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Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

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DOI :

10.3791/63574

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31 mai 2022

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1Department of Neuropharmacology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine, University of Yamanashi, 2GLIA Center, University of Yamanashi

Dans cet article

Résumé

Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.

Résumé

Les microglies sont la population spécialisée de cellules de type macrophage du cerveau. Ils jouent un rôle essentiel dans les fonctions cérébrales physiologiques et pathologiques. La plupart de notre compréhension actuelle de la microglie est basée sur des expériences réalisées sur la souris. La microglie humaine diffère de la microglie de souris, et donc la réponse et les caractéristiques de la microglie de souris peuvent ne pas toujours représenter celles de la microglie humaine. En outre, en raison de difficultés éthiques et techniques, la recherche sur la microglie humaine est limitée au système de culture in vitro , qui ne capitule pas in vivo sur les caractéristiques de la microglie. Pour surmonter ces problèmes, une méthode simplifiée de transplantation non invasive de microglie humaine dérivée de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale en combinaison avec l’épuisement pharmacologique de la microglie endogène à l’aide d’un antagoniste du récepteur du facteur 1 stimulant les colonies (CSF1R) est développée. Ce protocole fournit un moyen de transplanter de manière non invasive des cellules dans le cerveau de la souris et peut donc être utile pour évaluer le rôle in vivo de la microglie humaine dans les fonctions cérébrales physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les microglies sont une population spécialisée de cellules de type macrophage dans le système nerveux central (SNC) et jouent un rôle essentiel dans le contrôle de diverses fonctions cérébrales comme le développement de circuits neuronaux, la modulation de la neurotransmission et le maintien de l’homéostasie cérébrale 1,2,3. Bien que les microglies murines partagent de nombreuses fonctions avec celles des humains, elles présentent des différences spécifiques à l’espèce. Ainsi, la réponse de la microglie de souris à divers stimuli peut ne pas toujours représenter celle de la microglie humaine 4,5,6. Bien que de nombreuses études aient analysé la microglie humaine, ces expériences se limitent à des études in vitro. Les microglies humaines cultivées in vitro présentent des caractéristiques morphologiques et une expression génique très différentes de celles in vivo. Ainsi, les expériences in vitro ne capitulent pas toujours les caractéristiques in vivo de la microglie humaine. Par conséquent, un système expérimental pour étudier la microglie humaine in vivo est nécessaire.

Récemment, pour étudier les caractéristiques in vivo de la microglie humaine, des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) générées in vitro - ou des microglies humaines dérivées de cellules souches embryonnaires sont transplantées chirurgicalement dans le cerveaude souris 7,8,9,10,11,12,13,14. En utilisant cette approche, diverses caractéristiques in vivo de la microglie humaine ont été caractérisées. Cependant, l’utilisation généralisée de cette méthode est limitée pour deux raisons. Le premier est l’exigence des souris immunodéficientes. Ainsi, pour étudier le rôle de la microglie humaine dans diverses maladies neurodégénératives, les souris porteuses de mutations de la maladie doivent être croisées avec des souris immunodéficientes, ce qui nécessite beaucoup de temps et d’efforts. En outre, dans divers troubles neurologiques, les cellules immunitaires périphériques, comme les cellules T, peuvent moduler les fonctions microgliales 15,16,17. Par conséquent, les expériences réalisées sur des souris immunodéficientes peuvent ne pas représenter les caractéristiques de bonne foi de la microglie humaine in vivo. Deuxièmement, les chirurgies invasives pour transplanter la microglie nécessitent un équipement et une formation supplémentaires. De plus, une lésion cérébrale au cours d’une transplantation invasive peut modifier les phénotypes microgliaux.

Dans ce protocole, la transplantation transnasale non invasive (Tsn) d’iPSMG chez des souris immunocompétentes de type sauvage est décrite18. En combinant l’ON/OFF pharmacologique d’un antagoniste du LCR1R PLX5622 qui épuise la microglie endogène de la souris19 et Tsn, iPSMG peut être transplanté de manière non invasive dans le cerveau de la souris. De plus, avec l’application de cytokines humaines exogènes, l’iPSMG transplanté reste viable pendant 60 jours d’une manière spécifique à la région sans aucun immunosuppresseur.

Protocole

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été obtenus, logés, soignés et utilisés conformément aux « Principes directeurs pour le soin et l’utilisation des animaux dans le domaine des sciences physiologiques » publiés par la Société physiologique du Japon20, et avec l’approbation préalable du Comité des soins aux animaux de l’Université de Yamanashi (Yamanashi, Japon).

1. Préparation du milieu cellulaire, du milieu de transplantation et du mélange d’anesthésie

  1. Préparer le milieu cellulaire en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin et 0,1 % de pénicilline/streptomycine dans le DMEM.
  2. Préparer le milieu de transplantation en ajoutant hCSF1 (250 ng/mL) et hTGF-β1 (100 ng/mL) au milieu cellulaire.
  3. Préparer le mélange d’anesthésie pour injection intrapéritonéale en mélangeant 0,45 mL de chlorhydrate de médétomidine, 1,2 mL de midazolam et 1,5 mL de tartrate de butorphanol dans 11,8 mL de solution saline normale.

2. Préparation de l’iPSMG

REMARQUE : Les iPSMG congelés (Table des matières) ont été conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation.

  1. Décongelez rapidement les cellules congelées dans un bain-marie à 37 °C. Faites tourbillonner les échantillons jusqu’à ce que toute la glace visible ait fondu.
  2. Ajouter l’iPSMG décongelé au milieu de culture chauffé à 37 °C. Ajouter 1 mL de cellules décongelées contenant un milieu (1 × 106 cellules) à 10 mL du milieu de culture.
  3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille de cellule.
  4. Après centrifugation, retirer tout surnageant sans perturber la pastille cellulaire. L’élimination complète du surnageant est souhaitable pour réduire la dilution de la concentration de cytokines dans le milieu de transplantation.
  5. Ajouter le milieu de transplantation pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 105 cellules/μL.
  6. Placez l’iPSMG sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation.
    REMARQUE: La préparation de l’iPSMG pour la transplantation est effectuée sur un banc propre pour éviter toute contamination.

3. Préparation de la souris pour la transplantation transnasale (Tsn)

  1. Nourrissez les souris mâles de type sauvage (C57BL/6J, âgées de 8 semaines) avec un régime alimentaire contenant du PLX5622 pendant 7 jours.
  2. À la fin du 7e jour, cessez le régime PLX et nourrissez les souris avec un régime normal jusqu’à la fin de l’étude.
    REMARQUE: PLX5622 contenant un régime alimentaire est préparé en ajoutant 1,2 g de PLX5622 dans 1 kg d’AIN-93G (Table des matériaux).

4. Transplantation transnasale de cellules

  1. 24 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, peser les souris et les anesthésier à l’aide d’une injection intrapéritonéale du mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g).
  2. Une fois que les souris sont complètement anesthésiées selon l’évaluation par l’absence de réponse au réflexe de retrait de la pédale (pincement ferme des orteils), administrer 2,5 μL de hyaluronidase dans le PBS (100 U / mL) à 1 h avant Tsn d’iPSMG à chaque narine deux fois en utilisant une pointe de pipette de 10 μL pour augmenter la perméabilité de la muqueuse nasale.
  3. Après l’application de hyaluronidase, placez les souris en position couchée.
  4. Répétez l’étape 4.2 10 min avant la transplantation transnasale d’iPSMG.
  5. Appliquer 2,5 μL de suspension cellulaire dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL.
  6. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant l’administration de la suspension cellulaire à l’autre narine.
  7. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal.
  8. Placez la souris en position couchée sur un coussin chauffant à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit remise de l’anesthésie.
  9. À 48 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, répétez à nouveau les étapes 4.1 à 4.7 sur les mêmes souris.
    REMARQUE: Il convient de noter que les iPSMG sont placés sur la glace pendant la transplantation.

5. Application des cytokines

  1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g).
  2. Appliquer 2,5 μL du milieu de transplantation dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL.
  3. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant d’administrer le milieu de transplantation à l’autre narine.
  4. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal.
    REMARQUE: Il convient de noter que l’administration transnasale de milieu de transplantation (cytokines humaines) est nécessaire toutes les 12 heures pour la viabilité de l’iPSMG transplanté jusqu’à la fin de l’étude.

Résultats

Cette technique permet à l’investigateur de transplanter de manière non invasive iPSMG dans l’hippocampe et le cervelet, mais pas dans le cortex du cerveau de la souris. Après avoir terminé l’étude, des souris anesthésiées ont été soumises à une perfusion transcardique de PBS(−) glacé, suivie de paraformaldéhyde glacé à 4% (p / v) dans le PBS. Les cerveaux ont été isolés, postfixés pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % (p/v) et cryoprotégés dans un PBS contenant 30 % (p/v) de saccharose. De plus, les cerveaux ont été congelés dans un composé d’incorporation et sectionnés (sections coronales de 20 μm d’épaisseur) sur un cryostat. Les sections ont été lavées trois fois dans du PBS(−) (10 min chacune) et perméabilisées et bloquées avec 0,5% (v/v) de Triton X-100 dans du sérum de chèvre normal à 10% pendant 1 h. Les sections ont ensuite été incubées avec un marqueur de cytoplasme anti-spécifique à l’homme, STEM121 (1:100), et anti Iba1 (1:1000) pendant 5 jours. Ensuite, les sections ont été lavées trois fois avec du PBS(−) pendant 10 minutes chacune et ont été incubées avec des anticorps secondaires : Alexa Fluor 488-, ou souris conjuguée 546, ou IgG de lapin (1:1000) pendant 2 h à température ambiante. Après avoir lavé trois fois avec PBS(-), les sections ont été montées sur des glissières à l’aide d’un support de montage antifade. Un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif 40x a été utilisé pour acquérir des images de fluorescence. La viabilité de l’iPSMG à 2 mois après la transplantation dans l’hippocampe et le cortex est montrée à la figure 1. Le nombre de cellules transplantées peut être déterminé en comptant les cellules qui sont positives à la fois pour les anticorps spécifiques à l’homme et les marqueurs pan-microgliaux/monocytaires, tandis que les microglies endogènes de souris ne sont positives que pour les marqueurs pan-microgliaux/monocytaires, comme décrit précédemment18. Les iPSMG transplantés remplacent les microglies de souris, montrent des morphologies ramifiées dans l’hippocampe et ne sont pas détectés dans le cortex18.

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Figure 1 : Viabilité de l’iPSMG dans le cortex et l’hippocampe 2 mois après Tsn. Le panneau de gauche montre l’immunocoloration avec un marqueur pan-microglial/monocytaire, Iba1 (vert). Le panneau du milieu montre l’immunocoloration avec le marqueur de cytoplasme spécifique à l’homme STEM121 (rouge). Le panneau de droite montre une image fusionnée de l’immunocoloration Iba1 et STEM121. (A) Chez les souris témoins, seules des microglies de souris (Iba1+/STEM121-) ont été détectées dans le cortex et l’hippocampe. (B) Chez les souris transplantées iPSMG, dans le cortex, seules des microglies de souris (Iba1+/STEM121-) ont été détectées, tandis que dans l’hippocampe, des iPSMG (Iba1+/STEM121+) ont été détectées. Les flèches de l’image montrent la microglie de la souris, tandis que les pointes de flèche montrent iPSMG. Un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif 40x a été utilisé pour l’acquisition d’images en fluorescence. Taille maximale de l’image : 1024 x 1024 pixels. Facteur de zoom: 2. Barres d’échelle = 50 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici la transplantation non invasive d’iPSMG dans le cerveau de la souris. La particularité du protocole actuel est qu’en combinant les méthodes pharmacologiques PLX ON/OFF et la transplantation intranasale, l’iPSMG peut être transplanté de manière non invasive dans le cerveau immunocompétent de la souris. L’iPSMG transplanté a formé la majorité des microglies dans l’hippocampe et le cervelet en occupant la niche vacante jusqu’à 60 jours, mais pas dans le cortex.

Les points critiques pour le Tsn efficace de l’iPSMG sont (i) l’efficacité de l’épuisement de la microglie endogène de souris (ii) l’administration de cytokines humaines toutes les 12 h. Les microglies maintiennent leur propre territoire dans le cerveau. L’épuisement efficace de la microglie de souris est nécessaire pour fournir une niche pour la greffe d’iPSMG transplanté. Lorsque l’épuisement de la microglie endogène de la souris est insuffisant, la colonisation de l’hippocampe et du cervelet de la souris par iPSMG n’est pas observée. La viabilité de la microglie dépend de la signalisation CSF1R et TGFBR 19,21,22. hCSF1 est signalé pour augmenter sélectivement la viabilité de la microglie humaine, et hTGF-β1 est nécessaire pour la viabilité de la microglie ainsi que pour amortir l’inflammation lorsqu’il est administré toutes les 12 h 21,23,24. En l’absence de cytokines humaines exogènes, les iPSMG ne sont pas observés dans le cerveau de souris. En outre, il faut veiller à ne pas activer mécaniquement l’iPSMG par pipetage excessif ou par tout autre moyen avant Tsn, car il modifie irrévocablement les caractéristiques de l’iPSMG ainsi que l’efficacité de la transplantation. Si le Tsn satisfaisant de l’iPSMG n’est pas observé, la viabilité de l’iPSMG avant la transplantation ainsi que l’épuisement de la microglie endogène doivent être déterminés. Si l’épuisement de la microglie endogène de la souris ne dépasse pas 90%, le temps d’alimentation PLX5622 peut être modifié pour augmenter l’épuisement.

Par rapport à une méthode de transplantation chirurgicale conventionnelle qui est invasive et nécessite un équipement et une formation supplémentaires, Tsn permet la transplantation de manière non invasive, simple, stable et facile. De plus, cette méthode permet la transplantation d’iPSMG dans des cerveaux de souris immunocompétentes; ainsi, des souris modèles de maladie immunocompétentes peuvent être utilisées pour étudier la réponse de l’iPSMG.

Le plus grand inconvénient de la méthode actuelle est l’hétérogénéité régionale dans la greffe d’iPSMG. Si la transplantation d’iPSMG spécifique à la région du cerveau est nécessaire, le protocole actuel ne convient pas car l’iPSMG transplanté reste greffé pendant 60 jours uniquement dans l’hippocampe et le cervelet, mais pas dans le cortex. En outre, la nécessité d’administrer des cytokines humaines exogènes par voie intranasale toutes les 12 heures est également une limitation du protocole actuel car il nécessite un travail important et coûte cher.

En conclusion, un protocole détaillé pour Tsn d’iPSMG dans le cerveau de souris immunocompétentes est fourni. Lorsqu’il est combiné avec l’ON/OFF pharmacologique de la microglie de souris par PLX5622, ce protocole permet une greffe réussie d’iPSMG. Comme les cellules transplantées peuvent être observées dans l’hippocampe et le cervelet pendant une période prolongée lorsque des cytokines exogènes sont appliquées, la méthode actuelle peut être utile pour évaluer le rôle de la microglie humaine dans les états physiologiques et pathologiques dans ces régions.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Sponsors de la subvention : Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), la Mitsubishi Science Foundation (SK), la Takeda Science Foundation (SK) et une subvention Frontier Brain Science de l’Université de Yamanashi (SK).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific10566
AIN 93GOriental Yeast Co
Anticorps anti-Iba1FUJIFILM019&ndash ; 19741
Anticorps anti-STEM121Takara BioscienceY40410
Tartrate de butorphanolKyoritsu Seiyaku8019
Microscope confocalOlympusFV1200
Sérum fœtal bovinGE Healthcare Life SciencesSH30070.03
Frozen iPSMGShionogi & Co., LtdLaboratoire pour Découverte de médicaments et recherche sur les maladies
Facteur de stimulation des colonies humaines 1 (hCSF1)PeproTech300-25
HyaluronidaseSigma-AldrichH-3506
Chlorhydrate de médétomidineMeiji SeikaVETLI5
MidazolamAstellas18005A2
ParaformaldéhydeWako Pure Chemical Industries162-16065
Pénicilline/streptomycineThermo Fisher Scientific15140-122
PipetteEppendorf3120000011
Pointe de pipetteEppendorf30076028
PLX5622Amadis ChemicalA930097
Facteur de croissance transformant-&beta ; 1 (Tgf-b1)PeproTech100-21
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
VECTA SHIELD Hard Set Montage MediumVector LaboratoriesH-1400-10antifade Montage Medium

Références

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