Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement > 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.
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Article de méthode
Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), également connu sous le nom de sérotype 1 de l’orthoavulavirus aviaire, est un virus à ARN simple brin à sens négatif qui a été développé à la fois comme virus oncolytique et comme vaccin à vecteur viral. Le NDV est un agent thérapeutique et prophylactique attrayant en raison de son système génétique inverse bien établi, de ses puissantes propriétés immunostimulantes et de son excellent profil d’innocuité. Lorsqu’il est administré sous forme de virus oncolytique ou de vaccin à vecteur viral, le NDV provoque une réponse immunitaire robuste antitumorale ou spécifique à l’antigène, activant à la fois les bras innés et adaptatifs du système immunitaire.
Compte tenu de ces caractéristiques souhaitables, le NDV a été évalué dans de nombreux essais cliniques et est l’un des virus oncolytiques les plus étudiés. À l’heure actuelle, deux essais cliniques enregistrés portant sur le NDV sont menés : l’un évaluant un vaccin recombinant à vecteur NDV pour le SARS-CoV-2 (NCT04871737) et l’autre évaluant un NDV recombinant codant pour l’interleukine-12 en association avec Durvalumab, un anticorps antiPD-L1 (NCT04613492). Pour faciliter l’avancement de ce vecteur viral très prometteur, des méthodes simplifiées pour générer du VND (VND) recombinant (RNDV) à titre in vivo à haute teneur sont nécessaires.
Cet article décrit une procédure détaillée pour amplifier le rNDV dans des œufs de poule embryonnés sans agent pathogène spécifié (FPS) et purifier le rNDV du liquide allantoïque, avec des améliorations pour réduire les pertes pendant la purification. Sont également incluses des descriptions des tests de contrôle de la qualité recommandés, qui devraient être effectués pour confirmer l’absence de contaminants et l’intégrité du virus. Dans l’ensemble, cette procédure détaillée permet la synthèse, la purification et le stockage de NDV à haute teneur , in vivo, recombinant, lentogène et mésogénique pour une utilisation dans des études précliniques.
Introduction
Le virus de la maladie de Newcastle, également connu sous le nom d’orthoavulavirus aviaire-1, est un paramyxovirus aviaire enveloppé susceptible d’être utilisé à la fois comme virus oncolytique ou comme vaccin à vecteur viral 1,2,3,4,5,6,7. Plus récemment, le NDV conçu pour exprimer la protéine de pointe du SARS-CoV-2 a été caractérisé comme un vaccin intranasal efficace dans les modèlesde provocation de souris et ....
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Protocole
Tous les travaux impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l’Université de Guelph conformément au Conseil canadien sur les soins aux animaux. Tous les travaux sont effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) au Canada où le VND mésogénique est un agent pathogène du groupe de risque 2. Toutes les étapes impliquées dans l’amplification et la purification du NDV doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique de type IIA à des fins de sécurité et de stérilité.
1. Amplification du VND à l’aide d’œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécif....
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Résultats
Récolte du liquide allantoïque
Comme le liquide allantoïque est récolté à partir d’œufs de poule embryonnés, il devrait sembler clair et transparent. Si le fluide semble opaque et jaune, cela indique la présence de contaminants. L’inclusion de ce fluide allantoïque pendant la purification entravera le processus de purification, car la pression augmentera rapidement et dépassera 10 psi, entraînant le cisaillement du virus et la perte du virus infectieux. Le liquide allantoïque qui semble sanglant suggè.......
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Discussion
Les virus utilisés comme agents thérapeutiques dans les études précliniques doivent être hautement purifiés pour éviter toute toxicité lorsqu’ils sont administrés in vivo15. Si les agents adventices ou les contaminants ne sont pas éliminés, cela peut entraîner des effets indésirables graves annulant l’effet thérapeutique de l’agent viral28. Comme le NDV est produit dans les œufs de poule embryonnés, il existe plusieurs protéines d’œuf contaminantes, telles que l’ov.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
J.G.E.Y a reçu une bourse de doctorat du Collège vétérinaire de l’Ontario et une bourse d’études supérieures de l’Ontario. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à SKW (subvention no 304737) et LS (subvention no 401127).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsine | HyClone | SH30042,02 | |
| 1 mL Seringue à embout coulissant | BD | 309659 | |
| 10 mL Seringue Luer-Lok | BD | 302995 | |
| 10 % de solution d’iode de povidone | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Tubes coniques | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 po Aiguille de remplissage émoussée | BD | 305180 | |
| Aiguille de glissement de précision 18G x 1 1/2 po | BD | 305196 | |
| 25 g x 5/8 po Aiguille | BD | 305122 | |
| 2-mercaptoéthanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution 37,5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4 % Paraformaldéhyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Seringue | BD | 309646 | |
| 96 Puits Plaque de Culture Tissulaire - Fond Plat | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acide acétique, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Chèvre-Anti-Souris | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifugeuse | Beckman Coulter | B08861 | |
| Persulfate d’ammonium | BioRad | 161-0700 | |
| Eau de Javel (5 %) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Pince large à pointe non dentelée | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubateur | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Gel diététique Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Oeuf Candler | Berry Hill | A46 | |
| Éthanol (70 %) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0, 0,5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Raccords en T filetés femelles, nylon, 1/8 po NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 12483-020 | |
| Pince à pointe fine de haute précision | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Microscope fluorescent | ZEISS AXIO | Non nécessaire si l’on n’effectue pas d’IFA ou si le NDV ne code pas pour une protéine fluorescente | |
| Système de lyophilisation Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imagerie de gels d’agarose | |
| Glycérol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| Kit de transcriptase inverse d’ADNc haute capacité | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| haute teneur en glucose Dulbecco’s Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Kit d’humidité | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Solution à 60 % (p/v) d’iodixanol dans l’eau (stérile) |
| Monochlorhydrate de L-Lysine | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Luer-Lok mâle et femelle A 1/8 po filetage de tuyau national, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Entraînement numérique | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Pompe péristaltique avec affichage numérique |
| Tête de pompe à chargement facile Masterflex L/S pour tubes de précision | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Tubes en silicone Masterflex (platine) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Silicone durci au platine |
| MC Pro 5 Thermocycleur | Eppendorf | EP950040025 | |
| méthanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE coulée et en cours d’exécution appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Sérum de chèvre normal | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Système d’électrophorèse | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(éthylène glycol) Moyenne Mn 20 000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Modèle 1655050 - pour électrophorèse sur gel d’agarose | |
| Q5 Haute Fidélité 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Mini Kit d’ARN viral | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Cassette de dialyse (extra fort), 10 000 MWCO 0,5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Hydroxyde de sodium (granulés) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Œufs exempts d’agents pathogènes spécifiques | ACIA | NA | Le fournisseur varie en fonction de l’emplacement |
| Saccharose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Filtre en profondeur | PALL | SC050V100P | |
| Ciseaux | chirurgicauxThermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Utilisé dans le protocole étape 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptateur pour tubes à fond fixe | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Tubes à centrifuger ultraclairs à paroi mince ( 9/16 po x 3 1/2 po) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Collier de serrage à vis | pour tubes PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Manomètres utilitaires | Cole-Parmer | 68355-06 |
Références
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
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Réimpressions et autorisations
