Summary
Um microscópio fotoacústico ultravioleta de alta velocidade e aberto que pode fornecer imagens histológicas intraoperatóriamente para análise de margem cirúrgica é demonstrado, incluindo a configuração do sistema, alinhamento óptico, preparação de amostras e procedimentos experimentais.
Abstract
A análise da margem cirúrgica (SMA), procedimento essencial para confirmar a excisão completa do tecido cancerígeno na cirurgia de ressecção tumoral, requer ferramentas de diagnóstico intraoperatória para evitar cirurgias repetidas devido a uma margem cirúrgica positiva. Recentemente, aproveitando a alta absorção óptica intrínseca de DNA/RNA em comprimento de onda de 266 nm, a microscopia fotoacústica ultravioleta (UV-PAM) foi desenvolvida para fornecer imagens histológicas de alta resolução sem rotulagem, mostrando grande promessa como ferramenta intraoperatória para sma. Para permitir o desenvolvimento de UV-PAM para SMA, aqui, é apresentado um sistema UV-PAM de alta velocidade e open-top, que pode ser operado de forma semelhante às microscopias ópticas convencionais. O sistema UV-PAM fornece uma alta resolução lateral de 1,2 μm, e uma alta velocidade de imagem de 55 kHz A-line com espelhamento galvanômetro de um eixo. Além disso, para garantir que as imagens UV-PAM possam ser facilmente interpretadas por patologistas sem treinamento adicional, as imagens originais de UV-PAM em escala de cinza são virtualmente manchadas por um algoritmo de aprendizagem profunda para imitar as imagens padrão manchadas de hematoxilina e eosina, permitindo a análise histológica sem treinamento. A imagem de fatia cerebral do mouse é realizada para demonstrar o alto desempenho do sistema UV-PAM aberto, ilustrando seu grande potencial para aplicações de SMA.
Introduction
A análise da margem cirúrgica (SMA), que requer um exame de amostras de tecido sob um microscópio, é um procedimento essencial para determinar se todas as células cancerígenas são removidas do corpo de um paciente em uma cirurgia de ressecção1. Portanto, um microscópio que pode fornecer rapidamente imagens histológicas é de vital importância para a SMA evitar cirurgias repetidas causadas pela remoção incompleta de células cancerosas. No entanto, de acordo com o método padrão-ouro atual baseado em microscopia óptica de campo brilhante, o tecido excisado é necessário para ser fixado em formalina, embutido em parafina, seccionado em fatias finas (4-7 μm), e depois manchado por hematoxylina e eosina (H&E) antes da imagem, que é demorada (3-7 dias) elaboriosa 2,3 . Uma seção congelada é uma alternativa rápida para a SMA congelando rapidamente, cortando e manchando o tecido, que pode fornecer imagens histológicas em 20-30 min4. No entanto, as características histológicas são muitas vezes distorcidas e necessitam de treinamento hábil, o que dificulta a aplicabilidade da técnica a vários tipos de órgãos5.
Técnicas ópticas de microscopia que podem fornecer imagens celulares sem ou com algumas etapas de processamento de tecidos foram desenvolvidas para SMA. No entanto, cada um deles sofre de questões diferentes. Por exemplo, a tomografia óptica de coerência6 e a microscopia de reflexão confocal7 sofrem de baixa especificidade devido ao seu baixo contraste de dispersão intrínseca. Embora a microscopia com excitação de superfície ultravioleta8 e microscopia de folha de luz9 possa fornecer imagens de alta resolução e alto contraste para SMA, o procedimento de coloração tóxica e volátil geralmente não pode ser realizado em uma sala de cirurgia, o que prolonga o tempo de retorno. Microscopia multifótons10 e microscopia Ramanestimulada 11 podem fornecer informações ricas para sma. No entanto, o alto custo dos lasers ultrarrápidos necessários que são usados para gerar efeitos não lineares impede sua ampla aplicabilidade.
Recentemente, aproveitando a absorção óptica intrínseca, a microscopia fotoacústica ultravioleta livre de rótulos (UV-PAM) foi desenvolvida para fornecer imagens histológicas de alta resolução12. Em UV-PAM, a energia fóton da luz UV de excitação (por exemplo, 266 nm) é primeiramente absorvida pelo DNA/RNA nos núcleos celulares13 e depois convertida em calor, induzindo a emissão de ondas acústicas através da expansão térmica-elástica14. Ao detectar as ondas acústicas geradas, imagens UV-PAM bidimensionais (2D) de núcleos celulares podem ser obtidas através da projeção de amplitude máxima dos sinais acústicos, fornecendo informações histológicas para SMA. Para permitir as aplicações clínicas do UV-PAM, uv-PAM de alta velocidade com base no escaneamento do espelho galvanômetro foi desenvolvido para fornecer imagens histológicas para uma amostra de biópsia cerebral (5 mm x 5 mm) dentro de 18 min, mostrando grande potencial em aplicações sensíveis ao tempo15. Para validar ainda mais a possibilidade de UV-PAM para imagens de tecidos espessos, foi proposto um sistema UV-PAM de modo de reflexão com um scanner de sistemas microeletromecânicos impermeável de um eixo, demonstrando com sucesso o exame histopatológico intraoperatório dos tecidos cólon e fígadohumanos 16. Como a imagem original do UV-PAM está em escala de cinza, enquanto a imagem padrão ouro H&E está nas cores rosa e roxo, é difícil para os patologistas interpretar diretamente as imagens UV-PAM. Para resolver esse problema, um algoritmo de aprendizagem profunda foi proposto para transferir imagens UV-PAM em escala de cinza em imagens virtuais manchadas de H&E em quase tempo real para que os patologistas possam entender as imagens sem qualquer treinamento adicional17.
Este trabalho relata um sistema UV-PAM de alta velocidade e aberto que pode ser operado semelhante às microscopias ópticas convencionais, fornecendo imagens histológicas originais em escala de cinza e imagens virtualmente manchadas assistidas por um algoritmo de aprendizagem profunda. Uma fatia cerebral de camundongos com fixação de formalina e parafina (FFPE) é imagem do sistema UV-PAM para demonstrar a semelhança entre nossas imagens UV-PAM praticamente manchadas e h&e-manchadas padrão, mostrando seu potencial para aplicações SMA.
Protocol
Todos os experimentos em animais realizados neste trabalho são aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong.
1. Sistema UV-PAM de topo aberto (Figura 1)
- Iluminação óptica
- Use um laser de estado sólido bombeado por diodo Q (comprimento de onda de 266 nm) como fonte de excitação.
- Use duas lentes convexas para expandir o raio laser e coloque um orifício perto do ponto focal da primeira lente convexa para realizar filtragem espacial.
- Reflita o raio laser para cima usando um espelho galvanômetro 1D (1D GM).
- Use uma lente objetiva para focar o raio laser e passe pelo centro de um transdutor ultrassônico em forma de anel (UT) antes de ser fortemente focado em uma amostra.
- Detecção ultrassônica
- Use um UT focado em anel para detectar ondas ultrassônicas. Os diâmetros internos e externos da área ativa ut são de 3 mm e 6 mm, respectivamente. Distância focal: 6,3 mm; frequência central: 40 MHz; -6 dB largura de banda: 84%.
- Fixar o UT em um tanque de água feito em laboratório com uma janela opticamente transparente na parte inferior, coberta por uma fina tampa de quartzo para permitir que a luz UV passe. Certifique-se de que a área ativa do UT está voltada para cima. Fixar o reservatório de água a um estágio manual de dois eixos para controlar a posição lateral do UT.
- Ligue o laser UV, ajuste a posição do UT para permitir que o raio laser passe pelo centro da UT. Desligue o laser UV. Em seguida, encha o reservatório de água com água desionizada para imergir totalmente o UT.
- Conecte a saída do UT a dois amplificadores (ganho total = 56 dB) e conecte a saída do segundo amplificador a uma placa de aquisição de dados (DAQ).
- Conecte um suporte de amostra a um estágio manual de eixo z conectado a estágios motorizados por xy. O porta-amostras tem um orifício vazio que permite a passagem da luz UV. Anexar quatro pedaços de fita dupla face ao redor do buraco.
- Alinhamento do sistema
- Conecte a fita preta a um slide de vidro e coloque o slide de vidro para cobrir o orifício do suporte da amostra, com a fita preta voltada para baixo. Pressione o slide de vidro para garantir que ele esteja fixado no suporte da amostra. Em seguida, baixe o suporte de amostra para imergir o deslizamento de vidro na água.
- Desconecte o UT em forma de anel e os amplificadores, conecte o UT ao pulser/receptor e conecte a saída do pulsador/receptor a um osciloscópio. Opere o pulsar/receptor no modo Pulse-Echo. Defina a amplitude de pulso e o ganho do pulser/receptor para 6 e 20 dB, respectivamente.
- Habilite o pulser/receptor e ajuste a posição z do suporte da amostra para encontrar a posição do plano focal acústico onde os sinais ultrassônicos são máximos.
- Altere o pulser/receptor para o modo de transmissão e ajuste o ganho para 60 dB. Habilite a saída do laser. Ajuste a posição z da lente objetiva para maximizar os sinais de AF que são medidos pelo osciloscópio.
- Ajuste a posição lateral do UT em forma de anel para tornar o sinal de PA gerado simétrico e máximo, o que representa que os focos ópticos e acústicos são coalhados no plano lateral. Em seguida, ajuste a posição z do suporte de amostra para maximizar os sinais de AF.
- Repita as etapas 1.4.3 e 1.4.4 para otimizar tanto a simetria quanto a amplitude dos sinais pa. Registo o tempo de atraso (ou seja, o tempo que leva para as ondas de PA atingirem o UT) no osciloscópio quando os sinais de PA são otimizados.
- Mova o suporte de amostra para imagem de diferentes posições da fita preta. Ajuste o achatamento do suporte da amostra de modo que os sinais de PA gerados a partir de cada posição da fita preta tenham o mesmo atraso de tempo que o medido na etapa 1.4.5.
- Desligue o laser e conecte o UT aos dois amplificadores.
2. Preparação da amostra
- Fatia cerebral do rato FFPE
- Sacrifique um rato com uma overdose de anestesia. Em seguida, colher o cérebro do rato seguindo o protocolo descrito na referência18.
- Conserte o cérebro colhido em formalina tamponada 10% neutra por 24 h.
- Processe o cérebro fixo por desidratação com álcool classificado, limpando com xileno e incorporando com parafina como descrito na referência19.
NOTA: Processe a amostra em um capô de fumaça. - Corte o cérebro embutido em fatias finas (5 μm de espessura) usando um microtome. Coloque as fatias de amostra em lâminas de quartzo. Seque as lâminas em um forno a 60 °C por 1h.
- Desparafinar as seções usando um agente de compensação (ver Tabela de Materiais), que remove a parafina para evitar sinais de fundo elevados, pois a parafina é altamente absorvente com excitação UV.
NOTA: Processe a amostra em um capô de fumaça.
- Fatia cerebral de rato fresco
- Sacrifique um rato com uma overdose de anestesia. Em seguida, colhe o cérebro do rato seguindo o protocolo estabelecido na referência18.
- Lave o cérebro do rato com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover o sangue.
- Corte uma fatia da amostra cerebral (~5 mm de espessura) à mão e depois lave a amostra com PBS para remover o sangue na seção transversal.
3. Procedimentos experimentais
- Colocação da amostra
- Prepare um tanque de amostra feito em laboratório com uma membrana transparente UV (polietileno, ∼ 10 μm de espessura). Adicione uma gota de água à membrana e coloque a amostra biológica no reservatório de amostras para cobrir a água. No caso da amostra de fatia FFPE, use fita adesiva para fixar o deslizamento de vidro na membrana.
- Coloque o tanque de amostra contendo amostra no suporte da amostra, garantindo cobrir o orifício vazio do suporte da amostra.
- Ajuste o laser UV no modo de gatilho externo. Usando nosso programa LabVIEW construído em laboratório (ver Tabela de Materiais), defina os parâmetros de digitalização da seguinte forma.
- Definir a taxa de repetição do laser para 55 kHz; definir o sinal edo driver GM para triangular e a faixa de tensão de condução para 0,018 V (representando ±0,018 V; fator de escala: 1 V/°). Ajuste GMnum para 22 e dy para 2 para que, após cada 22 gatilhos a laser, o GM termine um quarto do período de varredura, e o motor do eixo y mova um tamanho de passo de 0,3125 μm. Ajuste dx para 192 para que quando o motor do eixo y atinja a posição predefinida (por exemplo, 5 mm), o motor x-eixo move um tamanho de passo de 30 μm.
NOTA: O menor tamanho de etapa incremental está definido para 0,15625 μm para os motores x-e-eixo y. Portanto, quando dy = 2, o tamanho do passo equivale a 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, e quando dx = 192, o tamanho do passo equivale a 0,15625 x 192 = 30 μm. Para escanear toda a área de 5 x 5 mm2, o motor x-eixo moverá 5000 μm /30 μm = 167 vezes, o que significa que 167 sub-imagens seriam costuradas para obter uma imagem inteira. Consulte a Figura 2 para obter a trajetória de digitalização do sistema UV-PAM.
- Definir a taxa de repetição do laser para 55 kHz; definir o sinal edo driver GM para triangular e a faixa de tensão de condução para 0,018 V (representando ±0,018 V; fator de escala: 1 V/°). Ajuste GMnum para 22 e dy para 2 para que, após cada 22 gatilhos a laser, o GM termine um quarto do período de varredura, e o motor do eixo y mova um tamanho de passo de 0,3125 μm. Ajuste dx para 192 para que quando o motor do eixo y atinja a posição predefinida (por exemplo, 5 mm), o motor x-eixo move um tamanho de passo de 30 μm.
- Inicie a varredura de ensaio em uma pequena região definindo o número de passos móveis dos motores x e y-axis (xn = 10 e yn = 1000). Ajuste o estágio manual do eixo z para colocar a amostra no plano focal para obter sinais máximos de AF.
- Mova os motores x e y-axis para o ponto de partida desejado, defina a região de digitalização definindo os valores xn e yn e, em seguida, inicie o programa de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).
- Após a aquisição da imagem, desligue o laser, remova o suporte da amostra e armazene as amostras biológicas.
- Para tecidos biológicos frescos, armazene as amostras em formalina tamponada 10% neutra.
- Para as fatias cerebrais do mouse FFPE, colori a mancha com H&E seguindo o protocolo indicado na referência20 para obter as imagens correspondentes manchadas de H&E.
- Use os sinais pa coletados para reconstruir a imagem de projeção de amplitude máxima usando um algoritmo de processamento de imagem construído em laboratório (ver Tabela de Materiais).
Representative Results
A Figura 1 mostra o esquema do sistema UV-PAM de alta velocidade. Nesta configuração, os caminhos de excitação óptica e detecção ultrassônica estão no mesmo lado e abaixo da amostra, formando um modo reflexivo e sistema de topo aberto. Assim, é fácil de usar e adequado para imagens de amostras grossas.
A Figura 2 mostra a trajetória de varredura do sistema UV-PAM durante a imagem. A subimagem de cada seção (por exemplo, área de 5 mm x 30 μm) é primeiramente gerada usando um algoritmo de interpolação dispersa e, em seguida, toda uma imagem (por exemplo, área de 5 mm x 5 mm) é obtida costurando todas as sub-imagens usando algoritmo de processamento de imagem personalizado (ver Tabela de Materiais).
A Figura 3A e a Figura 3B mostram as imagens UV-PAM e H&E de uma fatia cerebral de rato FFPE, respectivamente, ambas com um campo de visão de 5 x 5 mm2. O algoritmo de processamento de imagens pode ser acessado a partir do Github através do link fornecido na Tabela de Materiais. O tempo de aquisição da imagem foi inferior a 18 min. A Figura 3C-F mostra as imagens ampliadas das regiões marcadas na Figura 3A, onde os núcleos celulares individuais podem ser claramente resolvidos. Mais importante, os núcleos celulares correspondentes podem ser encontrados nas imagens padrão manchadas de H&E (Figura 3G-J), mostrando a alta precisão do sistema atual para imagens celulares. Para transferir a imagem UV-PAM em escala de cinza para uma imagem virtual manchada de H&E, foi aplicado um algoritmo de aprendizagem profunda17 (ver Tabela de Materiais), que levaria menos de 30 s para uma imagem com 8000 x 8000 pixels. As imagens com zoom correspondentes são mostradas na Figura 3K-N. As imagens UV-PAM praticamente manchadas fornecem quase as mesmas informações estruturais das imagens manchadas de H&E, mostrando promessa de tradução clínica do atual sistema UV-PAM.
Figura 1: O esquema do sistema UV-PAM de alta velocidade e de topo aberto. (A) A configuração do sistema. (B) Fotografia do porta-amostras e de um reservatório de água que está preso a um estágio manual de dois eixos. (C) Fotografia do transdutor ultrassônico em forma de anel fixado no reservatório de água e no tanque de amostras que cobre o orifício do suporte da amostra. (D) Fotografia do tanque de amostra com a membrana e amostra que seria colocada no suporte da amostra. UV: Ultravioleta; DAQ: Cartão de aquisição de dados; Gm: Espelho galvanômetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A trajetória de varredura do sistema UV-PAM durante a imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados experimentais de imagens UV-PAM com coloração virtual baseada em aprendizagem profunda. (A) Imagem UV-PAM de uma fatia cerebral de rato FFPE. (B) Imagem padrão manchada de H&E da mesma fatia. Barras de escala: 1 mm. (C-F) Imagens ampliadas das regiões marcadas em A. (G-J) Imagens correspondentes manchadas de H&E das regiões marcadas em B. (K-N) Correspondentes imagens praticamente manchadas usando um algoritmo de aprendizagem profunda. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Em resumo, um sistema UV-PAM de alta velocidade e aberto foi demonstrado para imagens histológicas. São apresentadas as instruções detalhadas sobre a configuração do sistema, alinhamento óptico, preparação da amostra e procedimentos experimentais. O programa de aquisição de imagens pode ser acessado a partir do Github através do link fornecido na Tabela de Materiais. A resolução lateral do presente sistema é de ~1,2 μm que foi medida experimentalmente em uma publicação recente21. Uma fatia cerebral do rato foi imagem para demonstrar que o sistema atual pode obter uma imagem histológica dentro de 18 minutos para uma área de 5 x 5 mm2, que é um tamanho típico de biópsia cerebral22. Embora a imagem original esteja em escala de cinza, com o auxílio de uma ferramenta de coloração virtual digital habilitada por um algoritmo de aprendizagem profunda, o sistema atual pode fornecer imagens praticamente manchadas em quase tempo real, garantindo fácil adaptação para os patologistas interpretarem as imagens. Como uma técnica de imagem livre de rótulos, o atual sistema UV-PAM também pode fornecer imagens histológicas para amostras de tecido fresco não processados. Mais exemplos (incluindo amostras de tecido fresco e secionados congelados) foram demonstrados em uma publicação anterior17. Os resultados experimentais mostram o alto potencial do atual sistema UV-PAM assistido por aprendizagem profunda em aplicações de SMA.
Uma das vantagens do sistema UV-PAM é que o sistema é implementado no modo de reflexão, possibilitando a imagem de tecidos grossos. Além disso, o sistema UV-PAM de topo aberto permite que a amostra seja colocada na janela de varredura (a membrana do tanque de amostra), que tem uma operação semelhante às microscopias ópticas tradicionais. Portanto, este sistema é mais fácil de usar do que outros sistemas que exigem que as amostras sejam sanduíches por duas membranas11,14. Além disso, usando um GM 1D com um laser UV de alta taxa de repetição, o atual sistema UV-PAM pode alcançar alta velocidade de imagem com maior custo-efetividade quando comparado com o sistema usando excitação multifocal23.
Atualmente, a velocidade de imagem é limitada principalmente pela taxa de repetição do orçamento de laser e fótons. Com um laser que tem uma alta taxa de repetição e alta energia de pulso, o tempo de imagem pode ser ainda mais encurtado. Outra limitação do sistema é que a amostra só pode ser ajustada aproximadamente ao plano focal da lente objetiva, encontrando os sinais máximos de PA, em vez de exibir uma imagem em tempo real para os usuários visualizar se a amostra está em foco. Para exibir uma imagem quase em tempo real, o GM 2D pode ser aplicado.
Existem duas etapas críticas no protocolo: (a) a exigência confocal dos focos ópticos e acústicos deve ser otimizada para alcançar uma alta sensibilidade de detecção; b A faixa de varredura do GM no eixo x deve ser menor do que o ponto focal acústico do UT em forma de anel para manter sensibilidade de alta detecção semelhante (na configuração atual, a faixa de varredura é de ~30 μm ± 15 μm). Caso contrário, efeitos óbvios de vinheta ao redor das bordas ocorreriam quando várias sub-imagens são costuradas para obter uma imagem inteira.
Disclosures
T. T. W. W. e V. T. C. T. têm um interesse financeiro na PhoMedics Limited, que, no entanto, não apoiou este trabalho. Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o apoio financeiro da Comissão de Inovação e Tecnologia de Hong Kong (ITS/036/19).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
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