Summary
Infeksjonen av Caenorhabditis elegans av den mikrosporidiske parasitten Nematocida parisii gjør det mulig for ormene å produsere avkom som er svært motstandsdyktige mot samme patogen. Dette er et eksempel på arvelig immunitet, et dårlig forstått epigenetisk fenomen. Den nåværende protokollen beskriver studiet av arvelig immunitet i en genetisk gjennomførbar ormmodell.
Abstract
Arvelig immunitet beskriver hvordan noen dyr kan overføre "minnet" av en tidligere infeksjon til sine avkom. Dette kan øke patogenresistensen i avkommet og fremme overlevelse. Mens arvet immunitet har blitt rapportert i mange hvirvelløse dyr, er mekanismene som ligger til grunn for dette epigenetiske fenomenet i stor grad ukjente. Infeksjonen av Caenorhabditis elegans av det naturlige mikrosporidiske patogenet Nematocida parisii resulterer i ormer som produserer avkom som er robust motstandsdyktige mot mikrosporidi. Den nåværende protokollen beskriver studiet av intergenerasjonell immunitet i den enkle og genetisk gjennomførbare N. parisii -C. elegans infeksjonsmodellen . Den nåværende artikkelen beskriver metoder for å infisere C. elegans og generere immunprimert avkom. Det gis også metoder for å analyse av resistens mot mikrosporidiainfeksjon ved farging for mikrosporidi og visualisering av infeksjon ved mikroskopi. Spesielt forhindrer arvelig immunitet vertscelleinvasjon ved mikrosporidia, og fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan brukes til å kvantifisere invasjonshendelser. Den relative mengden mikrosporidisporer produsert i immunprimerte avkom kan kvantifiseres ved å farge sporer med et chitinbindende fargestoff. Til dags dato har disse metodene kastet lys over kinetikk og patogen spesifisitet av arvelig immunitet, samt de molekylære mekanismene som ligger til grunn for den. Disse teknikkene, sammen med de omfattende verktøyene som er tilgjengelige for C. elegans forskning, vil muliggjøre viktige funn innen arvelig immunitet.
Introduction
Arvelig immunitet er et epigenetisk fenomen der foreldreeksponering for patogener kan muliggjøre produksjon av infeksjonsresistente avkom. Denne typen immunminne har blitt vist i mange hvirvelløse dyr som mangler adaptive immunsystemer og kan beskytte mot viral, bakteriell og soppsykdom1. Mens arvet immunitet har viktige implikasjoner for å forstå både helse og evolusjon, er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for denne beskyttelsen i stor grad ukjente. Dette skyldes blant annet at mange av dyrene der arvet immunitet er beskrevet, ikke er etablerte modellorganismer for forskning. I motsetning drar studier i den gjennomsiktige nematoden Caenorhabditis elegans nytte av et omfattende genetisk og biokjemisk verktøysett 2,3, et svært kommentert genom 4,5 og en kort generasjons tid. Faktisk har forskning i C. elegans gjort det mulig med grunnleggende fremskritt innen epigenetikk og medfødt immunitet 6,7, og det er nå en etablert modell for å studere immunminne 8,9.
Mikrosporidi er sopppatogener som smitter nesten alle dyr og forårsaker dødelige infeksjoner hos immunkompromitterte mennesker10. Infeksjon begynner når en mikrosporidiaspor injiserer eller "avfyrer" sitt cellulære innhold (sporoplasma) i en vertscelle ved hjelp av en struktur som kalles et polarrør. Intracellulær replikasjon av parasitten resulterer i dannelse av meronts, som til slutt skiller seg ut i modne sporer som kan gå ut av cellen11,12. Selv om disse parasittene er skadelige for både menneskers helse og matsikkerhet, er det mye som fortsatt lærer om deres infeksjonsbiologi12. Nematocida parisii er en naturlig mikrosporidisk parasitt som utelukkende replikerer i tarmcellene av ormer, noe som resulterer i redusert fecundity og til slutt død. N. parisii -C. elegans infeksjonsmodell har blitt brukt til å vise: (1) rollen som autofagi i patogen clearance13, (2) hvordan mikrosporidia kan gå ut av infiserte celler ikke-lytisk14, (3) hvordan patogener kan spre seg fra celle til celle ved å danne syncytia15, (4) proteinene N. parisii bruker for å kommunisere med verten16, og (5) reguleringen av transkripsjonell intracellulær patogenrespons (IPR) 17, 18.
Protokoller for infeksjon av C. elegans er beskrevet i det nåværende arbeidet og kan brukes til å avsløre den unike mikrosporidiabiologien og dissekere vertens respons på infeksjon. Mikroskopien av faste ormer farget med det chitinbindende fargestoffet Direct Yellow 96 (DY96) viser infeksjonsspredningen av chitinholdige mikrosporidiasporer gjennom tarmen. DY96 farging muliggjør også visualisering av chitinholdige ormeembryoer for samtidig vurdering av orm gravidity (evne til å produsere embryoer) som en avlesning av verts fitness.
Nyere arbeid har avslørt at C. elegans smittet med N. parisii produserer avkom som er robust motstandsdyktige mot samme infeksjon19. Denne arvelige immuniteten varer en enkelt generasjon og er doseavhengig, da avkom fra mer tungt infiserte foreldre er mer motstandsdyktige mot mikrosporidi. Interessant nok er N. parisii-primed avkom også mer motstandsdyktige mot bakteriell tarmpatogen Pseudomonas aeruginosa, selv om de ikke er beskyttet mot det naturlige patogenet Orsay virus19. Det nåværende arbeidet viser også at immunprimede avkom begrenser vertscelleinvasjon av mikrosporidia. Metoden beskriver også samlingen av immunprimerte avkom og hvordan FISK kan brukes til å oppdage N. parisii RNA i tarmceller for å analyse vertscelleinvasjon og spore avfyring20.
Sammen gir disse protokollene et solid grunnlag for å studere mikrosporidi og arvet immunitet i C. elegans. Det er håpet at fremtidig arbeid i dette modellsystemet vil muliggjøre viktige funn innen det gryende feltet arvelig immunitet. Disse teknikkene vil sannsynligvis også være utgangspunkt for å undersøke mikrosporidiaindusert arvelig immunitet i andre vertsorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende studien bruker wild-type C. elegans Bristol stamme N2 vokst ved 21 °C.
1. Utarbeidelse av medier
- Klargjør M9-medier i henhold til forrige rapport21,22.
- Forbered nematodevekstmedium (NGM) i henhold til forrige rapport21,22. Hell 12 ml NGM per 6 cm plate eller 30 ml per 10 cm plate.
- Forbered Escherichia coli-stammen OP50-1 i henhold til en tidligere rapport23.
- Forbered OP50-1-seeded NGM-plater ved å følge trinnene nedenfor.
- Resuspend 10x konsentrert OP50-1 ved virveling.
- Bruk en repeaterpipette til å frø platene i midten. For 6 cm og 10 cm plater, frø med et volum på henholdsvis 200 μL eller 500 μL.
- For 10 cm plater, bruk en glassspreder for å spre OP50-1 og lage en plen av bakterier. Ikke spre bakteriene til selve kanten av platen.
MERK: Etanol dypper og flammer sprederen hver femte plate for å sikre sterilitet. La sprederen avkjøles i noen sekunder før du sprer deg for å forhindre å drepe bakterier. - La platene stå ved romtemperatur i 2 dager for å tørke og for å sikre veksten av bakteriell plen.
MERK: Frøplater kan oppbevares ved romtemperatur i 2-3 uker eller ved 4 °C i opptil 1 måned.
2. Vedlikehold av C. elegans
- Oppretthold ormer på en konstant bakteriell matkilde på OP50-1-frøet NGM-plater.
MERK: Sult kan resultere i intergenerasjonelle fenotyper, noe som kan påvirke resultatene. En 10 cm OP50-1-frøplate støtter 2500 L1 (det tidligste larvetrinnet av C. elegans) i opptil 72 timer. - Hvis ormene sulter, vokse i tre generasjoner på OP50-1 før du bruker ormene til eksperimenter.
3. Synkronisering av C. eleganspopulasjoner ved bruk av natriumhypokloritt (bleking)
MERK: Dette trinnet er veldig tidssensitivt, så sørg for at sentrifugen er tilgjengelig før du begynner. Alternative, mindre raske blekingsprotokoller er tilgjengelige i litteraturen og kan brukes hvis ønskelig. For å forhindre at 6% natriumhypokloritt mister aktivitet over tid, oppbevar reagenset i mørket ved 4 °C og hold det i opptil 1 år.
- Forbered 2 ml blekemiddeloppløsning for hver prøve ved å blande 400 μL 1 M NaOH, 250 μL 6% natriumhypokloritt (se Materialtabell) og 1350 μL destillert vann.
- Vask voksne ormer (~ 72 h etterluke) av platene i et mikrosenterrør ved hjelp av 1 ml M9-medier.
MERK: Hvis mange ormer forblir på platene, pellet ormene ved sentrifugering ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur, fjern supernatanten ved hjelp av en 1 ml pipettespiss og utfør ekstra platevask. - Sentrifuge ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet ormene, vask deretter 2x med 1 ml M9-medier for å fjerne bakterier.
- Fjern supernatanten, tilsett 1 ml av den tilberedte blekemiddelløsningen (trinn 3.1.), og still inn en timer i 1 min. Snu rørene 3-4x.
MERK: Under et lysmikroskop kan ormene ses for å stoppe bankingen. - Etter 1 min, sentrifuge på 3000 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet ormene, fjern deretter supernatanten og tilsett 1 ml fersk blekemiddeloppløsning.
- Overvåk røret(e) tett under et lysmikroskop for å visualisere ormekroppene som splitter opp og frigjør embryoer. Gå umiddelbart videre til neste trinn når ~ 50% -80% av slaktkroppen har delt seg åpen og mange embryoer har blitt utgitt.
MERK: Avhengig av antall dyr og ormstammen, kan dette trinnet ta 15 s til 4 min. Av ukjente grunner tar N. parisii-infiserte ormer ofte lengre tid å bleke enn uinfiserte dyr. - Sentrifuge ved 3000 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet embryoene, og vask deretter 3x i 1 ml M9-medier.
MERK: Vasker fortynner den gjenværende hypoklorittløsningen fra rørene og må utføres raskt for å sikre at blekemiddelløsningen ikke skader embryoene. - Tilsett 1 ml M9-medier til den endelige pelletsen og overfør til et 15 ml konisk rør som inneholder 4 ml M9-medier. Suspender embryoene i et sluttvolum på 5 ml.
- Snurr rørene på en mekanisk rotor (se Materialtabellen) ved 21 °C i 18-24 timer for å klekke embryoene inn i L1-er.
MERK: Ettersom N. parisii infiserer orme tarmen og ikke invaderer bakterien, smittede foreldre ikke overføre infeksjonen til deres avkom ved vertikal overføring19. Bleking av smittede voksne synkroniserer F1 dyr og ødelegger N. parisii sporer, og sikrer at F1 avkom ikke er smittet av sporer som overføres fra foreldrene. - Sentrifuger rørene i 1 min ved 1800 x g ved romtemperatur for å pelletsE L1-ene, og kast alle unntatt 1 ml av supernatanten.
- Pipette 1-5 μL L-blanding på en usett NGM-plate, og teller umiddelbart antall L1-er i dråpen ved å visualisere under et lysmikroskop. Gjenta 3x og gjennomsnitt teller for å bestemme konsentrasjonen og totalt antall L1s.
MERK: De fleste embryoene skal klekkes ut, og L1-ene skal bevege seg raskt i væskedråpen. Hvis en stor andel av unhatched embryoer og sløv (saktegående) L1s forblir, indikerer dette bleking for lenge.
4. Forberedelse av N. parisii sporer
- Forbered N. parisii sporer etter tidligere publiserte referanser19,24.
5. Infeksjon av C. elegans med N. parisii for å gi immunprimert avkom
- En dag før planlagte infeksjoner, flytt det nødvendige antallet 10 cm usette NGM-plater fra 4 °C til romtemperatur.
- Umiddelbart før infeksjon synkroniserte sentrifuge ~ 2500 L1 ormer ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur i et mikrocentrifugerør for å pellet ormene. Fjern supernatant med en pipettespiss for å la ormer ligge i ~50 μL M9-medier.
- Tilsett 1 ml 10x OP50-1 til L1- og N. parisii-sporene til ønsket konsentrasjon (vanligvis ~ 2,5 millioner sporer). Som en uinfected kontroll, forberede et tilsvarende rør av L1s og OP50-1 med et volum på M9 media tilsvarende volumet av spore forberedelse som brukes.
MERK: For å få immunprimert avkom, bruk en sporedose høy nok slik at >90% av dyrene blir smittet med 72 timer (målt ved DY96 farging, trinn 7), men lavt nok slik at >80% av dyrene fortsatt er gravid. Dette sikrer at de fleste avkom kommer fra smittede foreldre, og at bleking av foreldrene gir tilstrekkelige embryoer til F1-testing. Selv om sporpreparatene varierer i konsentrasjon og infektivitet, er en passende foreldredose vanligvis mellom 5-15 μL sporepreparat (~ 2,5 millioner sporer) per 10 cm plate. - Virvel kort for å blande og plate de ovennevnte 1 ml ormer på en 10 cm usett NGM-plate. Virvle for å sikre at væsken sprer seg over hele platen.
- Tørk platene i et rent skap med lokkene av i 10-20 min eller til de er helt tørre, før du inkuberer ved 21 °C i 72 timer.
- Ved 72 timers postinfeksjon (hpi) vasker du ormene av platene i et mikrocentrifugerør ved hjelp av 1 ml M9-medier. Hvis mange ormer forblir på platene, pellet ormene ved sentrifugering ved 1400 x g i 30 s, fjern supernatanten og utfør ekstra platevask.
- Sentrifuge ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur til pellet ormer, vask 2x med 1 ml M9-medier eller til supernatanten er klar. Resuspend i et endelig volum på 1 ml M9-medier.
- Pipette opp og ned for å blande, og overfør deretter 100 μL av de suspenderte ormene til et friskt rør.
MERK: Denne prøven på ~ 250 voksne kan senere fikses og farges for å bestemme foreldreorm fitness og infeksjonsstatus, som beskrevet i trinn 7 og begynnelsen av trinn 3. - For å bryte opp de voksne ormene og frigjøre F1 embryoer for testing, bleke de resterende 900 μL suspenderte ormer, som beskrevet i trinn 3.
MERK: Dette trinnet ødelegger også alle N. parisii-sporer før påfølgende infeksjonsanalyser.
6. Testing arvet immunitet mot N. parisii i C. elegans
- Utfør infeksjoner som beskrevet i trinn 5.1.-5.6., med modifikasjoner som nevnt nedenfor.
MERK: Infeksjonsanalyser på F1-er kan skaleres ned og utføres på 6 cm NGM-plater ved hjelp av ~1000 L1 ormer og 400 μL 10x OP50-1. En "høy" dose sporer må også brukes, slik at ~ 100% av naive F1s (dvs. ormer fra uinfiserte foreldre) er smittet, og bare ~ 10% av naive F1-er er gravid. Selv om sporpreparatene varierer i konsentrasjon og infektivitet, er en passende dose vanligvis mellom 5-15 μL (~ 2,5 millioner sporer) per 6 cm plate. - Ved 72 hk, fest og flekk for å bestemme orm fitness og infeksjon status, som beskrevet i trinn 7.
7. DY96 farging av C. elegans for å visualisere embryoer og mikrosporidia sporer
MERK: DY96 er et grønt fluorescerende chitinbindende fargestoff som flekker ormeembryoer og mikrosporidiasporvegger 19,15,25. Dette tillater samtidig overvåking av ormenes kondisjons- og infeksjonsstatus.
- Vask ormene av platene i et mikrocentrifugerør ved hjelp av 1 ml M9-medier som inneholder 0,1% Tween-20. Hvis mange ormer forblir på platene, pellet ormene ved sentrifugering ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur, fjern supernatanten ved hjelp av en pipettespiss og utfør ekstra platevask.
- Sentrifuge ved 1400 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet ormene, og vask 2x med 1 ml M9-medier som inneholder 0,1% Tween-20 eller til supernatanten er klar.
- Fjern supernatanten, tilsett 700 μL aceton og la ormene festes ved romtemperatur i 10 minutter.
MERK: På dette tidspunktet kan ormene lagres ved -20 °C for behandling opptil flere måneder senere, om ønskelig. - Sentrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet de faste ormene, og vask 2x med 1 ml PBS som inneholder 0,1% Tween-20 (PBST).
- Forbered 50 ml DY96 arbeidsløsning: PBST, 0,1 % (v/v) natrium dodecylsulfat (SDS) og 20 μg/ml DY96 (fra en 5 mg/ml lageroppløsning i destillert vann) (se Materialtabellen). Vikle røret i folie og oppbevar det i en skuff for å forhindre eksponering for lys.
MERK: DY96 lager- og arbeidsløsninger kan lagres i >1 år ved romtemperatur hvis de holdes i mørket. - Sentrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet ormene og fjerne supernatant. Tilsett 500 μL DY96 arbeidsløsning i pelletsen og roter i 30 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved romtemperatur for å pellet ormene. Fjern supernatanten og tilsett 15 μL av monteringsmediet med/uten DAPI (se Materialliste).
- Pipette 10 μL av løsningen som inneholder fargede ormer på et mikroskop, skyver og legger en deksle over toppen.
MERK: Lysbilder og ekstra prøver kan oppbevares ved 4 °C i mørket for langvarig lagring.
8. Avbildning og analyse av DY96-fargede ormer for å vurdere orm fitness og infeksjonsstatus
- For å analysere de DY96-fargede ormene (montert på lysbilder, som i trinn 7.8.), utfør avbildning ved hjelp av GFP-kanalen til et fluorescensmikroskop.
- For å bestemme ormepopulasjonens kondisjon, bruk et mål på 5x eller 10x for å analysen av graviditeten til > 100 ormer per tilstand.
MERK: Ormer som bærer ≥1 embryo regnes som gravid. Mekaniske celletellere kan bidra til å minimere menneskelig feil ved telling. Orme embryoer er mindre farget (mindre fluorescerende) enn mikrosporidia sporer19. Embryoer er ovoid, ~ 50 μm x ~ 30 μm, og finnes i midbody av friske C. elegans voksne. Friske, uinfiserte voksne bærer 10-20 embryoer organisert i rader langskroppslengden 26. - For å avsløre mer subtile forskjeller i kondisjon, utfør embryotall. For dette teller manuelt antall embryoer i 20-30 individuelle ormer per tilstand.
- Hvis du vil finne ut hvor infisert ormpopulasjonene er, bruker du et mål på 5x-40x for å vurdere infeksjonsstatusen til > 100 ormer per tilstand. Ormer som består av et hvilket som helst antall intracellulære tarmsporer anses som smittet.
MERK: Mikrosporidiasporer er lysere enn ormeembryoer. Bønneformede sporer av N. parisii er ~ 2,2 μm x ~ 0,8 μm og produseres i ormens tarmceller fra ~ 48 hpi15. Ormer der sporer ses utelukkende i tarmlumen og ikke langs tarmveggene, regnes ikke som smittet19. Dette skyldes at disse sporene sannsynligvis representerer nyinntakede sporer som ikke skyldes infeksjon av individet. - Bruk programvare for bildeanalyse (se Materialfortegnelser), kvantifiser parasittbyrde og ormstørrelse ved å følge trinnene nedenfor.
- Bilde 20-30 ormer montert på mikroskoplysbilder ved hjelp av et fluorescerende oppreist stereoskop for hver prøve. Ta bilder i Brightfield-, DAPI- og GFP-kanaler. Velg en passende eksponering i GFP-kanalen slik at fluorescensen i de mest infiserte prøvene ikke er mettet.
MERK: Infeksjonen kan fortsatt visualiseres i de minst infiserte prøvene. Bilder tas vanligvis med en 5x målsetting. - Åpne filer i FIJI/ImageJ. Avhengig av filtypen kan plugin-modulen Bio-Formats Importer være nødvendig for å åpne bilder i ImageJ.
- Omriss 20-30 individuelle ormer i bilder ved hjelp av brightfield- eller DAPI-bilder og markeringsverktøyet Polygon på verktøylinjen. Lagre hver disposisjon med Analyser > Verktøy > Region of Interest (ROI) Manager i rullegardinmenyen ved å klikke på Legg til [t]. Konturdyr som er fullt synlige i rammen.
MERK: Ormeomriss kan besøkes på nytt senere ved å lagre filen med disposisjoner som en Tiff. - Klikk på Fjern merking i ROI-lederen for å fjerne alle konturer fra bildet og klikk på Bilde > Dupliser i rullegardinmenyen. Skriv inn tallet som tilsvarer interessekanalen, i "Kanaler" -boksen for å duplisere GFP-kanalen for parasittbyrde (f.eks. 2).
- Terskel denne kanalen ved hjelp av Image > Juster > Threshold til et nivå der den lyse parasittbyrden fanges, men dimmerfluorescensen fra ormeembryoer er ikke, og klikk deretter på Påfør. Legg merke til terskelverdiene som brukes, og bruk dem konsekvent for alle bilder av samme eksperiment.
MERK: Kontroller at terskelen er en passende verdi for både minst og mest infiserte prøver før du analyserer alle bildene. - Velg Analyser > Angi mål og merk av for Områdebrøk. Velg enkeltormomriss etter tur fra ROI-lederen og klikk på Analyser > Measure-funksjonen . Et resultatvindu vil gi målingen for %Area (dvs. % parasittbyrde).
MERK: Hvis fluorescensen fra embryoene er så lys at den krysser terskelen, kan penselverktøyet i svart på verktøylinjen brukes til å slette disse områdene manuelt før måling av %Area ( Måling av %Arealet). - Hvis du vil finne ormestørrelsen som en avlesning av kondisjon, kan du markere ormer som beskrevet i trinn 8.3. Velg Analyser > Angi mål og merk av for Område. Velg enkeltormomriss etter tur fra ROI-lederen og klikk på Analyser > Mål-funksjonen . Et resultatvindu gir målet for %Area( Område).
- Bilde 20-30 ormer montert på mikroskoplysbilder ved hjelp av et fluorescerende oppreist stereoskop for hver prøve. Ta bilder i Brightfield-, DAPI- og GFP-kanaler. Velg en passende eksponering i GFP-kanalen slik at fluorescensen i de mest infiserte prøvene ikke er mettet.
9. FISKEanalyse for å vurdere invasjon av C. elegans ved mikrosporidia og spore avfyring
MERK: MicroB FISH-sonden gjenkjenner en bevart region av mikrosporidian 18s rRNA og kan brukes til å merke intracellulære sporoplasmer (dvs. invaderte vertsceller) og det genetiske materialet i sporer.
- Infiser 6000 blekemiddel synkroniserte L1 ormer med 4 millioner sporer av N. parisii og 10 μL av 10x OP50-1 i et endelig volum på 400 μL som består av M9-medier.
- Tallerken blandingen på en 6 cm usett NGM-plate, tørk i et rent skap i 10-20 min, og plasser ved 21 °C.
- Etter 30 min, vask dyrene av platene med 1 ml M9-medier som inneholder 0,1% Tween-20.
- Pellet ormene ved sentrifugering ved 1400 x g i 1 min ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten ved hjelp av en pipettespiss, tilsett 700 μL aceton, og la den sitte i 10 minutter ved romtemperatur.
MERK: På dette tidspunktet kan ormene lagres ved -20 °C for behandling på et senere tidspunkt. - Utfør FISH-analyse over natten ved hjelp av MicroB-sonden etter tidligere publiserte rapporter27,19.
MERK: For å vurdere sporeavfyring, suppler du den endelige 500 μL vaskebufferen med 20 μg/ml DY96 til prøvene og roterer i 30 minutter ved 21 °C før du fortsetter med protokollen som normalt. - Oppbevar lysbildene i en skyveboks ved 4 °C. For langtidslagring (dvs. flere måneder), oppbevar flere prøver i mikrosenterrør ved 4 °C i mørke.
- For å vurdere invasjon i FISK-fargede ormer, se på ormene ved hjelp av den røde kanalen til et fluorescensmikroskop. Visualiser infeksjonshendelser ved høy forstørrelse (63x mål) da L1 dyr er små, og sporoplasmer vil være i de tidlige stadiene av replikering. For å vurdere spore avfyring, bruk en 63x mål og både røde og grønne fluorescenskanaler.
MERK: Sporer der GFP og mCherry signal colocalize anses som unfired; tomme GFP-sporsaker anses som avfyrt. - For å analyse invasjon eller spore avfyring, må du manuelt telle antall sporoplasmer (mCherry foci i tarmcellene) eller prosentandelen sporer avfyrt i 20-30 ormer per tilstand. Juster fokuset i z-flyet for å fange opp alle infeksjonshendelser og sporer, som ofte finnes i forskjellige plan.
MERK: Sporoplasmer finnes utelukkende i tarmcellene. Den høyeste konsentrasjonen av sporoplasmer finnes vanligvis umiddelbart etter svelget. Hvis prøver også er farget med DY96, se etter tilstedeværelsen av sporoplasmer som ikke colocalize med sporet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den nåværende studien ble foreldrepopulasjoner av C. elegans (P0) smittet på L1-stadiet med en lav dose N. parisii sporer. Disse infeksjonstilstandene brukes vanligvis til å oppnå høyt antall mikrosporidiaresistente F1-avkom gjennom bleking av foreldrene. Infiserte foreldrepopulasjoner og uinfiserte kontroller ble festet til 72 hk og farget med DY96 for å visualisere ormeembryoer og mikrosporidiasporer (figur 1A). Infiserte dyr er små, inneholder mange mikrosporidiasporer, og produserer færre embryoer enn sunne uinfiserte kontroller. Vurdering av orm gravidity viste at ~ 95% av uinfiserte dyr produserte avkom, sammenlignet med mindre enn 80% av de smittede dyrene (figur 1B). Kvantifiseringer viste at ~ 90% av den mikrosporidiabehandlede befolkningen ble smittet, som bestemt av antall ormer som inneholder DY96-fargede sporer (figur 1C). For å oppnå immunprimert F1 avkom, er det viktig å bruke en dose mikrosporidi som er høy nok til å sikre at de fleste foreldre er smittet, men lav nok til å sikre at befolkningen fortsatt kan produsere avkom. En tabell over mikrosporidiadosene som brukes til å innhente dataene i denne studien, er gitt (tabell 1).
Uinfiserte og infiserte foreldrepopulasjoner (figur 1) ble behandlet med natriumhypokloritt ved 72 hki for å oppnå naive og immunprimerte F1-avkom. F1 dyr ble utsatt for en høy dose N. parisii sporer på L1 stadium for å teste for arvelig immunitet mot mikrosporidia. Ved 72 hk ble F1-dyrene fikset og farget med DY96 for å vurdere mikrosporidiamotstand (figur 2A). Kvantifiseringer av disse faste dyrene viste at de primede ormene inneholdt betydelig flere embryoer enn deres naive kolleger, noe som indikerer større kondisjon i møte med infeksjon (figur 2B). FIJI/ImageJ ble brukt til å bestemme parasittbyrden til individuelle naive og immunprimerte ormer (dvs. prosentandel av kroppen fylt med fluorescerende N. parisii-sporer ) (figur 2C). Kvantifiseringer avslørte en dramatisk reduksjon i parasittbyrden av ormer som kom fra infiserte foreldre (figur 2D). Videre viste beregninger av individuell ormstørrelse at primede ormer hadde en betydelig vekstfordel i forhold til naive dyr i møte med N. parisii-infeksjon (figur 2E). Disse dataene viser at N. parisii-infiserte foreldre produserer avkom med høye nivåer av mikrosporidiaresistens.
Tidligere arbeid har avslørt at arvet immunitet mot mikrosporidia reduserer invasjonen av tarmceller av N. parisii19. For å visualisere forskjeller i vertscelleinvasjon ble naive og immunprimerte dyr (hentet fra uinfiserte eller infiserte foreldre, som ovenfor) utsatt for en maksimal dose N. parisii på L1-stadiet. Ved 30 dpi ble ormene festet og co-farget, ved hjelp av en FISH-sonde for å oppdage N. parisii RNA og DY96 for å oppdage N. parisii sporevegger. Imaging avslørte at mens naive dyr vanligvis inneholdt flere sporer og flere infiserte celler (sporoplasmer), hadde de primede dyrene langt færre (eller ingen) sporer og vanligvis ingen sporoplasmer (figur 3).
Figur 1: Direkte gul 96 (DY96) farging av uinfisert og N. parisii-infisert C. elegans avslører orm gravidity og infeksjon status. (A-C) N2 C. elegans ble ikke smittet eller smittet med en lav dose N. parisii på L1 stadium. Ved 72 hki ble ormene fikset, farget med DY96, og avbildet for å vurdere orm graviditet og infeksjonsstatus. (A) Representative bilder vises. DY96 muliggjør visualisering av ormeembryoer og mikrosporidiasporer (chitin). Et innfelt bilde av en infisert orm vises på høyre side. Embryoer er merket 'E'; N. parisii infeksjon i tarmen er merket 'Np'. Skalalinje for venstre og midterste bilde = 500 μm. Skalalinjen for det høyre bildet = 100 μm. (B) Ormer som bærer ett eller flere embryoer ble scoret som gravid og grafert. (C) Ormer som bærer et hvilket som helst antall N. parisii sporer i tarmcellene ble scoret som smittet og grafert. (B-C) Data gruppert fra 5 uavhengige eksperimenter ved hjelp av n = 100 ormer per tilstand per eksperiment. Gjennomsnittlig ± SEM vises. P-verdiene ble bestemt av den ubetalte tosidige Student t-testen. Signifikans ble definert som: *p < 0,05; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Direkte gul 96 (DY96) farging av naive og immunprimede C. eleganer for å bestemme embryoer per orm, mikrosporidiabyrde og ormstørrelse. (A) N2 C. elegans ble smittet eller ikke smittet med en lav dose N. parisii på L1 stadium. Ved 72 hk ble ormene behandlet med natriumhypokloritt for å frigjøre embryoer. De resulterende naive og immunprimerte avkomene ble smittet med en høy dose N. parisii på L1-stadiet. Ved 72 hki ble ormene festet, farget med DY96, og avbildet for å visualisere ormeembryoer og parasittbyrde. Representative bilder vises. Skalastang = 200 μm.(B) Antall embryoer per orm ble talt og grafert fra (A). (C) Et skjermbilde fra FIJI/ImageJ viser naive ormer fra panel A som har blitt terskelet for å visualisere parasittbyrden (vist i hvitt) ved hjelp av Terningsvinduet nederst til høyre. Her ble individuelle ormer skissert ved hjelp av verktøyet "Polygon selections" uthevet i rødt og definert som "Region of interests" (ROI) ved hjelp av ROI-vinduet øverst til høyre. Funksjonen Analyser > mål > område ble brukt til å kvantifisere parasittbyrden til to eksempelormer, vist seg å være 25,02% og 13,49%. (D) Parasittbyrden per orm ble bestemt og grafert fra (A). (E) Fra bildene ovenfor ble individuell ormstørrelse beregnet fra dyr skissert som i panel C ved hjelp av funksjonen Analyser > Mål > område . (B, D og E) Gjennomsnittlig ± SEM vises. P-verdiene ble bestemt av den ubetalte tosidige student t-testen. Signifikans ble definert som: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescens in situ hybridisering (FISH) mot N. parisii 18S rRNA avslører parasittinvasjon av C. elegans tarmceller hos naive, men ikke primede dyr. N2 C. elegans ble smittet eller ikke smittet med en lav dose N. parisii på L1 stadium. Ved 72 hk ble ormene behandlet med natriumhypokloritt for å frigjøre embryoer. De resulterende naive og immunprimerte avkomene ble smittet med en maksimal dose N. parisii på L1-stadiet. Ved 30 mpi ble ormene festet, utsatt for FISK for å oppdage sporoplasmer, farget med DY96 for å oppdage mikrosporidiasporvegger og avbildet. Representative bilder vises. Innsett bilder for den naive ormen viser sporoplasmer (rød, stjerner), avfyrte sporer (grønn, pilspisser) og en ufired spore (gul, pil). Den naive infiserte ormen som vises, viser 4 sporoplasmer. Skalalinje = 20μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| N. parisii dose | Platekonsentrasjon (sporer/cm2) | Millioner av sporer per 6 cm plate | Millioner av sporer per 10 cm plate |
| Lav | 35,400 | - | 2.7 |
| Høy | 88,400 | 2.5 | - |
| Maksimal | 2,12,000 | 6 | - |
Tabell 1: N. parisii doser ansatt i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver studiet av mikrosporidi og arvet immunitet i en enkel og genetisk gjennomførbar N. parisii -C. elegans infeksjonsmodell .
Spore forberedelse er en intensiv protokoll som vanligvis gir nok sporer i 6 måneder med eksperimenter, avhengig av produktivitet24. Det er viktig at infektivitet bestemmes for hver nye spor "lot" før du bruker den til forsøkene. På grunn av variasjonen i infektivitet mellom sporepreparater, må en enkelt tomt brukes konsekvent for alle gjentakelser av et eksperiment. Individuelle aliquots bør ikke tines og fryses på nytt, da opptining kan føre til at sporer skyter og reduserer infektivitet. Som sådan må sporer bare fjernes fra -80 °C fryseren umiddelbart før infeksjon og opprettholdes på is mens du er på benken.
I trinn 5-6 ble smitteanalysene skissert. Det er viktig under infeksjonsanalyser å unngå forurensning eller sult av dyrene, da dette kan føre til ytterligere intergenerasjonelle effekter som forvirrer immunitet i F1s. En viktig begrensning i den arvede immunitetsanalysen er at flere smittede foreldre produserer færre F1-avkom. Derfor er det viktig å finne en forsiktig balanse mellom foreldregenerasjonen som er tilstrekkelig smittet til å videreføre immuniteten samtidig som den er sunn nok til å produsere avkom for testing. Selv om den nåværende protokollen beskrev infeksjonsanalyser for L1-dyr, kan protokollen endres for å teste virkningen av mikrosporidiainfeksjon på forskjellige iscenesatte foreldre og vedvarende immunitet hos eldre avkom. Metodene kan også modifiseres for å teste effekten av flere eller distinkte påkjenninger (f.eks. osmotisk stress, tungmetallstress, myntfeksjon med et annet patogen) på arvelig immunitet. Mens arvet immunitet mot N. parisii i C. elegans er intergenerasjonell (dvs. varer en enkelt generasjon)19, protokollen kan tilpasses for å studere ytterligere generasjoner for å teste transgenerasjonelle effekter. Mens protokollene som er gitt er spesifikke for N. parisii infeksjon, finnes mange andre nematode-infiserende arter av mikrosporidia28. Protokollene kan tilpasses for å studere arvelig immunitet mot annen tarminfeksjon (f.eks. Nematocida ausubeli) og epidermal- og muskelinfeksjon (f.eks. Nematocida displodere) mikrosporidia29,30. C. elegans er også smittet av mange andre naturlige og menneskelige patogener (bakterielle, sopp og virale). Metodene beskrevet her kan brukes til å teste arvelig immunitet mot andre patogener i C. elegans og patogen-spesifisiteten til den arvede immunresponsen til N. parisii. C. elegans er en veletablert modellorganisme. Imidlertid er andre medlemmer av Caenorhabditis-slekten, inkludert hermafroditiske arter C. tropicalis og C. briggsae og den mannlige kvinnelige arten C. kamaaina også smittet i varierende grad med N. parisii31. Ved å gjøre små modifikasjoner på protokollene som følger med, kan arvet immunitet også testes hos disse dyrene.
I trinn 8 ble det gitt raske og enkle metoder for å bestemme forskjeller i mikrosporidia følsomhet i DY96-fargede ormer (dvs. % dyr smittet, % dyr gravid). Noen ganger er disse metodene imidlertid ikke følsomme nok til å oppdage små endringer i immunitet og kondisjon. Dette skyldes at en orm med ett embryo og mange infiserte celler vil bli behandlet på samme måte som en orm med 10 embryoer og en infisert celle. Som sådan er det også gitt metoder med finere oppløsning for å bestemme infeksjonsutfall hos disse dyrene (dvs. % parasittbyrde, antall embryoer, ormstørrelse). Mens begge metodene kan brukes, er fenotypiske forskjeller vanligvis mer uttalt med sistnevnte, noe som gjør det lettere å oppdage betydelige forskjeller. Fremtidige tilpasninger til denne metoden kan omfatte bruk av maskinlæring for å automatisere analyse.
I trinn 9 ble det gitt teknikker for å analyse av vertscelleinvasjon ved mikrosporidia og spore avfyring ved hjelp av FISK. Mens DY96 markerer mikrosporidi med et sterkt fluorescerende grønt signal, kan andre fargestoffer, inkludert den lipofile flekken Nil Rød og den chitinbindende Calcofluor White, også brukes til å farge N. parisii 30,32,33. Den nåværende protokollen beskriver fiksering ved hjelp av aceton og fungerer bra for å oppdage mikrosporidia med DY96- og FISH-farging. Fiksering med 4% paraformaldehyd kan imidlertid bidra til å bevare vevsmorfologi og forbedre signalet i noen bildeprotokoller.
Mikrosporidi er et undervurdert patogen, og mye av cellebiologien til infeksjon forblir ukjent. C. elegans er en enkel modellorganisme, og disse protokollene kan tjene som en plattform for å forstå de viktigste prosessene som er involvert i infeksjon og vertsforsvar mot denne parasitten. Arvet immunitet er et fremvoksende felt, og mange spørsmål forblir fremragende1. Hvordan overfører smittede foreldre immunitet mot avkom (mors klargjøring eller endret transkripsjonsregulering i avkom)? Hva formidler immunitet hos avkom (antimikrobielle peptider eller andre immunproteiner)? Hvor patogenspesifikk er arvelige immunresponser, og hvor konservert er arvet immunitet mellom arter? Gitt de omfattende verktøyene som er tilgjengelige med C. elegans, er studier som bygger på protokollen beskrevet her godt klar til å svare på disse grunnleggende spørsmålene om arvelig immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Winnie Zhao og Yin Chen Wan for å gi nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al.
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
