Méthodologie pour tester les agents de contrôle et les insecticides contre l’agrile du café Hypothenemus hampei

L’agrile des baies de café (CBB), Hypothenemus hampei, a été détecté pour la première fois en 1988 en Colombie et est depuis devenu l’espèce de ravageur la plus importante de la culture du café. Les femelles CBB quittent le fruit natal déjà fécondé, à la recherche de nouveaux fruits guidés par les produits chimiques volatils qu’elles émettent ^1,2. Un cycle complet est accompli dans les 23 jours³ à une température de 25 °C. Le cycle commence avec la femelle fondatrice pénétrant dans la graine et pondant des œufs dans l’endosperme du fruit. Les larves écloses mangent la graine. Si les fruits sont disséqués à ce stade, il serait possible d’observer à la fois la femelle fondatrice et sa progéniture. Après 14 jours, les larves deviennent des nymphes - généralement, le stade des nymphes dure 5 jours. Au stade adulte, les femelles copulent avec leurs frères et sœurs, et les femelles nouvellement fécondées s’envolent loin des fruits endommagés à la recherche de nouveaux fruits de café pour commencer un nouveau cycle⁴.

Le processus de pénétration et le résultat de l’alimentation larvaire endommagent la graine de café, diminuant la qualité de la boisson au café et réduisant considérablement les revenus; une infestation supérieure à 5 % dans les plantations de café est généralement considérée comme le seuil économique.

La lutte contre la CBB est fondée sur une stratégie de lutte intégrée contre les ravageurs (LAI), y compris la lutte culturelle et les pratiques agronomiques, les agents biologiques naturels et l’utilisation d’insecticides chimiques, ce qui nécessite des conditions de sécurité et une application en temps opportun⁴.

Pour évaluer de nouveaux insecticides pour la lutte contre le CBB, des méthodologies peu coûteuses sont nécessaires pour permettre d’obtenir des résultats rapides. Des procédures de laboratoire et de terrain sont actuellement utilisées, y compris des régimes artificiels contenant du café dans lesquels les insecticides sont incorporés ^5,6, ou la pulvérisation des insecticides sur du café parchemin sec ^7,8,9. En outre, des expériences menées sur le terrain à l’aide de branches de café recouvertes de manchons entomologiques ont été rapportées^10,11; cependant, ces méthodes nécessitent un travail intense et de longues périodes d’évaluation.

Une condition ressemblant aux conditions naturelles du champ, qui est également rapide et peu coûteuse, est l’utilisation de fruits de café verts ou mûrs. Cependant, ces fruits doivent être maintenus dans des conditions propices au développement du CBB, en évitant les altérations et les contaminants par les micro-organismes pour maintenir leur qualité et leurs propriétés. À cette fin, différents désinfectants ont été utilisés, ainsi que des procédures impliquant la chaleur et le rayonnement 7,9,12,13,14,15,16.

De plus, les méthodes d’évaluation des insecticides par rapport au CBB nécessitent des simulations de femelles adultes volant à la recherche de fruits ou pénétrant dans ces fruits^17,18. Pour cela, des infestations artificielles de fruits ont été effectuées sur le terrain ^8,11,19, bien que ce processus nécessite beaucoup de main-d’œuvre et dépende des conditions environnementales.

Nous décrivons ici une méthodologie normalisée pour l’évaluation des produits qui peuvent avoir des effets différents sur le CBB dans des conditions environnementales contrôlées qui ressemblent à des conditions de terrain.

REMARQUE: Ce protocole traite de différentes méthodes pour identifier différents effets sur le CBB dans des conditions de laboratoire.

1. Collecte de fruits

1. Cueillez des GF avec un âge de développement d’environ 120 à 150 jours après la floraison des arbres dans une plantation de café tôt le matin.

2. Désinfection des fruits²⁰

1. Apportez environ 300 GF au laboratoire. Sélectionnez des GF de taille uniforme et saines et retirez les pédoncules.
2. Trempez les GF dans une solution de savon (2 mL de savon à vaisselle liquide dans 998 mL d’eau du robinet), puis frottez pour laver les GF. Ensuite, rincez les fruits avec de l’eau, en changeant l’eau trois fois.
3. Immerger les GF dans une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5 % (100 mL dans 900 mL d’eau du robinet) et incorporer un agitateur à 110 tr/min pendant 15 min. Ensuite, rincez les GF avec de l’eau en remuant dans un shaker et en changeant l’eau trois fois, toutes les 10 minutes.
4. Séchez les GF avec des serviettes en papier stériles.
5. Placez les GF dans des plateaux (33 cm x 25 cm x 2 cm) et irradiez-les pendant 15 min, en plaçant les GF à une distance de 55 cm de la source UV à l’intérieur d’une station d’écoulement laminaire horizontal compatible UV.
6. Pendant la période de 15 minutes, toutes les 5 minutes, déplacez les GF pour assurer l’irradiation du fruit entier.

3. Désinfection par les insectes²¹

1. Utilisez des insectes CBB nouvellement émergés (le jour même) pour mettre en place les essais biologiques.
2. Immerger les CBC dans une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5%, en les agitant lentement avec une brosse pendant 10 min.
3. Filtrer les CBC à travers un chiffon en mousseline et les laver trois fois avec de l’eau distillée stérile.
4. Enlevez l’excès d’eau avec des serviettes en papier stériles.

4. Évaluation d’un produit ayant un effet protecteur sur les fruits (préinfestation) (Figure 1)

1. Utilisez un groupe de GF par unité expérimentale. Généralement, un groupe de 30 GF est utilisé par unité expérimentale.
2. Placez les GF dans des boîtes en plastique (unité expérimentale).
3. Appliquer le produit d’essai aux différentes concentrations pour évaluation. Effectuez l’application avec un pulvérisateur portable. Ici, une émulsion d’alcaloïdes à 5% et 6% a été testée.
4. Comme contrôle, vaporisez de l’eau sur un groupe de GF.
5. Utilisez au moins trois répétitions (unité expérimentale) par traitement, en pulvérisant l’une après l’autre.
6. Dans une hotte stérile, relâchez deux adultes CBB par GF (un total de 60 CBC sont introduits dans les boîtes en plastique). Après 30 min, couvrez les boîtes.
7. Laissez les boîtes en plastique avec les GF infestés dans une pièce ou un incubateur dans des conditions contrôlées (obscurité, 25 ± 2 °C et humidité relative 71 % ± 5 %).
8. Après 1, 7, 15 et 21 jours, comptez le nombre de fruits de foreurs et d’insectes vivants et morts à l’extérieur des fruits dans chaque boîte.
9. 20 jours après l’infestation, disséquez chaque GF sous un stéréomicroscope, grossissant 10x.
10. Comptez le nombre de graines saines ou de graines endommagées par les insectes dans chaque fruit.
11. Compter les différents stades biologiques CBB²² observés et compter le nombre d’insectes morts dans chaque graine pour déterminer la mortalité des insectes par unité expérimentale.

5. Évaluation de l’effet d’un produit après une infestation par le CBB (post-infestation) (figure 3)

1. Utilisez des groupes de 200 fruits par traitement.
2. Dans une hotte stérile, relâchez les adultes CBB (rapport 2:1 des adultes CBB aux GF) aux GF précédemment désinfectés, ce qui permet à l’infestation de se poursuivre pendant 3 h à 21 ° C.
3. Examinez les GF. Après 3 h, la plupart devraient être infestés, avec l’abdomen des CBC encore exposé (position A²⁰), comme le montre la figure 2.
4. Sélectionnez 46 GF infestés (position A) et placez-les dans des racks en plastique à 96 puits (unité expérimentale). Les fruits doivent rester dans cette position afin que le traitement puisse être directement pulvérisé sur le CBB perforant le fruit.
5. Vaporiser au moins trois fois (trois racks) par traitement, l’un après l’autre, en recouvrant les racks après 30 min.
6. Laissez les racks avec les GF infestés dans une pièce ou un incubateur dans des conditions contrôlées (obscurité, 25 ± 2 °C et humidité relative 71 % ± 5 %).
7. Après 20 jours, disséquez les GF sous un stéréomicroscope à un grossissement de 10x.
8. Comptez le nombre de graines saines ou de graines endommagées par les insectes dans chaque fruit.
9. Compter les différents stades biologiques^{CBB 22} et le nombre d’insectes morts dans chaque graine pour déterminer la mortalité des insectes par unité expérimentale.

6. Évaluation d’un produit ayant un effet dissuasif sur le CBB

1. Suivez les étapes 4.1 à 4.6 décrites pour évaluer un produit ayant un effet protecteur sur les fruits.
2. Après avoir relâché les adultes CBB dans les boîtes en plastique, comptez le nombre de CBC qui s’envolent des boîtes et le nombre qui infeste les GF. Ensuite, suivez les étapes 4.7 à 4.11.
3. Suivez les étapes 5.1 à 5.5 décrites pour évaluer le produit après l’infestation de CBB.
4. Après avoir pulvérisé chaque traitement sur les insectes en position A, comptez le nombre de CBC qui se sont déplacés hors du GF et/ou se sont envolés du GF. Ensuite, suivez les étapes 5.6 à 5.9.

7. Analyse statistique

REMARQUE: Les variables de réponse sont les pourcentages de mortalité au fil du temps et le pourcentage de graines de café saines non infestées.

1. Estimer la moyenne et l’écart-type de chaque variable de réponse pour chaque traitement.
2. Effectuer une analyse de la variance pour chaque variable de réponse avec un modèle pour un plan complètement aléatoire.
   REMARQUE: Le test de comparaison de 5% de Dunnett est effectué pour comparer les traitements au contrôle absolu (contrôle de l’eau).
3. Lorsque les traitements sont significativement différents du contrôle absolu, utilisez un test de différence la moins significative (LSD) de 5% pour comparer les traitements.
4. Évaluer la puissance du test; si elles sont supérieures à 85 %, les hypothèses de normalité et d’homogénéité des variances sont remplies.

Figure 1 : Procédure d’évaluation des effets préinfestants des insecticides sur le CBB. Étapes d’évaluation des effets préinfestation des insecticides sur Hypothenemus hampei (CBB) à l’aide de fruits verts (GF). (A) Sélection des fruits. B) Pulvérisation des insecticides sur les fruits du café. (C) Infestation de fruits de café par le CBB dans un rapport de 2:1 CBB par GF. D) Fruits infestés. E) Incubation des fruits dans des conditions contrôlées. F) Dissection des fruits. (G) Compter la population de CBB à l’intérieur des semences. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Traiter l’infestation de CBB par les fruits du café. Les fruits infestés contiennent des adultes CBB dont l’abdomen est partiellement exposé (position A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Procédure d’évaluation des effets posinfestation des insecticides sur le CBB. Étapes d’évaluation des effets post-infestation des insecticides sur le CBB à l’aide de GF. (A) Sélection des fruits. (B) Infestation des fruits par CBB dans un rapport de 2:1 CBB par GF. (C) Sélection des fruits infestés. D) Pulvérisation de l’insecticide sur les fruits. E) Incubation des fruits. F) Dissection des fruits. (G) Compter la population CBB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats ont montré que les femelles CBB reconnaissaient les fruits, et en fonction des caractéristiques de la surface du fruit et des odeurs émises, les femelles CBB ont commencé à pénétrer ou à porter les fruits dans les 3 h à 21 °C.

L’effet d’un insecticide sur le CBB lorsqu’il est appliqué sur les fruits du café (procédure de préinfestation) après 24 h et au fil du temps est illustré à la figure 4. Les deux insecticides (émulsion d’alcaloïdes à 5% et 6%) ont causé une mortalité élevée des insectes au jour 20 (tableau 1) et ont montré des différences significatives par rapport au contrôle absolu de l’eau (P < 0,001), selon le test LSD. En ce qui concerne les pourcentages de semences saines non infestées (tableau 1), il y avait également des différences entre les groupes témoins et insecticides selon le test de Dunnett à 5% (P < 0,001). Dans le groupe témoin, 37% des graines n’étaient pas infestées, tandis que l’application d’insecticides protégeait les graines, 94% des graines restant en bonne santé lors de l’utilisation de l’insecticide 2 et 89% avec l’insecticide 1.

Figure 4 : Effets préinfestation des insecticides dans la lutte contre deux groupes d’insecticides. Effets préinfestation des insecticides. Pourcentagede mortalité de H. hampei adulte évalué aux jours 1, 7, 15 et 21 après l’infestation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Effet du traitement préinfestation sur le CBB. Pourcentage de mortalité et pourcentage de graines saines après 20 jours. * Pour chaque variable, différences par rapport au témoin (eau) selon le test de Dunnett à 5%.

Les résultats de la préinfestation après 21 jours sont présentés dans le tableau 1, et les résultats au fil du temps correspondent à la figure 4. Dans ce cas, les fruits du café ont été recouverts d’une substance toxique qui provoque la mortalité des insectes. Les insectes s’imprègnent lorsqu’ils marchent sur les fruits, goûtent les fruits avec leurs palpes ou commencent à mâcher l’épiderme des fruits. De plus, les substances appliquées sur la surface du fruit peuvent altérer ou changer l’odeur naturelle du fruit, de sorte que les individus CBB peuvent arrêter le processus d’infestation, soit en s’envolant ou en préférant être séparés du fruit sans le toucher ou l’infester. Selon le moment d’action du produit, la mortalité des insectes ou le comportement d’évitement de l’infestation peut persister pendant 24 heures ou plus.

D’autre part, si les produits sont appliqués après que les insectes commencent à porter les fruits (post-infestation), les produits peuvent pénétrer dans la cuticule de l’insecte, provoquant la mortalité des insectes (tableau 2 et figure 5). La mortalité la plus élevée est survenue avec l’insecticide 2 (P < 0,01). Si la mortalité se produit rapidement, l’insecte mourra avant d’entrer dans la graine, et aucun œuf ou population d’insectes ne sera trouvé à l’intérieur des graines.

Figure 5 : Effets post-infestation des insecticides. Pourcentage de mortalité de H. hampei adulte évalué aux jours 1, 7, 15 et 21 après l’infestation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 2 : Effets du traitement post-infestation sur la CBB. Pourcentage de mortalité et pourcentage de graines saines après 20 jours. * Pour chaque variable, différences par rapport au témoin (eau) selon le test de Dunnett à 5%. Pour chaque variable, différentes lettres indiquent des différences selon le LSD 5%.

Les effets des insecticides sont reflétés sous forme de pourcentage de graines saines non infestées au jour 20 de l’évaluation (tableau 2). En raison de la mortalité élevée des insectes, l’insecte n’a pas pénétré dans les graines de café et ne les a pas endommagées. L’application des produits a protégé entre 79% et 90% des graines de café, montrant des différences par rapport au contrôle, dans lequel 57% des graines ont été jugées saines (P < 0,01). Des différences significatives ont également été observées entre les deux insecticides (P < 0,01).

Dans certains cas, les insectes sont morts très rapidement, avant même d’endommager la graine. Cependant, si la mort de l’insecte prenait plus de temps, l’insecte pourrait atteindre la graine et déposer des œufs, et plus tard, l’adulte mourra. Dans ce cas, une population d’insectes réduite a été observée à l’intérieur des graines de café par rapport à la population d’insectes trouvée dans le groupe témoin aspergé d’eau (tableau 3).

Tableau 3 : Effets post-infestation après un traitement par un champignon entomopathogène et une substance répulsive. Population d’insectes à l’intérieur des graines. Les GF ont été disséqués à 15 jours. * Pour chaque variable, différences par rapport au témoin (eau) selon le test de Dunnett à 5%. Pour chaque variable, différentes lettres indiquent des différences selon le LSD 5%.

La figure 6 montre l’effet d’un produit ayant des effets post-infestation, un entomopathogène et celui d’une substance répulsive, ainsi que leur action combinée.

Figure 6 : Effets post-infestation d’un champignon entomopathogène et d’une substance répulsive. Pourcentage de mortalité de H. hampei adulte et dommages aux graines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ces méthodologies permettent de déterminer rapidement les différents effets des produits toxiques sur le CBB.

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.