれらの基準を除外した。さらに、くしゃみと鼻こすりの評価は、これら2つの基準のみを採用した多くの関連論文について、マウスAR症状の重症度を説明するのに十分深いかもしれません41、42、43。
マウス鼻腔ILC2sに関する以前の研究では、マウス鼻粘膜の単離が記載されている44,45。彼らのプロトコルは次のとおりです:簡単に言えば、頭蓋骨の周りの軟組織を取り除き、鼻骨を開いて鼻腔を露出させ、鉗子で頭蓋骨の表面から鼻粘膜組織をこすり落とします。単離された粘膜のほとんどはIF、IHC、またはqPCRに使用されましたが、その後の単核球(MNC)の単離およびFCM分析についてはほとんど報告されていません。本研究では、鼻粘膜に位置するILC2の量が少ないことを考慮し、鼻骨の表面から粘膜を剥がすのではなく、鼻全体を消化することにより、鼻粘膜の最大体積を保持した。消化プロトコルを最適化するために、コラゲナーゼIVの0.5 mg/mL、コラゲナーゼIVの1 mg/mL、コラゲナーゼIVの1 mg/mLと10 U/mLのDNase Iの3つの消化培地を評価し、これら3つの消化培地によって得られた生細胞の割合とリンパ球頻度を比較しました。3つの培地すべてによって獲得された生細胞の割合は差がない(90%〜95%)。しかし、最初の2種類の消化はリンパ球頻度が低く(~5%)不十分でした。したがって、1 mg / mLのコラゲナーゼIVと10 U / mLのDNase Iが本研究の消化培地として選択されました。しかしながら、コラゲナーゼに取って代わる可能性のあるリベラーゼおよびディスパーゼなどの他の酵素は研究されていない。酵素の種類と濃度は細胞の生存率と細胞表面分子の発現にとって重要であるため46,47、鼻消化中のこれらの代替品の使用と投与量は、慎重な調査と最適化が必要です。FVD eFluor 520はFITCと同等の530/30バンドパスフィルターを使用して検出できるため、Lin-細胞をゲーティングしながら死細胞を除外できるため、細胞生存率を確認しました。他の細胞生存率色素も、特異的抗体パネルによれば任意である。さらに、他のILC2関連研究で通常行われている転写因子GATA3の細胞内染色の代わりに、FCM解析においてLin(CD11b、CD11c、CD3、およびB220)、CD45、CD90.2、KLRG1などの細胞表面マーカーに基づいて本研究のILC2を特徴づけました。その中で、ILC2sに発現するKLRG1は、成熟組織ILC2sの特異的マーカーとして同定されている48,49。CD90.2はそれほど特異的ではないが、依然としてILC2関連表面マーカー50として受け入れられている。この研究では、マウスは性別によって区別されませんでした。研究によると、マウスの肺ILCの存在量と細胞表面抗原は性別が異なりますが、鼻ILC2と性別の相関関係はまだ研究する必要があります50。さらに、プロトコルは他の造血細胞の割合に焦点を当てていませんでした。さまざまなFCM抗体パネルがこの問題の解決に役立ちます。
このプロトコルは、マウス鼻粘膜からILC2を単離する方法を記載した。単離されたILC2は、FCM特性評価のために染色したり、細胞培養のために選別したり、さらなる分析のためにin vitroで刺激したりすることができます。以前の研究10、45、51の結果と一致して、ARマウスの鼻粘膜にILC2の実質的な蓄積が観察された。特に、CD226は局所ILC2に発現し、そのレベルはアレルギー状態でさらに有意に増加しました。したがって、この研究の結果は、ILC2依存性ARにおけるCD226の関与を示唆しています。AR患者のILC2がCD226を発現するかどうか、およびILC2のCD226発現がアレルギー状態で増加するかどうかは、将来の研究で調査する必要があります。
結論として、鼻粘膜からILC2を単離・同定するプロトコルを確立し、その中の接着分子の発現を検出した。プロトコルにはさらに最適化が必要です。ただし、リンパ球、特に鼻粘膜の自然リンパ球を単離および特徴付ける手順を体系的かつ詳細に説明する研究がないため、このプロトコルは、局所的な鼻免疫環境を探索する研究者にとって予備的な参考資料となっています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
R.Z.は、中国国家自然科学財団(第81871258号)と第4軍事医科大学(No.2020rcfczr)から提供された資金によって支援されました。Y.Z.は、陝西省自然科学基礎研究プログラム(No. 2021JM-081)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
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