Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Le virus de la maladie de Newcastle, également connu sous le nom d’orthoavulavirus aviaire-1, est un paramyxovirus aviaire enveloppé susceptible d’être utilisé à la fois comme virus oncolytique ou comme vaccin à vecteur viral 1,2,3,4,5,6,7. Plus récemment, le NDV conçu pour exprimer la protéine de pointe du SARS-CoV-2 a été caractérisé comme un vaccin intranasal efficace dans les modèles^{de provocation de} souris et de hamster ^7,8,9. Lorsqu’il est utilisé comme immunothérapie du cancer, il entraîne le recrutement de cellules immunitaires innées, en particulier les cellules tueuses naturelles, la production d’interféron de type I et la génération de cellules T antitumorales spécifiques ^10,11,12,13. En plus de ces puissantes propriétés immunostimulantes, le NDV a un profil d’innocuité solide et un système de génétique inverse bien établi^14,15. Ces caractéristiques souhaitables ont incité à l’évaluation du VND dans de nombreux essais cliniques précliniques et humains (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Pour faire progresser ce vecteur viral immunostimulant très prometteur, des méthodes détaillées sont nécessaires pour produire et purifier le VND ultra-pur à titre élevé qui peut être administré en toute sécurité in vivo.

Comme le NDV est un paramyxovirus aviaire, il est le plus souvent amplifié dans les œufs de poule embryonnés. Bien qu’il existe des systèmes cellulaires disponibles pour la propagation du VND, la plupart n’ont pas été en mesure de produire des titres similaires à ceux obtenus dans les œufs de poule embryonnés¹⁸. Néanmoins, la production de NDV dans les œufs présente certains inconvénients, notamment le fait que la production à base d’œufs est longue et difficilement évolutive, que l’approvisionnement en grandes quantités d’œufs de poule SPF peut être problématique et qu’il existe un risque de contamination par des allergènes d’œufs 13,18,19,20 . Récemment, un groupe a montré que les cellules Vero cultivées en suspension dans un milieu sans sérum peuvent soutenir la réplication du NDV sur des titres comparables à ceux obtenus dans les œufs, avant la purification²¹. Cependant, cela nécessitait un passage en série du virus pour adapter le virus aux cellules Vero, et l’optimisation d’une méthode pour purifier le NDV des cellules Vero en suspension est toujours nécessaire²¹.

Comme nous l’avons souligné précédemment, les méthodes utilisées pour purifier le virus in vivo à titre élevé varient en fonction du virus en question²². Il existe un système de génétique inverse bien établi disponible pour la génération de NDV recombinant. Ce processus, impliquant l’utilisation d’un clone d’ADNc, de plasmides auxiliaires et d’un virus auxiliaire exprimant l’ARN polymérase T7, a déjà été décrit en détail^15,23. Ce protocole peut être appliqué au VND lentogène ou mésogénique. Le virus décrit dans ce protocole est un NDV mésogénique recombinant codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria insérée entre les gènes viraux P et M en tant qu’unité de transcription individuelle, car celle-ci a déjà été décrite comme le site optimal pour l’insertion de transgène étranger²⁴.

Les méthodes ci-jointes décrivent la purification du NDV en fonction de sa taille, allant de 100 à 500 nm, et de sa densité^{de 15}. Cela a permis la génération de stocks de NDV de qualité in vivo et à titre élevé en environ 3 semaines, à partir du moment où les œufs sont reçus jusqu’à la fin du titre. Les techniques fréquemment utilisées dans la production à grande échelle de virus à base d’œufs telles que la filtration à flux tangentiel, la filtration en profondeur et l’ultracentrifugation par gradient de densité sont décrites, permettant la traduction de ces méthodes à une production à plus grande échelle. Les techniques décrites précédemment pour la purification du VND ont été améliorées par l’incorporation d’un tampon stabilisant le virus, l’utilisation de l’iodixanol lors de l’ultracentrifugation du gradient de densité et la description de diverses mesures de contrôle de la qualité pour assurer une qualité in vivo ^{de qualité 15}. Cela a permis de purifier le NDV in vivo atteignant des titres allant jusqu’à 3 × 10¹⁰ PFU/mL de 0,8 à 1,0 L de liquide allantoïque.

Tous les travaux impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l’Université de Guelph conformément au Conseil canadien sur les soins aux animaux. Tous les travaux sont effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) au Canada où le VND mésogénique est un agent pathogène du groupe de risque 2. Toutes les étapes impliquées dans l’amplification et la purification du NDV doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique de type IIA à des fins de sécurité et de stérilité.

1. Amplification du VND à l’aide d’œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécifiés

1. Inoculation d’œufs de poule embryonnés SPF
   REMARQUE: En règle générale, huit douzaines d’œufs de poule embryonnés SPF sont utilisés pour générer un lot in vivo de NDV. Commandez une ou deux douzaines d’œufs supplémentaires pour tenir compte des dommages pendant l’expédition ainsi que de la variabilité de la viabilité. Les œufs de poule embryonnés sont du matériel biologique et doivent être manipulés conformément aux directives institutionnelles. Cependant, comme les embryons ne sont pas éclos, l’approbation du Comité de soins aux animaux de l’établissement n’est pas requise.
   1. Après avoir reçu des œufs de poule embryonnés SPF, incuber dans un incubateur à œufs à 37 ° C, 60% d’humidité pendant 9 jours. Assurez-vous que l’incubateur est réglé pour faire basculer / faire pivoter automatiquement les œufs toutes les heures.
      REMARQUE: Les œufs peuvent être conservés à température ambiante jusqu’à 24 h ou à 4 °C jusqu’à 72 h; cependant, cela peut diminuer la viabilité de l’embryon.
   2. Après 8 à 11 jours d’incubation (idéalement le jour 9), allumez les ovules pour déterminer la viabilité de l’embryon. Recherchez la vascularisation de type Web (Figure 1A) et le mouvement des embryons comme indicateurs d’embryons viables. Éliminer les œufs dépourvus de ces caractéristiques (figure 1B).
   3. Sur les œufs viables, marquez l’interface entre le sac d’air et l’embryon au crayon avec un « X » (Figure 1A). Assurez-vous que ce site d’injection ne provoquerait pas de perforation du système vasculaire. Retournez les œufs marqués à l’incubateur pendant que l’inoculum est préparé.
   4. Calculer la quantité de virus nécessaire pour injecter tous les œufs de poule embryonnés SPF. S’assurer que chaque œuf reçoit 100 UAP de virus dans un volume de 100 μL; diluer le virus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 1 × 10³ PFU/mL. Préparez 20 % supplémentaires de l’inoculum pour tenir compte des inexactitudes dans l’administration du virus.
   5. À l’aide d’une lingette antistatique, nettoyez le dessus des œufs marqués avec une solution d’iode à 10%, diluée dans de l’éthanol à 70%. Attendez environ 1-2 min pour que la solution sèche.
   6. Percez soigneusement la coquille à l’aide d’une pince à épiler stérile et pointue. Désinfectez la pince à épiler dans de l’éthanol à 70% entre les œufs.
   7. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 25 G, injecter 100 μL de l’inoculum préparé à l’étape 1.1.4 dans la cavité chorioallantoïque (Figure 1C). Approchez-vous avec l’aiguille à un angle de près de 90 ° par rapport à l’œuf. Insérez l’aiguille juste dans le haut de la membrane chorioallantoïque.
   8. Après l’inoculation, utilisez du vernis à ongles pour couvrir le site de ponction et renvoyer les œufs à l’incubateur. Assurez-vous que le réglage du basculement est activé jusqu’à 24 heures après l’inoculation.
   9. Vérifiez la viabilité des œufs 24 heures après l’inoculation. Jeter les œufs morts qui manquent de vascularisation dans la membrane chorioallantoïque et le mouvement de l’embryon (Figure 1B).
      REMARQUE: Ces œufs sont morts en raison du processus d’inoculation et non de NDV.
   10. Retournez les œufs à l’incubateur, avec le culbuteur qui se déclenche pour éviter la contamination du liquide allantoïque par des protéines d’œuf.
   11. Vérifiez les œufs toutes les 12 à 24 h comme décrit à l’étape 1.1.9 pour identifier les œufs morts. Déplacer les ovules qui meurent après 24 h après l’inoculation à 4 °C pour minimiser l’autolyse. Récoltez le liquide allantoïque dans les 2 à 12 heures suivant le refroidissement.
   12. Incuber les œufs pendant au moins 72 h.
       REMARQUE: Si vous propagez une souche mésogénique de NDV, le temps d’incubation optimal est de 60 à 72 h, car des temps d’incubation prolongés peuvent nuire au processus de purification en raison de la clarté réduite du liquide allantoïque. Ce problème n’est pas aussi important lors de la propagation de souches de NDV lentogènes car elles prennent beaucoup plus de temps à tuer l’embryon.
   13. Après la période d’incubation appropriée, déplacer les œufs restants à 4 °C pendant 2 à 12 h avant de récolter le liquide allantoïque.
2. Récolte de liquide allantoïque contenant du NDV
   1. Déplacez les œufs réfrigérés dans l’armoire de biosécurité. Nettoyez le dessus des œufs avec de l’éthanol à 70%.
   2. Utilisez une pince à épiler stérile et des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le côté apical de l’œuf où se trouve le sac d’air.
   3. Retirez la coquille pour révéler la membrane chorioallantoïque (Figure 1D).
   4. Perforez soigneusement la membrane et pelez-la pour exposer la cavité allantoïque (Figure 1E). Assurez-vous que le sac vitellin n’est pas perforé accidentellement et que cela gâchera l’œuf.
   5. Utilisez une pince émoussée pour saisir l’embryon et ouvrir le sac embryonnaire.
      REMARQUE: Le liquide à l’intérieur du sac embryonnaire contient également du VND.
   6. Déprimez l’embryon avec la pince et prélevez le liquide allantoïque à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
   7. Conserver le liquide allantoïque sur de la glace dans des tubes coniques de 15 mL jusqu’à clarification.
      REMARQUE: Si le liquide allantoïque est jaune, le sac vitellin a été compromis et le liquide allantoïque doit être jeté.
   8. Centrifuger les tubes coniques contenant le fluide allantoïque à 1 500 × g pendant 10 min à 4 °C.
   9. Point de pause : Aliquote du liquide allantoïque clarifié dans des tubes coniques de 50 mL et les stocker à -80 °C pour un stockage à long terme (p. ex., des semaines à des mois), en complétant le liquide avec du saccharose à une concentration finale de 5 % pour protéger le virus des effets néfastes du gel-dégel. Alternativement, pour un stockage à court terme (par exemple, 1 à 3 jours), complétez le liquide allantoïque avec du saccharose (5% final) ou avec 3x tampon mannitol-lysine (ML) (15% mannitol, 3% lysine; voir le tableau supplémentaire S1 pour les recettes tampons) pour obtenir une concentration finale de 1x (5% mannitol, 1% lysine) avant le stockage à 4 °C.

2. Purification du NDV à partir du liquide allantoïque

1. Filtration en profondeur du fluide allantoïque
   1. Conserver le liquide allantoïque clarifié à -80 °C et le décongeler à 4 °C la nuit avant de le purifier.
   2. Dans une armoire de sécurité biologique, installez le tube et la pompe péristaltique comme illustré à la figure 2.
   3. Si ce n’est pas déjà fait, combinez le liquide allantoïque avec 3x tampon ML à une concentration finale de 1x.
   4. Avant de fixer le filtre de profondeur, stériliser le tube en faisant passer 50 mL de NaOH de 0,5 M à travers le système dans une cuve à déchets.
   5. Rincez le tube en faisant passer 100 mL d’eau stérile de qualité moléculaire à travers le système et dans le cuve de déchets.
      REMARQUE: Comme naoh inactivera le NDV, il est important que les lignes soient correctement lavées avant d’introduire le liquide allantoïque contenant le virus.
   6. Amorcez le système en y faisant passer 50 mL de PBS, en arrêtant la pompe lorsqu’il reste environ 5 mL de PBS dans le tube.
   7. Fixez le filtre de profondeur avec un indice de rétention de 1 à 3 μM sur le tube et retirez le deuxième bouchon du côté apical du filtre de profondeur pour évacuer le filtre. Commencez à exécuter 50 mL supplémentaires de PBS via le système.
   8. Une fois que pbsur commence à circuler à travers l’évent situé en haut du filtre, fermez le port et continuez à faire circuler le PBS à travers les lignes.
      REMARQUE: Les bulles d’air mineures sont acceptables, mais la présence de grandes quantités d’air nécessitera que le filtre soit ventilé à nouveau comme décrit aux étapes 2.1.7 et 2.1.8.
   9. Arrêtez la pompe lorsqu’il reste environ 5 mL de PBS dans le tube.
   10. Remplacez la cuve de déchets par une nouvelle cuve de collecte stérile et commencez à faire couler le liquide allantoïque à travers le filtre de profondeur.
       REMARQUE: La pression ne doit pas dépasser 10 psi car cela entraîne un cisaillement du virus. La pression peut être manipulée en diminuant ou en augmentant le débit de la pompe. Si la pression commence à dépasser 10 psi et que le débit ne peut plus être diminué, un nouveau filtre de profondeur doit être utilisé. Dans ce cas, les étapes 2.1.6 à 2.1.8 doivent être effectuées avant de reprendre l’écoulement du liquide allantoïque.
   11. Une fois que tout le liquide allantoïque a traversé le filtre, faites passer 50 mL de tampon 1x ML à travers les lignes pour maximiser la récupération du virus.
   12. Recueillez le liquide jusqu’à ce que les lignes soient sèches. Conservez le virus pendant la nuit ou jusqu’à 36 h à 4 °C.
       REMARQUE: Une fois que le virus a été filtré en profondeur, poursuivez le processus de purification dans les 36 heures suivant la fin de la filtration en profondeur.
   13. Débranchez le filtre de profondeur et désinfectez le tube en faisant passer 100 mL de NaOH, 400 PPM d’eau de Javel préavertivée à 42 °C dans le système avant le stockage dans 0,5 M NaOH.
2. Filtration à flux tangentiel pour la concentration de NDV
   1. Assemblez les composants de la cassette comme illustré à la figure 3A (et comme illustré précédemment²⁵) dans une armoire de sécurité biologique.
      REMARQUE: Le collecteur et la plaque d’extrémité doivent être lavés dans un détergent et séchés avant utilisation. Les joints en silicium sont réutilisables et doivent être stockés dans 0,5 M NaOH avec la cassette.
   2. Configurez le système de filtration à flux tangentiel (TFF) (également connu sous le nom de filtration à flux croisé) dans une conformation « ouverte » (Figure 3B).
      1. Si vous utilisez une cassette pour la première fois, assemblez la cassette TFF dans la conformation Elution et rincez avec 100 mL d’eau stérile de qualité moléculaire (Figure 3C).
      2. Une fois qu’il ne reste que 5 mL d’eau dans le réservoir du réservoir, mettez la pompe en pause et modifiez la configuration du système TFF en une conformation fermée (Figure 3D).
      3. Ajouter 100 mL de NaOH 0,5 M, 400 PPM d’eau de Javel préavertissée à 42 °C au réservoir et traverser le système pendant 30 à 60 min.
      4. Mettez le flux en pause et remettez le système TFF à la configuration d’élution, en reprenant le flux pour éluer la solution de nettoyage.
      5. Lorsqu’il reste environ 5 mL dans le réservoir, mettez la pompe en pause et ajoutez 100 mL d’eau stérile de qualité moléculaire pour rincer le système.
      6. Lorsqu’il reste environ 5 mL dans le réservoir, mettez la pompe en pause et placez le système TFF dans la conformation ouverte (Figure 3B). Passez à l’étape 2.2.3.
   3. Stériliser la cassette et le tube en faisant passer 100 mL de NaOH de 0,5 M à travers le système à l’aide de la pompe péristaltique. Assurez-vous que la pression ne dépasse pas 30 psi pour maintenir l’intégrité de la cassette.
   4. Mettez la pompe en pause lorsqu’il reste environ 5 mL de NaOH de 0,5 M de NaOH dans le réservoir.
   5. Ajouter 100 mL d’eau stérile de qualité moléculaire au réservoir et recommencer à faire passer le fluide à travers la cassette. Faites tourbillonner le réservoir pour laver tout le NaOH des côtés du réservoir afin d’éviter l’inactivation du virus. Répétez l’étape de lavage du réservoir.
   6. Lorsqu’il reste environ 5 mL d’eau stérile de qualité moléculaire dans le réservoir, mettez la pompe en pause.
   7. Ajouter 100 mL de PBS au réservoir, en tourbillonnant pour s’assurer que l’eau stérile de qualité moléculaire est lavée sur les côtés. Reprendre l’écoulement du liquide à travers la cassette.
   8. Lorsqu’il reste environ 5 mL dans le réservoir, mettez la pompe en pause, ajoutez du liquide allantoïque filtré en profondeur au réservoir et reprenez le débit de la pompe.
   9. Surveillez le manomètre 1 (Figure 3B) pour vous assurer qu’il ne dépasse pas 10 psi afin d’éviter le cisaillement du virus. Utilisez une combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et de l’utilisation de pinces C pour augmenter l’élution des déchets.
      REMARQUE: La combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et des pinces C entraînera une augmentation de la pression.
   10. Lorsqu’il reste 50 à 100 mL de liquide allantoïque dans le réservoir, mettez la pompe en pause pour effectuer un échange de tampon en ajoutant 150 à 200 ml de tampon 1x ML.
   11. Reprendre le débit de la pompe, en surveillant à nouveau le manomètre 1 (Figure 3B) pour s’assurer qu’il ne dépasse pas 10 psi.
   12. Lorsqu’il reste 5 à 10 mL dans le réservoir, mettez la pompe en pause.
   13. À l’aide de deux pinces C, fermez les deux conduites de déchets comme illustré à la figure 3C.
   14. Découplez la ligne de rétentat alimentant le réservoir et insérez-la dans un tube conique de 50 mL (figure 3C).
   15. Reprendre le débit de la pompe, en s’arrêtant lorsqu’il reste quelques gouttes de liquide dans le réservoir du réservoir.
   16. Retirez les pinces C des conduites de déchets et rattachez la conduite d’alimentation en rétentat au réservoir (Figure 3B).
   17. Ajouter 20 à 25 mL de tampon ML 1x et reprendre le débit de la pompe jusqu’à ce qu’il reste environ 5 mL dans le réservoir.
   18. Répétez les étapes 2.2.13 à 2.2.16.
       REMARQUE: Une^3ème élution peut être effectuée en répétant les étapes 2.2.17 et 2.2.13 à 2.2.16 pour augmenter le rendement en virus. Cependant, la majeure partie du virus est présente dans les deux premières élutions.
   19. Après avoir terminé les élutions, placer le virus sur de la glace ou à 4 °C.
   20. Pour nettoyer les lignes, configurez le système de manière à ce qu’il s’agisse d’un format en boucle fermée (Figure 3D) avec les lignes de déchets alimentant le réservoir comme illustré à la Figure 3D.
   21. Procéder au nettoyage du système en ajoutant 250 mL de NaOH 0,5 M, 400 PPM d’eau de Javel préavertissée à 42 °C.
   22. Faites circuler la solution de nettoyage dans le système pendant la nuit.
       REMARQUE: Lors de la recirculation de la solution de nettoyage, si la pompe fonctionne à une vitesse de 50 mL / min, une pression d’environ 5 psi doit être observée. Si la pression dépasse cela, la cassette est sale et la solution de nettoyage doit être remplacée et le processus répété.
   23. Éluez la solution de nettoyage en dirigeant les lignes de déchets et la ligne de rétentat dans un conteneur à déchets.
   24. Ajouter 400 à 500 mL d’eau stérile au réservoir et l’écouler dans le système et dans les poubelles.
   25. Lorsqu’il reste environ 5 mL dans le réservoir, mettez la pompe en pause et ajoutez 100 à 200 mL de NaOH de 0,5 M de NaOH au réservoir, en faisant tourbillonner la solution pour laver le réservoir du réservoir.
   26. Une fois que le réservoir est presque vide, répétez l’étape 2.2.23 deux fois de plus.
   27. Démontez la configuration TFF, en stockant la cassette TFF et les joints dans un petit volume de 0,5 M NaOH dans un sac en plastique refermable à 4 °C.
       REMARQUE: Les tubes peuvent être stockés à température ambiante immergés dans 0,5 M NaOH.
3. Ultracentrifugation du gradient de densité de l’iodixanol
   1. Allumez l’ultracentrifugeuse et réglez-la sur prérefroidir à 4 °C. Prérefroidissez également le rotor souhaité à 4 °C (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les rotors doivent être conservés à 4 °C.
   2. Utilisez la solution d’iodixanol à 60 % (concentration au moment de l’achat) pour générer des solutions d’iodixanol à 40 %, 20 % et 10 % en diluant avec du PBS et du tampon ML 3x jusqu’à une concentration finale de 1x de tampon ML.
   3. Dans un tube ultracentrifuge à paroi mince à toit ouvert de 13,2 mL, superposer 0,5 mL, 2,5 mL et 2,5 mL des solutions d’iodixanol à 40 %, 20 % et 10 % (figure 4A).
      REMARQUE: Incliner le tube d’ultracentrifugation sur le côté et expulser lentement la solution réduira considérablement le risque de mélange des deux couches de gradient. La séparation de chaque couche doit être évidente, avec un « halo » visible entre chaque couche du gradient.
   4. Utilisez un stylo marqueur pour marquer les interfaces des différents calques de dégradé.
   5. Couche 6-6,5 mL du virus élué de la procédure TFF sur le gradient de densité. Ajoutez soigneusement le virus comme décrit à l’étape 2.3.3 pour éviter de perturber le gradient de densité.
   6. Chargez les tubes d’ultracentrifugation dans les inserts du rotor à godet oscillant (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une échelle à toit ouvert pour équilibrer les inserts à moins de 0,01 g les uns des autres. Utilisez pbS ou un éluant de virus supplémentaire pour tenir compte des différences de poids.
   7. Une fois les tubes équilibrés, boucher les tubes et les charger dans le rotor.
   8. Centrifuger pendant 1,5 h à 125 000 × g à 4 °C.
      REMARQUE: Cela peut être effectué pendant la nuit si une ultracentrifugeuse avec capacité de démarrage différé est disponible.
   9. Après ultracentrifugation, retirer les tubes à l’aide d’une paire de pinces stériles. Recherchez la bande cible - une grande bande - entre les gradients de 10 % et 20 % (Figure 4B).
   10. Suspendez le tube sur le dessus d’un bécher à l’aide d’un support d’autoclave.
   11. Fixez une aiguille de 18 G x 1,5 pouce à une seringue de 5 mL et perforez le côté du tube ultracentrifuge.
       REMARQUE: Le tube doit être perforé légèrement en dessous de la bande cible, avec l’aiguille sur un angle ascendant et biseauté de manière à ce qu’elle se déplace dans la bande cible.
   12. Étendez lentement le piston pour retirer la bande cible.
       REMARQUE: Déplacez l’aiguille dans la bande cible pour maximiser le virus extrait. Veillez à ce que d’autres bandes ou débris ne se mélangent pas à la bande cible et évitez de prendre un excès de solution, car cela entraînerait l’utilisation de plus de cassettes de dialyse.
   13. Une fois la bande cible extraite, retirez l’aiguille et laissez la solution restante s’écouler dans le bécher à déchets. Distribuer la bande cible dans un tube conique de 50 mL jusqu’à ce que toutes les bandes de tous les autres tubes ultracentrifuges aient été extraites.
   14. Répétez les étapes 2.3.10 à 2.3.13 jusqu’à ce que toutes les bandes cibles aient été extraites de tous les tubes ultracentrifuges.
   15. Autre approche pour extraire les bandes cibles décrite aux étapes 2.3.10 à 2.3.13
       1. Retirez lentement le liquide recouvrant la bande cible à l’aide d’une pipette. Une fois dans la bande cible, extraire à l’aide d’une pipette et stocker le virus dans un tube conique de 50 mL.
          REMARQUE: Cela permet de réutiliser les tubes ultracentrifuges.
4. Élimination de l’iodixanol de la solution virale
   REMARQUE: La bande contenant du NDV apparaît à une densité d’iodixanol comprise entre 15% et 16%. La concentration d’iodixanol dans la solution peut être déterminée en mesurant l’absorbance à 340 nm par rapport à une courbe étalon (figure supplémentaire S1). Cette étape peut être omise car aucun effet indésirable ou toxicité aiguë n’a été observé lorsque des solutions d’iodixanol de cette concentration ont été administrées à des souris en C57BL/6.
   1. Préemballez une cassette de dialyse de coupure de 0,5 à 3 mL de 10 kDa en la submergeant dans pbS pendant 1 min.
      REMARQUE: La membrane de dialyse devrait passer d’un aspect lisse à un aspect ébouriffé ou bosselé. Si le volume du virus extrait dépasse 10 mL, deux cassettes de dialyse de 0,5 à 3 mL ou une cassette de dialyse de 5 à 12 mL doivent être utilisées.
   2. Le cas échéant, utilisez une seringue de 5 ou 10 mL et une aiguille de remplissage émoussée de 18 G x 1,5 pouce pour prélever le virus dans le tube conique de 50 mL.
   3. Utilisez la seringue pour entrer dans la cassette de dialyse, en prenant soin de ne pas percer la membrane et d’injecter le virus.
      REMARQUE: La cassette de dialyse peut être tournée pour manipuler le positionnement de la poche d’air dans la cassette. La poche d’air doit être retirée avant de retirer l’aiguille de la cassette.
   4. Remplissez un bécher de 1 L avec du PBS stérile 1x, placez une barre de remuage et la cassette de dialyse à l’intérieur, et couvrez. Incuber à 4 °C en remuant doucement.
      REMARQUE: Utilisez de la mousse de polystyrène extrudé et une bande élastique pour fixer la cassette de dialyse afin qu’elle flotte dans le PBS. La cassette peut gonfler légèrement en raison du tampon ML.
   5. Après 1-2 h, remplacer par 1x PBS frais et continuer à incuber à 4 °C pendant encore 8-10 h en remuant légèrement.
      REMARQUE: Cela peut également être fait du jour au lendemain.
   6. Remplacer par 1x PBS frais une fois de plus, incubation à température ambiante pendant 1-2 h.
5. Concentration de la solution virale
   1. Retirez la cassette de dialyse du tampon de dialyse (Figure 4C) et placez-la dans un petit sac en plastique scellable. Ajouter 15-25 mL de 40% 20 000 MW de polyéthylène glycol afin que la cassette de dialyse soit complètement immergée.
   2. Incuber à température ambiante avec bercement. Vérifiez périodiquement le volume de virus dans la cassette à l’aide d’une seringue de 5 ou 10 mL et d’une aiguille de remplissage émoussée de 18 G x 1,5 pouce.
      REMARQUE : Le temps nécessaire pour concentrer le virus varie en fonction du volume de départ et du volume de fin souhaité. En règle générale, le volume final souhaité est compris entre 1 et 1,5 mL, quel que soit le volume de départ du liquide allantoïque. Lors de la vérification du volume, veillez à ne pas utiliser le même port, car cela compromettrait l’intégrité du port et pourrait entraîner le mélange de la solution de polyéthylène glycol et du virus.
   3. Avant de retirer le virus concentré de la cassette de dialyse, rincez brièvement la cassette dans 1x PBS et remplissez d’air une aiguille de remplissage émoussée de 18 G x 1,5 pouce.
   4. Insérez la seringue remplie d’air dans la cassette de dialyse et appuyez sur le piston. Faites pivoter l’appareil de sorte que le virus concentré puisse être éliminé sans enlever l’air introduit.
   5. Distribuer le virus concentré dans un tube conique de 50 mL, en notant le volume distribué.
   6. À l’aide de la même seringue et de la même aiguille, injecter une quantité appropriée de saccharose à 60 % dans la cassette de dialyse de sorte que, lorsqu’elle est combinée avec le virus précédemment retiré, elle soit à une concentration finale de 5 % de saccharose.
   7. Utilisez des doigts gantés pour masser la membrane afin de déloger le virus résiduel qui peut avoir adhéré à la membrane, en prenant soin de ne pas l’endommager. Retirez une partie de l’excès d’air dans la cassette de dialyse pour faciliter le processus de délogement.
   8. Combinez ce lavage avec le virus déjà dans le tube conique de 50 mL.
      REMARQUE: Le virus est maintenant dans du saccharose à 5% et prêt à être distribué dans des aliquotes de 20 μL, 50 μL, 100 μL ou 200 μL et stocké à -80 ° C. Alternativement, pour le stockage à long terme, le NDV peut être lyophilisé et stocké à 4 °C comme décrit à la section 2.6.
6. Lyophilisation de la NDV
   1. Lyophiliser le virus alicité dans des tubes centrifuges de 1,5 mL ou des tubes coniques de 15 mL à 44 × ^10-3 MBAR et -52 °C pendant 16 h.
   2. Conserver les échantillons lyophilisés à 4 °C sans réduction significative du titre viral.

3. Essais de contrôle de la qualité

1. Isolement de l’ARN viral et PCR à transcription inverse pour la confirmation du génome
   1. Décongeler une aliquote virale de 20 μL. Suivez le protocole d’isolement de l’ARN viral fourni avec le kit.
   2. Utilisez immédiatement l’ARN isolé comme modèle pour la PCR à transcription inverse (RT-PCR) ou stockez-le à -80 °C.
   3. Préparer les réactions de transcription inverse comme décrit dans le protocole fourni par le fabricant.
   4. Utilisez l’ADNc résultant comme modèle pour diverses réactions de PCR de contrôle de la qualité afin de confirmer le pathotype du VND (tableau 1, ensemble d’amorces de protéines F) et la présence d’éléments de contrôle des gènes requis (tableau 1, ensemble d’amorces transgéniques).
      REMARQUE: Les amorces doivent être conçues en fonction de la souche de NDV propagée.
      1. Pour séquencer le site de clivage de la protéine F, le principal déterminant du pathotype, utilisez l’ensemble d’amorces de la protéine F (tableau 1). Recherchez un produit PCR de 435 paires de bases de longueur.
         REMARQUE: Ici, les amorces ont été conçues sur la base de la souche LaSota de NDV (accession Genbank AF077761.1). Il est bien établi que l’expression optimale du transgène se produit lorsqu’un transgène étranger est inséré entre les gènes P et M²⁴.
      2. Utilisez l’ensemble d’amorces transgéniques pour confirmer l’intégrité des éléments de début et de fin de gène du gène du transgène. Séquencer le produit PCR pour confirmer l’intégrité de la séquence de début et de fin de gène.
   5. Envoyez les produits PCR pour le séquençage de l’ADN et comparez-les au modèle pour l’homologie.
2. Coloration SDS PAGE et Coomassie pour détecter les protéines contaminantes
   1. Coulée d’un gel SDS PAGE à gradient de densité en préparant d’abord des solutions de polyacrylamide à 6% et 15% (tableau supplémentaire S1). Utiliser une pipette de 10 mL pour aspirer 5 mL de la solution à 15 %, suivie de 5 mL de la solution à 6 %.
   2. Retirez la pipette de la solution et générez une bulle d’air en aspirant brièvement l’air.
      REMARQUE: Lorsque la bulle d’air se déplace vers le haut, cela mélange la solution pour créer le dégradé SDS PAGE.
   3. Distribuer la solution dans l’appareil de coulée et laisser se solidifier pendant 30 min.
   4. Dans un volume final de 20 μL, mélanger une aliquote de virus avec 4x tampon réducteur (tableau supplémentaire S1) de sorte que la concentration finale soit de 1x, et faire bouillir pendant 10 min à 95 °C dans un thermocycleur. Chargez au moins 1 × 10⁷ PFU du virus.
   5. Immergez la PAGE SDS dans la mémoire tampon en cours d’exécution (tableau supplémentaire S1) et chargez les échantillons.
   6. Faire fonctionner le gel à 120 V pendant 1-1,5 h.
   7. Retirez le gel du tampon en cours d’exécution et transférez-le dans un récipient plus petit.
   8. Ajouter la solution de coloration coomassie (tableau supplémentaire S1) pour couvrir le gel. Incuber à température ambiante pendant 4-5 h.
   9. Retirez la solution de coloration et ajoutez la solution de teinture (tableau supplémentaire S1), en incubant pendant 4-8 h à température ambiante avec agitation. Changez la solution de destain trois à quatre fois.
      REMARQUE: Le gel doit être clair et sa couleur doit être telle qu’elle était avant la coloration.
   10. Imagez le gel sur un réglage colorimétrique. Voir la figure 5 pour une image représentative d’un gel SDS PAGE coloré par Coomassie contenant des échantillons de liquide allantoïque et de virus purifié.
3. Quantification du titre viral infectieux par dose infectieuse médiane de culture tissulaire (TCID₅₀) et dosage d’immunofluorescence
   REMARQUE: Les cellules Vero peuvent être utilisées comme alternative aux cellules DF1; cependant, l’effet cytopathique (EPC) est moins prononcé dans les cellules Vero. Le NDV hébergeant la mutation L289A, qui améliore la fusogénicité, et exprimant GFP entre les gènes P et M est utilisé dans ce test.
   1. Ensemencez une plaque de 96 puits de cellules DF1 à 20 000 cellules/puits dans un volume de 80 μL la veille de l’utilisation du DMEM complété par 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 125 μg/mL de trypsine. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂.
   2. Le lendemain, décongeler une aliquote de virus de 20 μL sur la glace.
   3. Utilisez des tubes de 1,5 mL pour préparer les dilutions en série. Commencez par diluer 10 μL du virus avec 990 μL de PBS pour préparer une dilution de ^10-2 . Préparer toutes les autres dilutions, jusqu’à ^10-10 au minimum, faites avec 900 μL de PBS et l’ajout de 100 μL de la dilution précédente.
      REMARQUE: Utilisez une nouvelle pointe de pipette lorsque vous vous déplacez entre les dilutions.
   4. Utilisez 20 μL de chaque dilution pour infecter chaque puits de la plaque de 96 puits, comme le montre la figure 6.
      REMARQUE : Le volume final dans chaque puits sera de 100 μL.
   5. Incuber la plaque pendant au moins 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂, avant d’examiner la présence de CPE/GFP ou d’effectuer un dosage d’immunofluorescence indirecte (IFA).
      REMARQUE : Dans ces conditions de culture, le CPE est évident après 10 h (figure 7A-D), augmentant au cours des 24 heures suivantes (figure 7E-H). La plaque peut être incubée plus longtemps pour améliorer l’intensité du CPE si elle est notée par GFP ou CPE.
      1. Si vous notez par CPE ou GFP et n’exécutez PAS IFA, passez à l’étape 3.3.18.1.
   6. Si vous effectuez l’IFA, rincez les cellules deux fois avec 100 μL de 1x PBS.
   7. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans du PBS à chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   8. Lavez les cellules 3x 5 min chacune avec 100 μL de 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
   9. Perméabiliser les cellules par addition de 100 μL de 0,1% de NP-40 dans le PBS et les incuber à température ambiante pendant 10 min.
   10. Lavez les cellules 3x 5 min avec 100 μL de 0,1% PBS-T.
   11. Ajouter 100 μL de tampon bloquant composé de 5 % (V/V) de sérum de chèvre normal dilué dans du PBS-T à 0,1 % pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
   12. Ajouter 100 μL par puits d’anticorps ribonucléoprotéine anti-NDV primaire de souris dilué dans 0,1 % de PBS-T à 1 μg/mL, en incubation pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
   13. Lavez les cellules 3x pendant 5 min dans 100 μL de PBS-T à 0,1 %.
   14. Ajouter 100 μL d’un anticorps secondaire anti-souris AlexaFluor 488 Goat dilué dans 0,1 % de PBS-T à 2 μg/mL. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
   15. Lavez les cellules 3x pendant 5 min dans 100 μL de PBS-T à 0,1 %.
   16. Après le lavage final, laissez les cellules dans 100 μL de PBS-T à 0,1 %.
   17. Imagez les puits à l’aide d’un microscope fluorescent inversé.
   18. Lors de l’exécution de l’IFA, recherchez une fluorescence supérieure à celle observée dans les puits témoins négatifs, indiquant que le puits est positif pour le NDV, comme le montre la figure 8.
       1. Recherchez la présence de syncytie et de grandes cellules arrondies qui caractérisent le CPE NDV. Si vous marquez des puits infectés par un virus qui exprime la GFP, recherchez la présence de GFP.
   19. Entrez les informations appropriées dans le calculateur de titre Spearman-Karber²⁶ pour déterminer la PFU/mL du virus (Tableau 2). Voir la figure 6 pour un exemple de plaque de titre TCID₅₀ .
4. Quantification du titre viral par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
   REMARQUE: Un kit qRT-PCR en une étape est recommandé pour gagner du temps et réduire la manipulation des échantillons. Un test basé sur une sonde est utilisé pour augmenter la spécificité de la détection des séquences virales.
   1. Créer une courbe standard d’une quantité connue des séquences virales (figure supplémentaire S2A,B).
      REMARQUE: Cela peut être fait en achetant un fragment d’ADN double brin synthétique de 500 bp du gène NDV L. La séquence d’un fragment de 500 pb du gène NDV L peut être vue dans la figure supplémentaire S2C.
   2. Convertir la quantité de fragment d’ADN du virus (généralement fournie sous forme de nanogrammes ou de femtomoles par les fabricants) en nombre de molécules ou de copies de fragment d’ADN en utilisant le nombre d’Avogadro et la formule des moles en molécules (Eq (1)).
      (1)
   3. Préparez les échantillons de courbe standard en préparant une série de dilution décuplée de copies connues de fragments d’ADN de virus, à partir de 1,00 ×^{10 10} copies jusqu’à 1,00 × 10⁰ copies.
   4. Pour déterminer la quantité d’ARN NDV dans des échantillons inconnus, extrayez l’ARN NDV à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. Suivez le protocole fourni avec le kit. Une fois l’ARN extrait, suivez le protocole recommandé fourni dans le kit qRT-PCR en une seule étape.
   5. Exécuter les réactions dans un instrument de PCR en temps réel avec les conditions de température et de cycle suivantes: 1) un cycle de transcription inverse à 55 °C pendant 10 min; 2) un cycle de dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min; et 3) 40 cycles de dénaturation (95 °C pendant 10 s), d’extension (60 °C pendant 30 s) et d’acquisition de signaux fluorescents.
   6. Une fois le test qRT-PCR terminé, générez la courbe standard basée sur les échantillons de courbe standard à l’aide du logiciel d’instrument PCR en temps réel (figure supplémentaire S2A, B).
      REMARQUE: Le logiciel calculera également la quantité d’ARN NDV dans des échantillons inconnus en fonction de la courbe standard.
5. Tests de sécurité pour la toxicité aiguë chez la souris
   1. Injecter 1 × 10⁸ UFC du virus par voie intraveineuse via la veine caudale à trois souris BALB/C âgées de 8 semaines pour évaluer la toxicité aiguë.
   2. Surveillez les souris pour détecter les événements indésirables tels que la perte de poids (>20%), la posture voûtée, le pelage ébouriffé, la léthargie et les changements dans la respiration. Évaluez trois à quatre fois par jour au cours des 48 premières heures. Comme les souris devraient commencer à récupérer après 48 h, surveillez-les une à deux fois par jour jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.
      1. Administrer des solutions salines par voie sous-cutanée et des soins de soutien au besoin. Par exemple, complétez avec du gel diététique de récupération, du beurre d’arachide ou utilisez des rondelles chauffantes. Euthanasier les souris qui ont atteint les critères d’évaluation, tels que décrits dans les lignes directrices de l’établissement de soins aux animaux, par surdosage d’isoflurane suivi d’une luxation cervicale.

Récolte du liquide allantoïque
Comme le liquide allantoïque est récolté à partir d’œufs de poule embryonnés, il devrait sembler clair et transparent. Si le fluide semble opaque et jaune, cela indique la présence de contaminants. L’inclusion de ce fluide allantoïque pendant la purification entravera le processus de purification, car la pression augmentera rapidement et dépassera 10 psi, entraînant le cisaillement du virus et la perte du virus infectieux. Le liquide allantoïque qui semble sanglant suggère que les œufs ont été inoculés avec trop de PFU de virus. Le rendement de ce lot d’œufs sera nettement inférieur aux prévisions et il est peu probable que ce virus puisse être utilisé in vivo. Les ovules inoculés avec le VND lentogène doivent toujours avoir un système vasculaire évident après 72 h et les embryons ne doivent pas être morts, comme le montre la figure 1. S’ils l’ont fait, cela suggère que l’embryon a été endommagé ou contaminé d’une manière ou d’une autre.

Ultracentrifugation du gradient de densité de l’iodixanol
Après l’ultracentrifugation, une bande blanche à haut titre contenant du NDV doit être située entre les gradients de 10 % et de 20 % (figure 4B).

Coloration De Coomassie des gels SDS-PAGE
La figure 5 illustre la différence entre un virus non purifié (voie 2) et un virus purifié (voie 3). Une comparaison des deux montre une diminution significative de l’intensité des bandes protéiques contaminantes et l’émergence de bandes NDV dominantes dans le stock de virus purifié.

Quantification du titre viral par TCID50
Si l’on utilise les conditions recommandées lors du titrage d’un stock concentré de VND, le CPE doit être évident après 24 h (figure 6). Par rapport à une souche lentogène NDV de titre similaire, le CPE est plus prononcé dans la souche mésogénique au même moment.

Analyse de toxicité aiguë chez des souris BALB/C âgées de 8 semaines
Lorsque 1 × 10à 8 UFC ont été administrés par voie intraveineuse, les souris doivent être surveillées pour détecter les effets indésirables tels que la perte de poids >20%, le pelage ébouriffé, la posture voûtée et une respiration anormale. Au cours des 24 à 36 premières heures, les souris commenceront à perdre du poids et développeront probablement des manteaux ébouriffés et une posture voûtée. Cependant, si le virus est suffisamment pur, les souris commencent à récupérer, comme l’ont observé la prise de poids et l’amélioration de la posture et de l’état du pelage après 36 h. Les souris qui ne présentent pas ces signes de rétablissement à 36 heures doivent continuer à faire l’objet d’une surveillance étroite pour les critères d’évaluation. En règle générale, cela s’est produit en raison d’un tittering inexact, potentiellement dû à l’agrégation de particules virales.

Figure 1 : Infection et récolte de NDV à partir d’œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécifiés. (A) Vascularisation en forme de toile (flèches) qui devrait être apparente après 9 jours d’incubation en plus du mouvement de l’embryon. « X » désigne l’interface entre la membrane chorioallantoïque et la cavité d’air, et où le trou doit être créé pour l’inoculation de l’œuf. (B) Image représentant un embryon mort. Notez l’absence de vascularisation weblike. Un manque de mouvement de l’embryon sera également observé. (C) Diagramme des composants d’un œuf de poule embryonné montrant l’emplacement de la cavité de l’air, du sac vitellin, du sac amniotique, de la membrane chorioallantoïque et du liquide allantoïque. (D) Retrait de la coquille pour exposer la membrane choriallantoïque. (E) Illustre à quoi devraient ressembler le liquide allantoïque et l’embryon après l’ouverture de la membrane chorioallantoïque. Abréviation : NDV = virus de la maladie de Newcastle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma décrivant l’assemblage général de l’appareil utilisé pour la filtration en profondeur. Assurez-vous que le manomètre est installé en amont du filtre de profondeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Configuration de la filtration à flux tangentiel dans ses différentes configurations. Les flèches indiquent la direction de l’écoulement du fluide. (A) Illustration de la façon dont la cassette TFF est assemblée. (B) Schéma du système TFF dans sa configuration « ouverte » utilisé lors de la purification et de la concentration du fluide. (C) Schéma de la configuration du TFF lorsque le fluide est élué du système, tel qu’il est utilisé lors de l’élution du virus et de la solution de nettoyage. D) Schéma du système TFF dans sa configuration « fermée », qui est utilisé lors du nettoyage du système TFF. Abréviation : TFF = Filtration à écoulement tangentiel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Ultracentrifugation et dialyse du gradient de densité du virus concentré à partir de TFF. (A) Schéma montrant la composition du gradient de densité de l’iodixanol. (B) Schéma de baguage du virus à la suite de l’ultracentrifugation du virus produit à l’aide d’un tampon ML pendant le processus de purification. La bande principale contenant le virus est désignée par un ovale noir. (C) Taille typique d’une cassette de dialyse chargée de 10 mL de virus préparée à travers un gradient d’iodixanol à la fin de la procédure de dialyse. Abréviation : TFF = Filtration à écoulement tangentiel; ML = Mannitol-Lysine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Gel SDS-PAGE taché de Coomassie. Gel compare la présence de protéines contaminantes entre les stocks de VND mésogéniques non purifiés (voie 2) et purifiés (voie 3) lorsque 1 × 10à 5 PFU ont été chargés. Voies 1 et 4 = échelle de masse moléculaire (MW). NDV HN, F0, et ses sous-unités après clivage, F1 et F2, ainsi que leurs poids moléculaires respectifs27 sont indiqués en police blanche. Abréviations : SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide; NDV = virus de la maladie de Newcastle; PFU = unités formant de la plaque; HN = hémagglutinine; F0 = Fusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Exemple d’une disposition de plaque de 96 puits utilisée pour déterminer le titre de virus par TCID50. La plaque est divisée en 12 colonnes, chaque colonne représentant une dilution en série différente. Les puits positifs (déterminés par le CPE, l’expression transgénique ou l’IFA) sont indiqués en gris. Compte tenu du nombre de puits positifs dans cet exemple, le titre attendu après l’utilisation du calculateur de titre spearman-Karber (tableau 2) est répertorié à la fois dans TCID50/mL et PFU/mL. Abréviations : TCID50 = dose infectieuse médiane de culture tissulaire; CPE = effet cytopathique; IFA = dosage d’immunofluorescence; PFU = unités formant de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Comparaison de l’EPC suite à l’infection des cellules DF1 par le VND lentogène ou mésogénique. Un MOI de 0,5 a été utilisé après 10 h d’incubation (A-D) ou 24 h d’incubation (E-H) dans différentes conditions de culture de DMEM + 15 % FBS, DMEM + 15 % FBS + 5 % de liquide allantoïque, ou DMEM + 2 % FBS + 125 μg/mL de trypsine. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : CPE = effet cytopathique; NDV = virus de la maladie de Newcastle; MOI = multiplicité de l’infection; FBS = sérum bovin fœtal; DMEM = Milieu de l’aigle modifié de Dulbecco. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Exemple d’une situation où l’IFA est nécessaire pour titrer un NDV lentogène dépourvu de transgène GFP. Les cellules Vero ont été cultivées dans du DMEM contenant 2 % de FBS et 125 μg/mL de trypsine. Les images ont été prises à partir de la dilution série 10-7. (A) Image en champ clair des cellules infectées. (B) Illustre l’apparence typique des cellules colorées lorsque l’IFA est utilisé pour détecter le virus. (C) Une image fusionnée de (A) et (B). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : IFA = dosage d’immunofluorescence; NDV = virus de la maladie de Newcastle; GFP = protéine fluorescente verte; FBS = sérum bovin fœtal; DMEM = Milieu de l’aigle modifié de Dulbecco. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Amorces de PCR et de RT-qPCR pour la détection des segments de gènes du virus de la maladie de Newcastle. Ensembles d’amorces utilisés pour l’amplification spécifique de deux régions du génome NDV. L’ensemble d’amorces de la protéine F entraîne l’amplification d’une région de la protéine F qui couvre le site de clivage de la protéine F. L’ensemble d’amorces transgéniques amplifie la région intergénique entre les gènes de la phosphoprotéine et de la matrice, le site d’insertion optimal du transgène. Ce tableau contient également les séquences d’amorce qui ciblent le gène viral L21 et la sonde du gène L utilisée dans le test qRT-PCR. Abréviations : PCR = réaction en chaîne par polymérase; RT-qPCR = PCR quantitative à transcription inverse; NDV = virus de la maladie de Newcastle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Calculatrice de titre Spearmann-Karber. Cette feuille de calcul interactive contient le flux de travail et les équations appropriés pour déterminer la concentration de virus à l’aide des résultats TCID50 basés sur l’inoculum de puits en mL, le schéma de dilution et le nombre de répétitions par dilution. La concentration est rapportée sous forme de volume en mL nécessaire pour infecter 50 % des cultures tissulaires (TCID50) et des unités formant de la plaque par mL de suspension virale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire S1 : Détermination des concentrations d’iodixanol. (A) Courbe étalon générée à partir de l’absorbance de solutions de concentration connue d’iodixanol à 340 nm. (B) La courbe standard et l’équation de (A) ont été utilisées pour déterminer la concentration d’iodixanol en solution après ultracentrifugation par gradient de densité, dialyse et concentration de polyéthylène glycol. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Amplification et courbe standard générées par le test qRT-PCR d’un fragment d’ADN double brin synthétique de 500 pb du gène NDV L. L’amplification (A) et la courbe standard (B) ont été créées à partir d’échantillons contenant une dilution en série décuplée (1,0 × 109 copies à 1,0 × 100 copies) du fragment d’ADN. Pour la courbe d’amplification et standard, les échantillons contenant 1,0 × 101 copies et 1,0 × 100 copies étaient en dessous du seuil et ne produisaient pas une valeur de point de croisement inférieure à 35 Cp. La courbe standard finale a été générée sur la base d’échantillons contenant 1,0 × 109 copies à 1,0 × 102 copies du fragment d’ADN. (C) Séquence d’ADN du fragment de gène L de 500 nucléotides NDV utilisé pour générer la courbe standard dans le protocole qRT-PCR. Abréviations : PCR = réaction en chaîne par polymérase; RT-qPCR = PCR quantitative à transcription inverse; NDV = virus de la maladie de Newcastle; Cp = point de passage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Chargement et extraction du VND à partir de la cassette de dialyse. (A) La taille typique d’une cassette de dialyse après avoir été chargée d’environ 10 mL de solution contenant un virus isolée d’un gradient de densité de saccharose et imagée à la fin de l’étape de dialyse. (B) Un exemple des résultats obtenus lors de l’utilisation de l’ultracentrifugation par gradient de densité de l’iodixanol sans supplémentation en tampon ML. Encerclé est la bande virale cible à supprimer. Les flèches indiquent une bande supplémentaire pouvant contenir des virions endommagés. Notez qu’après l’incorporation du tampon ML dans le processus de purification, cette bande n’est plus apparente. Abréviations : NDV = virus de la maladie de Newcastle ; ML = mannitol-lysine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Fournit les étapes requises pour générer des solutions de transfert Western et un tampon ML utilisé pendant le processus de purification. Abréviations : SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide; TEMED = tétraméthyléthylènediamine; ML = Mannitol-lysine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.