Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Di Wu; Mengfan He; Dawei Li

doi:10.3791/63602

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Article de méthode

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

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DOI :

10.3791/63602

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21 mars 2022

Di Wu¹ , Mengfan He¹ , Dawei Li¹

¹Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.

Résumé

L’ubiquitination est un type de modification post-traductionnelle qui régule non seulement la stabilité, mais aussi la localisation et la fonction d’une protéine substrat. Le processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule presque tous les processus biologiques cellulaires de base. La purification des protéines ubiquitinées aide à étudier le rôle de l’ubiquitination dans le contrôle de la fonction des protéines substrat. Ici, une procédure étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères est décrite avec la protéine suppresseur de tumeur p53 à titre d’exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation. La protéine p53 totale marquée au drapeau cellulaire a été purifiée avec de l’agarose conjuguée à l’anticorps anti-drapeau dans des conditions non dénaturantes. Alternativement, la protéine ubiquitinée totale marquée His cellulaire a été purifiée à l’aide de résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation. Les protéines p53 ubiquitinées dans les éluats ont été détectées avec succès avec des anticorps spécifiques. En utilisant cette procédure, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique.

Introduction

L’ubiquitine est une protéine conservée au cours de l’évolution de 76 acides aminés ^1,2,3. L’ubiquitine se lie de manière covalente aux résidus de lysine sur les protéines cibles par des cascades impliquant des enzymes activatrices (E1), conjuguées (E2) et ligases (E3). L’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée aux enzymes conjuguées E2. Par la suite, E3 ubiquitin ligases interagit à la fois avec les enzymes E2 chargées d’ubiquitine et les protéines de substrat et médie la formation d’une liaison isopeptidique entre le C-terminal de l’ubiquitine et un ....