Caractérisation viscoélastique rapide du mucus des voies respiratoires à l’aide d’un rhéomètre de paillasse

Résumé

Les propriétés viscoélastiques du mucus jouent un rôle essentiel dans la clairance mucociliaire. Cependant, les techniques rhéologiques traditionnelles du mucus nécessitent des approches complexes et chronophages. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’utilisation d’un rhéomètre de paillasse capable d’effectuer rapidement et de manière fiable des mesures viscoélastiques.

Résumé

Dans les maladies pulmonaires muco-obstructives (p. ex. asthme, maladie pulmonaire obstructive chronique, fibrose kystique) et d’autres affections respiratoires (p. ex., infections virales/bactériennes), les propriétés biophysiques du mucus sont altérées par l’hypersécrétion des cellules gobelets, la déshydratation des voies respiratoires, le stress oxydatif et la présence d’ADN extracellulaire. Des études antérieures ont montré que la viscoélasticité des expectorations était en corrélation avec la fonction pulmonaire et que les traitements affectant la rhéologie des expectorations (par exemple, les mucolytiques) peuvent entraîner des avantages cliniques remarquables. En général, les mesures rhéologiques des fluides non newtoniens utilisent des approches élaborées et chronophages (p. ex., rhéomètres parallèles/à plaques coniques et/ou suivi des particules de microbilles) qui nécessitent une formation approfondie pour effectuer le test et interpréter les données. Cette étude a testé la fiabilité, la reproductibilité et la sensibilité de Rheomuco, un dispositif de paillasse convivial conçu pour effectuer des mesures rapides en utilisant l’oscillation dynamique avec un balayage cisaillement-déformation afin de fournir des modules viscoélastiques linéaires (G', G », G^* et tan δ) et des caractéristiques de point de gel (γ_c et σ_c) pour les échantillons cliniques dans les 5 minutes. Les performances de l’appareil ont été validées à l’aide de différentes concentrations d’un simulant de mucus, l’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa, et par rapport aux mesures traditionnelles de rhéologie en vrac. Un isolat clinique prélevé sur un patient intubé atteint d’asthme (SA) a ensuite été évalué en trois mesures et le coefficient de variation entre les mesures est <10%. L’utilisation ex vivo d’un puissant agent réducteur de mucus, le TCEP, sur le mucus SA a entraîné une diminution de cinq fois du module élastique et un changement vers un comportement global plus « liquide » (par exemple, un bronzage plus élevé δ). Ensemble, ces résultats démontrent que le rhéomètre de paillasse testé peut effectuer des mesures fiables de la viscoélasticité du mucus dans les milieux cliniques et de recherche. En résumé, le protocole décrit pourrait être utilisé pour explorer les effets des médicaments mucoactifs (p. ex. rhDNase, N-acétyl cystéine) sur place pour adapter le traitement au cas par cas, ou dans des études précliniques de nouveaux composés.

Introduction

Les maladies des voies respiratoires muco-obstructives, y compris l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la fibrose kystique (FK) et d’autres affections respiratoires, telles que la pneumonie virale et bactérienne, sont des problèmes de santé répandus dans le monde entier. Bien que la physiopathologie varie considérablement d’une affection à l’autre, une caractéristique clé commune est une clairance mucociliaire anormale. Dans les poumons sains, le mucus tapisse l’épithélium des voies respiratoires pour piéger les particules inhalées et fournir une barrière physique contre les agents pathogènes. Une fois sécrété, le mucus des voies respiratoires, composé d’environ 97,5% d’eau, de 0,9% de sel, d’environ 1,1% de protéines globulaires et d’environ 0,5% de mucines, est progressivement transporté vers la glotte par le battement coordonné des cils ^1,2. Les mucines sont de grandes glycoprotéines liées à l’O qui interagissent via des liaisons non covalentes et covalentes pour fournir les propriétés viscoélastiques distinctes du mucus, ce qui est nécessaire pour un transport efficace³. Les changements dans l’ultrastructure du réseau de mucine causés par une altération du transport ionique, le déploiement de la mucine, les interactions électrostatiques, la réticulation ou des changements de composition peuvent affecter de manière significative la viscoélasticité du mucus et altérer la clairance mucociliaire ^4,5. Par conséquent, l’identification des changements dans les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires est essentielle pour comprendre la pathogenèse de la maladie et tester de nouveaux composés mucoactifs⁶.

Divers facteurs peuvent conduire à la production de mucus aberrant dans les poumons. Dans la MPOC, l’inhalation chronique de fumée de cigarette déclenche une hypersécrétion de mucus à la suite de la métaplasie des cellules de gobelet, ainsi qu’une déshydratation des voies respiratoires via la régulation négative du canal régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), provoquant une hyperconcentration du mucus et une obstruction des petites voies respiratoires ^7,8. De même, la mucoviscidose, une maladie génétique associée à des mutations du gène CFTR, se caractérise par la production de mucus visqueux et adhérent inadéquat pour le transport ^8,9. En bref, le dysfonctionnement du CFTR induit l’épuisement des liquides de surface des voies respiratoires, l’enchevêtrement de mucine polymère et une augmentation des interactions biochimiques, ce qui entraîne une inflammation chronique et des infections bactériennes. En outre, les cellules inflammatoires piégées dans le mucus statique exacerbent encore la viscoélasticité du mucus en ajoutant une autre grosse molécule, l’ADN, dans la matrice du gel, aggravant l’obstruction des voies respiratoires⁵. L’un des meilleurs exemples de l’importance de la rhéologie du mucus sur la santé globale des poumons est fourni par l’exemple de la DNFase humaine recombinante (rhDNase) dans le traitement des patients atteints de mucoviscidose. Les effets de la rhDNase ont d’abord été démontrés ex vivo sur les expectorations expectorées, qui ont montré une transition du mucus visqueux à un liquide qui s’écoule en^{quelques minutes 10,11}. Les essais cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose ont démontré que la réduction de la viscoélasticité du mucus des voies respiratoires avec l’inhalation de rhDNase diminuait le taux d’exacerbations pulmonaires et améliorait la fonction pulmonaire et le bien-être général du patient ^12,13,14. En conséquence, l’inhalation de rhDNase visant à faciliter la clairance est devenue la norme de soins pour les patients atteints de mucoviscidose pendant plus de deux décennies. Des avantages cliniques similaires ont été observés avec l’utilisation d’une solution saline hypertonique inhalée pour l’hydratation du mucus dans la mucoviscidose, ce qui était en corrélation avec des changements dans les propriétés rhéologiques et entraînait une accélération de la clairance mucociliaire et une amélioration de la fonction pulmonaire^15,16. Par conséquent, un protocole rapide et fiable pour mesurer les propriétés viscoélastiques du mucus en milieu clinique est important pour optimiser les approches thérapeutiques.

Le rhéomètre de paillasse testé ici offre une alternative rapide et pratique pour effectuer des mesures viscoélastiques complètes d’échantillons de mucus / expectorations. En utilisant des oscillations dynamiques avec déplacement angulaire contrôlé, l’instrument fournit une déformation via une paire de plaques parallèles réglables (par exemple, des géométries rugueuses ou lisses) pour mesurer le couple et le déplacement avec des résolutions de 15 nN^. m et 150 nm, respectivement¹⁷. Un étalonnage standardisé par défaut combiné à des directives d’utilisation adaptées aux spécialistes non rhéologiques permet des mesures simples et réduit le risque d’erreurs de l’opérateur. L’appareil produit une courbe de balayage de déformation qui est traitée et analysée en temps réel (dans un délai d’environ 5 minutes) et fournit automatiquement des caractéristiques viscoélastiques linéaires (G', G », G^* et tan δ) et de point de gel (γ_c et σ_c) (voir tableau 1). Le module élastique ou de stockage (G') décrit comment un échantillon réagit au stress (c.-à-d. la capacité de revenir à sa forme d’origine), tandis que le module visqueux ou de perte (G) décrit l’énergie dissipée par cycle de déformation sinusoïdale (c.-à-d. l’énergie perdue en raison du frottement des molécules). Le module complexe ou dynamique (G*) est le rapport de la contrainte à la déformation, qui décrit la quantité d’accumulation de force interne en réponse à un déplacement de cisaillement (c.-à-d. les propriétés viscoélastiques globales). Le facteur d’amortissement (tan δ) est le rapport entre le module visqueux et le module élastique, ce qui indique la capacité d’un échantillon à dissiper l’énergie (c’est-à-dire qu’un faible bronzage δ indique un comportement élastique dominant / solide, tandis qu’un bronzage élevé δ indique un comportement visqueux dominant / liquide). Pour les caractéristiques du point de gel, la déformation croisée (γ_c) est la mesure de la déformation de cisaillement, calculée par le rapport entre le chemin de déviation et la hauteur de l’écart de cisaillement, à laquelle l’échantillon passe d’un comportement de type solide à un comportement de type liquide et se produit, par définition, à une déformation d’oscillation où G' = G » ou tan δ = 1. La limite d’élasticité croisée (σ_c) est une mesure de la quantité de contrainte appliquée par le dispositif auquel les modules élastiques et visqueux se croisent. Dans une sputa saine, l’élasticité domine la réponse mécanique à la déformation (G' > G »). Dans les maladies muco-obstructives, G' et G » augmentent à la suite de changements pathologiques de mucus 17,18,19. La simplicité opérationnelle de l’appareil facilite les mesures sur site et contourne le besoin d’entreposage, de transport et d’expédition des échantillons vers une installation hors site pour analyse, évitant ainsi les effets de temps et de gel-dégel sur les propriétés de ces échantillons biologiques.

Dans cette étude, des solutions d’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa de différentes concentrations (1% -3%) ont été utilisées pour valider la plage de mesure d’un rhéomètre de paillasse commercial (Table des matériaux) et la courbe dépendante de la concentration obtenue a été directement comparée aux mesures acquises avec un rhéomètre en vrac traditionnel (Table des matériaux) ). La répétabilité des mesures rhéologiques a ensuite été évaluée à l’aide de mucus prélevé bronchoscopiquement sur un patient intubé souffrant d’asthme (AS), une forme extrême d’exacerbation de l’asthme caractérisée par un bronchospasme, une inflammation éosinophile et une hyperproduction de mucus en réponse à un agent environnemental ou infectieux ^8,20 . Dans ce cas, le patient SA avait été intubé pour insuffisance respiratoire sévère et avait besoin d’ECMO (oxygénation par membrane extracorporelle) en raison de l’incapacité de soutenir le patient efficacement et en toute sécurité avec une ventilation mécanique seule, malgré des traitements agressifs standard contre l’asthme. Au cours d’une bronchoscopie cliniquement indiquée pour l’effondrement lobaire, des sécrétions épaisses, claires et tenaces ont été notées comme obstruant les bronches lobaires et ont été aspirées à l’aide de lavages salins. Immédiatement après le prélèvement, l’excès de solution saline a été retiré de l’aspiration et les propriétés viscoélastiques de l’échantillon SA restant ont été analysées à l’aide du dispositif de paillasse. D’autres aliquotes d’échantillons ont été traitées avec un agent réducteur, le chlorhydrate de phosphine de tris (2-carboxyléthyle) (TCEP), afin de déterminer si ce protocole pouvait être utilisé pour caractériser l’efficacité des composés thérapeutiques ex vivo.

Les résultats ont montré que ce protocole et le dispositif de paillasse peuvent être utilisés efficacement en milieu clinique. Les propriétés rhéologiques déterminées à partir des courbes dépendantes de la concentration de PEO (figure 1A) étaient impossibles à distinguer entre le dispositif de paillasse testé et un rhéomètre à plaques parallèles traditionnel (figure 1B). Les mesures triplicates du mucus SA étaient reproductibles, avec un coefficient de variation de 10 % pour les critères d’évaluation G*, G' et G » et reflétaient les anomalies substantielles de la viscoélasticité du mucus qui étaient cliniquement apparentes dans le cas de ce patient (Figure 1D). Enfin, le traitement ex vivo par TCEP a entraîné une réduction significative de G' et G » et une augmentation de la δ bronzée, démontrant une réactivité au traitement par des altérations du réseau de mucine (Figure 2). En conclusion, ce protocole utilisant un rhéomètre de paillasse fournit une approche simple et efficace pour évaluer les propriétés viscoélastiques des échantillons de mucus obtenus en clinique. Cette capacité peut être utilisée pour faciliter les approches de médecine de précision en matière de soins, car les cliniciens peuvent tester l’efficacité des médicaments mucoactifs approuvés sur place, ce qui peut aider à identifier d’autres options de traitement. De plus, cette approche peut être utilisée dans les essais cliniques pour examiner les effets des médicaments expérimentaux.

Protocole

Dans la présente étude, des échantillons ont été prélevés lors d’une bronchoscopie cliniquement indiquée après avoir obtenu le consentement éclairé en vertu d’un protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel de l’UNC.

1. Collecte et stockage des expectorations et du mucus

1. Recueillir le mucus des voies respiratoires par prélèvement d’expectorations ou aspiration par bronchoscopie.
   1. Prélever les expectorations soit par expectoration spontanée, soit induire des expectorations par inhalation saline hypertonique à 3%. Alternativement, aspirer directement le mucus des voies respiratoires pendant une procédure de bronchoscopie.
   2. Conservez les expectorations et le mucus des voies respiratoires recueillis dans des gobelets stériles. Dans le cas des expectorations, retirer l’excès de salive de l’échantillon immédiatement après le prélèvement.
   3. Placez les échantillons sur de la glace pour le transport. Limitez le temps de transport à moins de 4 h.
2. Analyser les échantillons au moment de la collecte ou les conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités.
   1. Avant le stockage, homogénéiser le mucus en pipetant doucement de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette à déplacement positif ou une pipette directement dans les tubes de microcentrifugation.
   2. Aliquoter les échantillons à stocker dans des volumes ≥500 μL afin d’assurer un volume suffisant pour les expériences.
      REMARQUE: La congélation et la décongélation peuvent affecter les propriétés viscoélastiques de l’échantillon. Comparez uniquement les échantillons qui ont subi des cycles de gel/dégel similaires.

2. Préparation de l’échantillon

1. Pipettez directement les sputa/mucus frais et congelés ou homogénéisez les échantillons à l’aide d’une pipette à déplacement positif en pipetant doucement de haut en bas trois à cinq fois avant de les aliquoter.
   REMARQUE: L’homogénéisation est importante pour les échantillons qui contiennent des bouchons épais qui peuvent affecter la reproductibilité.
2. Aliquote 400-500 μL de l’échantillon dans des tubes de microcentrifugation séparés. Préparer autant d’aliquotes que nécessaire pour des mesures répétées et/ou un traitement avec des réactifs pharmacologiques (p. ex. rhDNase, N-acétyl cystéine). Incuber les aliquotes à tester à 37 °C pendant au moins 5 minutes avant la mesure.
3. Pour tester les agents pharmacologiques (facultatif), utiliser des concentrations élevées de solutions mères pour éviter la dilution de l’échantillon.
   1. Ajouter entre 0,4 % et 10 % de volume (pour minimiser la dilution de l’échantillon) du réactif souhaité (p. ex. TCEP) directement sur l’échantillon. Assurez-vous qu’aucune goutte du composé ne reste sur le côté du tube.
   2. Incuber les échantillons à 37 °C pendant la durée souhaitée pour permettre une réaction chimique (<1 h pour empêcher la dégradation protéolytique du mucus).
   3. Mélanger l’échantillon de mucus et le réactif en agitant le fond du tube de microcentrifugation toutes les 2 minutes pour permettre une pénétration progressive du réactif dans l’échantillon de mucus sans compromettre le réseau de mucine (par exemple, en imitant le battement ciliaire et la clairance mucociliaire). Lorsque vous comparez plusieurs réactifs médicamenteux, assurez-vous que le temps d’incubation est similaire.

3. Initialisation et étalonnage de l’instrument

1. Allumez la machine (Table des matériaux) et initialisez le logiciel.
2. Sélectionnez Nouvelle mesure. Entrez le numéro d’identification de l’échantillon sous ID de mesure et le nom de l’opérateur sous Opérateur pour continuer. Entrez des informations ou des commentaires supplémentaires sous Commentaires.
3. Choisissez un jeu de géométrie (c.-à-d. des plaques parallèles rugueuses ou lisses de 25 mm) et inspectez soigneusement les grandes et les petites plaques pour vous assurer que les plaques sont propres et en parfait état).
   REMARQUE: Les plaques rugueuses sont conçues pour les grands volumes (350-500 μL) et les plaques lisses sont conçues pour les petits volumes (250-350 μL). L’utilisation d’un volume d’échantillon inférieur ou supérieur à celui recommandé peut entraîner des mesures inexactes.
4. Insérez fermement la grande plaque sur la chaire inférieure.
5. Insérez doucement la petite plaque sur la chaire supérieure et verrouillez la plaque en la tournant légèrement jusqu’à entendre un « clic », ce qui indique que la plaque est correctement serrée. Notez que l’oscillation libre de la plaque supérieure est normale.
6. Attendez que la température atteigne la valeur cible de 37 °C. Ensuite, lancez l’étalonnage automatique à l’invite du logiciel.
   REMARQUE: Ne dérangez pas la machine ou la surface de paillasse pendant ce processus.

4. Chargement de l’échantillon

1. À l’aide d’une pipette à déplacement positif, pipettez lentement entre 250 et 500 μL de l’échantillon au centre de la grande plaque inférieure. Une fois déposés sur la plaque, les échantillons visqueux adopteront une forme de dôme alors que les échantillons très élastiques peuvent nécessiter une séparation physique (utilisez des ciseaux à disséquer).
   REMARQUE: Évitez d’introduire des bulles d’air. Si nécessaire, enlevez les bulles résiduelles en les repoussant avec une pointe de pipette.
2. Abaissez la tête de mesure transportant la petite plaque via le logiciel et observez l’échantillon. S’il est correctement chargé sur la plaque inférieure, l’échantillon entrera en contact et sera centré entre les deux plaques.
3. Pour vous assurer que l’échantillon comble l’espace (c.-à-d. en s’étalant sur les bords des plaques), utilisez la fonction Réduire l’écart jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus en forme de biconcave ou qu’il soit aligné avec le bord des plaques. La fonction Réduire l’écart abaisse la tête de mesure par incréments de 0,1 mm et est limitée à sept incréments.
   REMARQUE: Surveillez attentivement l’échantillon et ajustez progressivement l’écart pour éviter les débordements.
   1. S’il reste un espace après sept incréments, cliquez sur Rétablir l’installation pour revenir à la position initiale et ajuster la position et/ou le volume de l’échantillon.
   2. Si l’écart est excessivement réduit (p. ex., forme biconvexe), prélever l’échantillon excédentaire à l’aide d’une spatule par un mouvement circulaire le long du bord de la plaque supérieure. Assurez-vous de couper doucement l’excès d’échantillon pour éviter les contraintes de cisaillement.
      REMARQUE : À la fin de cette étape, le bord de l’échantillon doit être aligné avec le bord de la plaque supérieure, comme indiqué dans les instructions de l’utilisateur.
4. Abaissez le couvercle de protection pour éviter toute projection accidentelle de fluides contaminés pendant l’oscillation.

5. Initier la mesure biophysique

1. Pour lancer la mesure, cliquez sur Démarrer l’analyse. Un cycle complet prendra 4-7 min.
   1. Évitez de parler fort et de toucher l’appareil ou le banc pendant toute la durée du cycle. Un environnement calme est particulièrement important pour les 2 premières minutes.
      REMARQUE: Pendant le cycle, l’instrument effectue un test de balayage de déformation standardisé, qui consiste en des étapes oscillantes successives. Chaque étape est une série de 10 oscillations à amplitude et fréquence constantes (1 Hz), au cours desquelles le couple correspondant est mesuré en temps réel. Les signaux de déformation et de couple permettent de calculer les modules complexes (G*), élastiques (G') et visqueux (G), ainsi que le rapport d’amortissement (tan δ) à chaque étape. Les oscillations augmentent progressivement en amplitude, ce qui intensifie la déformation imposée à l’échantillon.

6. Retrait de l’échantillon

1. Une fois le cycle terminé, cliquez sur Suivant pour augmenter la tête de mesure et générer le rapport d’analyse de l’échantillon.
   REMARQUE: Pour le rapport, le logiciel calcule les données enregistrées et trace automatiquement deux courbes montrant l’évolution des modules visqueux et élastiques par rapport à la déformation exercée sur l’échantillon et affiche le régime viscoélastique linéaire (c’est-à-dire un plateau à faible déformation) s’il est présent. Si aucun régime linéaire n’est détecté, les valeurs de G', G », G* et tan δ sont extraites à 0,05 déformation. De plus, la déformation croisée et la limite d’élasticité (γ_c et σ_c) sont calculées à tan δ = 1. Les données sont également fournies dans des feuilles de calcul pour chaque étape pour une analyse plus approfondie.
2. Une fois la tête de mesure complètement rétractée, soulevez le couvercle de protection, jetez l’échantillon et retirez soigneusement les plaques. Nettoyez et désinfectez les assiettes à l’eau tiède et au savon.
   REMARQUE: Séchez soigneusement la géométrie définie avant une utilisation répétée.

Résultats

La figure 1 montre la précision et la répétabilité des mesures rhéologiques à l’aide de courbes dépendantes de la concentration de contrôle viscoélastique, c’est-à-dire la solution d’oxyde de polyéthylène (PEO) et le mucus asthmatique (SA). Les mesures des caractéristiques viscoélastiques de 8 MDa PEO à cinq concentrations différentes (1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 % et 3 %) ont été directement comparées entre le rhéomètre de paillasse évalué et un rhéomètre en vrac traditionnel (Table des ma...

Discussion

Les propriétés viscoélastiques uniques du mucus sont essentielles au maintien de voies respiratoires saines. Des facteurs internes et externes peuvent altérer les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires, entraînant des complications cliniques caractéristiques des maladies muco-obstructives. Par conséquent, la surveillance des changements dans la viscoélasticité du mucus pourrait être envisagée lors de l’évaluation de l’état de la maladie et de l’exploration de thérapies qui réduisent la viscoélasticité d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
	Gilson	CP1000
Discovery-3	Instruments		DHR-3 Rhéomètre en vrac fabriqué par TA Instruments à New Castle, DE : Utilisé pour effectuer des tests rhéologiques.
Logiciel graphique	GraphPad Prism		Logiciel GraphPad (San Diego, CA) utilisé pour l’analyse de données
Microcentrifugeuse Tube	Costar	3621
Plaque Peltier	TA Instruments		Système de contrôle de la température fabriqué par TA Instruments à New Castle, DE
Polyéthylène oxyde	Sigma	372838	8 Polymère MDa utilisé comme simulant
de mucusPipette à déplacement positif	Gilson	M1000	Pipette utilisée pour la manipulation de solutions visqueuses
Rheomuco	Rheonova	Rheonova Rheometer de paillasse fabriqué par Rheonova en France : Utilisé pour effectuer des tests rhéologiques.
Géométries inférieures brutes	Rheonova	D-1811-007
Géométries supérieures brutes	Rheonova	U-1811-007	25 mm de diamètre
	TA Instruments		20 mm de diamètre
tris(2-carboxyéthyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP : Agent réducteur puissant.