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Article de méthode

Étude de la pathogenèse de la mutation MYH7 Gly823Glu dans la cardiomyopathie hypertrophique familiale à l’aide d’un modèle murin

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DOI :

10.3791/63949

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8 août 2022

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1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Sur la base de la famille de cardiomyopathie héréditaire familiale trouvée dans notre travail clinique, nous avons créé un modèle murin C57BL / 6N avec une mutation ponctuelle (G823E) au locus MYH7 de la souris grâce à l’ingénierie du génome médiée par CRISPR / Cas9 pour vérifier cette mutation.

Résumé

La cardiomyopathie hypertrophique familiale (HCM, OMIM: 613690) est la cardiomyopathie la plus courante en Chine. Cependant, l’étiologie génétique sous-jacente de la CMH reste insaisissable.

Nous avons précédemment identifié une variante hétérozygote du gène de la chaîne lourde 7 de la myosine (MYH7), NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E), dans une grande famille chinoise Han atteinte de CMH. Dans cette famille, la variante G823E coségrége avec un trouble autosomique dominant. Cette variante est située dans le domaine du bras de levier de la région du cou de la protéine MYH7 et est hautement conservée parmi les myosines homologues et les espèces. Pour vérifier la pathogénicité de la variante G823E, nous avons produit un modèle murin C57BL/6N avec une mutation ponctuelle (G823E) au locus MYH7 de la souris avec ingénierie génomique médiée par CRISPR/Cas9. Nous avons conçu des vecteurs de ciblage d’ARNg et des oligonucléotides donneurs (avec des séquences de ciblage flanquées de 134 pb d’homologie). Le site p.G823E (GGG à GAG) dans l’oligonucléotide donneur a été introduit dans l’exon 23 de MYH7 par réparation dirigée par homologie. Un p.R819 silencieux (AGG à CGA) a également été inséré pour empêcher la liaison à l’ARNg et le reclivage de la séquence après réparation dirigée par homologie. L’échocardiographie a révélé une hypertrophie de la paroi postérieure ventriculaire gauche (LVPW) avec systole chez des souris MYH7 G823E/- à l’âge de 2 mois. Ces résultats ont également été validés par analyse histologique (Figure 3).

Ces résultats démontrent que le variant G823E joue un rôle important dans la pathogenèse de la CMH. Nos résultats enrichissent le spectre des variantes de MYH7 liées à la CMH familiale et peuvent fournir des conseils pour le conseil génétique et le diagnostic prénatal dans cette famille chinoise.

Introduction

La cardiomyopathie hypertrophique (HCM, OMIM: 613690) est la cardiomyopathie la plus courante en Chine, avec une incidence estimée à 0,2%, affectant 150 000 personnes 1,2.

La caractéristique anatomique pathologique qui caractérise la CMH est l’hypertrophie ventriculaire asymétrique, qui implique souvent le tractus d’écoulement ventriculaire et / ou le septum interventriculaire3. La manifestation clinique est une dyspnée à l’effort, de la fatigue et des douleurs thoraciques. Le phénotype individuel de la CMH présente une variabilité allant d’une insuffisance cardiaque cliniquement insidieuse à une insuffisance cardiaque sévère. Les patients atteints de CMH ont besoin d’un traitement médical, d’une transplantation cardiaque, d’un équipement de maintien des fonctions vitales et d’un suivi multidisciplinaire4.

Au cours du siècle dernier, la technologie PCR a changé la façon dont nous étudions l’ADN5. Une méthode de séquençage de l’ADN pour le diagnostic clinique a été découverte par Sanger et ses collègues6. La technique de Sanger a ensuite été appliquée au projet du génome humain, mais cette approche était coûteuse et prenait beaucoupde temps 7. L’avènement du séquençage du génome entier (WGS) a porté les connaissances sur les maladies génétiques humaines à de nouveaux sommets, mais il est resté prohibitif en termes de coût. La technologie de séquençage de l’exome entier (WES) est utilisée depuis longtemps pour détecter les variantes de la lignée germinale8 et a réussi à identifier les mutations somatiques conductrices dans l’exome de divers cancers9. La détection d’exons d’ADN ou de régions codantes par WES peut être utilisée pour révéler des variantes pathogènes dans la plupart des maladies mendéliennes. Aujourd’hui, avec la diminution du coût du séquençage, le séquençage pangénomique devrait devenir un outil important dans la recherche en génomique et peut être largement utilisé dans la détection de variantes pathogènes dans le génome.

La technologie WES a également été utilisée dans la cardiomyopathie héréditaire pour identifier les variantes pathogènes afin d’élucider davantage l’étiologie. De nouvelles preuves ont impliqué que les gènes codant pour les mutations des gènes de la protéine structurelle du sarcomère, tels que MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 etTPM1 18 sont responsables de l’étiologie génétique de la CMH. La connaissance des variantes pathogènes dans les gènes pathogènes (p. ex. obscurine, calmoduline cytosquelettique et RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, alpha 2 agissant (ACTN2, OMIM: 102573)20 et cystéine et protéine riche en glycine 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) a également été associée à la CMH. Les études génétiques actuelles ont identifié plusieurs variantes pathogènes distinctes dans le gène de la protéine sarcomérique chez environ 40% à 60% des patients atteints de CMH, et les tests génétiques chez les patients atteints de CMH ont révélé que la plupart des variantes pathogènes se produisent dans la chaîne lourde de myosine (MYH7) et la protéine C liant la myosine (MYBPC3). Cependant, la base génétique de la CMH reste insaisissable. Explorer la pathogénicité de ces variations qui sous-tendent les patients humains atteints de CMH reste un défi majeur22.

Dans cette étude, nous rapportons une variante pathogène de MYH7 dans une famille Han chinoise atteinte de CMH par WES. Afin de vérifier la pathogénicité de cette variante, nous avons établi une souris knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) en utilisant le système CRISPR / Cas9. Nous discutons également des mécanismes plausibles de cette variante.

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Protocole

Les histoires des familles ont été obtenues en interrogeant les membres de la famille. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong (n ° 2019074). Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les membres de la famille. Tous les animaux sont traités conformément aux directives éthiques de l’hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong (Guangzhou, Chine).

1. Sujets d’étude

REMARQUE: Le proband III-3 a demandé un avis médical au département de chirurgie cardiovasculaire de l’hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong en juillet 2019.

  1. Obtenez les antécédents médicaux familiaux détaillés du proband. Informez et appelez tous les membres de la famille du proband. Tous les membres de la famille ont subi des examens physiques méticuleux.
    1. Effectuer un examen systématique de toutes les données cliniques, y compris les dossiers médicaux, les ECG, les échocardiogrammes et les rapports de cathétérisme cardiaque.
    2. Reconfirmer les phénotypes cardiaques chez tous les patients pendant l’intervention ou la chirurgie.
  2. Sélectionnez un total de 174 témoins sains basés sur la population à partir de la base de données locale. Prélever environ 4,0 mL de sang veineux périphérique de chaque patient.

2. Extraction de l’ADN

REMARQUE: L’ADN est extrait avec une trousse de sang commerciale selon les instructions du fabricant.

  1. Lyser les cellules sanguines avec un détergent anionique en présence d’un stabilisateur d’ADN suivant le protocole du fabricant.
  2. Ajouter 10 μL de solution de RNase A au lysat cellulaire et mélanger en retournant le tube 25 fois. Incuber à 37 °C pendant 15 min à 1 h.
  3. Éliminer les protéines par précipitation saline. Utilisez une solution de précipitation protéique (0,25 mg d’albumine sérique bovine dissoute dans 25 mL d’eau distillée) et 100 % d’isopropanol pour précipiter les protéines. Ensuite, utilisez 200 μL d’éthanol à 70 % et effectuez une centrifugation à 12 000 x g/min à 4 °C pendant 15 min pour laver la pastille d’ADN.
  4. Récupérer l’ADN génomique par précipitation avec 500 μL d’éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Aspirer puis dissoudre la pastille dans une solution d’hydratation (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
  5. Utilisez un spectrophotomètre (p. ex., NanoDrop 2000) pour déterminer la pureté. L’ADN purifié a généralement un rapport A260 / A280 compris entre 1,7 et 1,9 et peut atteindre 200 kb.
  6. Conservez l’ADN à long terme à 2-8, -20 ou -80 °C.

3. Séquençage de l’exome entier et analyse des variantes

REMARQUE : Pour rechercher systématiquement des mutations génétiques causant la maladie, un séquençage de l’exome chez les personnes affectées (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 et IV-3) et les personnes non affectées (III-2, III-5, IV-4) a été effectué.

  1. Utilisez la sonde exome selon les instructions du fabricant pour effectuer la capture d’exome.
  2. Appliquez les bibliothèques qualifiées au séquençage d’extrémités appariées de 2 × 150 bp sur la plate-forme HiSeq X-ten. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
  3. Aligner les fichiers FASTQ sur le génome de référence humain (hg19/GRCh37) avec BWA v0.7.1318,19. Triez les fichiers alignés (fichiers au format sam/bam) avec samtools, puis marquez les doublons à l’aide de Picard. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
  4. Utilisez GATK, réalignez les lectures localement et recalibrez les qualités de base. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
  5. Générez des statistiques de mappage qui incluent la couverture et la profondeur à partir de fichiers recalibrés par BEDTools et des scripts perl/python internes.
  6. Variantes de génotype (SNV et indels) à partir de fichiers BAM recalibrés en utilisant le mode de traitement multi-échantillons de l’outil HaplotypeCaller de GATK.
  7. Utilisez VQSR (variant quality score recalibration) pour réduire les faux positifs des appels de variantes.
  8. Annoter les SNV et les indels à l’aide du logiciel ANNOVAR21 sur plusieurs bases de données, notamment l’Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), l’Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) et 1 000 G (http://www.1000genomes.org). Interpréter la pathogénicité des variantes de séquence conformément aux lignes directrices de l’ACMG.

4. Séquençage de Sanger

  1. Effectuer le séquençage de Sanger pour confirmer les variantes causales potentielles et déterminer la ségrégation des variantes dans la famille à l’aide d’un séquenceur ABI 350023.
  2. Concevoir les séquences d’amorce pour la variante du gène MYH7 (NM_000257) comme suit : 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' et 5'- CGGACTTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Confirmez une variante, examinez tous les membres de la famille disponibles pour déterminer la ségrégation des variantes au sein de la famille23.

5. Génération de souris knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E)

  1. Utilisez le système CRISPR/Cas9 pour générer des souris knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). Le gène Myh7 de la souris (numéro d’acquisition GenBank : NM_001361607.1 ; Ensembl: ENSMUSG00000053093) est situé sur le chromosome 14 de la souris et a 41 exons. Le codon de départ ATG dans l’exon 4 et le codon stop TAG dans l’exon 41, et le G823E est situé sur l’exon 23. Sélectionnez exon 23 comme site cible.
  2. Concevoir la séquence du vecteur de ciblage de l’ARNg et de l’oligo donneur (avec séquence de ciblage, flanquée de séquences homologues de 134 pb combinées des deux côtés).
    1. Connectez-vous au site Web du NCBI et cliquez sur la fonction de conception d’amorce en ligne BLAST à droite.
    2. Cliquez sur la fonction Primer-BLAST au bas de la page pour concevoir des amorces.
    3. Collez le numéro de séquence de référence NCBI MYH7 NM_000257.4 dans la zone de modèle PCR.
    4. Amplifier le fragment cible (ADNc MYH7 exon 23 et ses exons adjacents) afin de concevoir l’amorce en amont sur l’exon 21 (2392-2528) et l’amorce en aval sur l’exon 25 (3205-3350). Entrez le numéro d’exon des amorces en amont et en aval dans la case de la plage de droite.
    5. Cliquez sur le bouton Obtenir les amorces en bas pour générer automatiquement plusieurs paires d’amorces .
  3. Entrez le gène MYH7 dans la base de données ZFIN, introduisez le site de mutation p.g823e (GGG à GAG) dans l’oligonucléotide donneur et la mutation silencieuse p.r819 (AGG à CGA) dans l’exon 23. La mutation silencieuse empêche la liaison et le redécoupage de la séquence par l’ARNg après réparation dirigée par homologie.
    1. Concevoir l’ARNg selon la séquence générale, les séquences aux deux extrémités sont TAATACGACTCACTATA- et -GTTTTAGAGCTA. Le milieu de la séquence est le site cible mentionné ci-dessus.
  4. Co-injecter l’ARNm Cas9, l’ARNg généré par transcription in vitro et l’oligo donneur dans des ovules fécondés pour la production de souris KI.
    1. Utilisez le kit de détection de l’efficacité de la cible Cas9 / gRNA pour transcrire la cible d’ARNg conçue en ARNg in vitro et détecter l’activité du transcrit (voir les instructions du kit VK007 pour des méthodes de détection spécifiques) conformément au protocole du fabricant.
    2. Décongeler les composants du kit d’ARNm ARCA T7, mélanger et pulser dans une microfuge pour recueillir les solutions au fond des tubes. Assembler la réaction à température ambiante dans l’ordre suivant : 2 mélanges ARCA/NTP à 10 μL, 1 μg d’ADN matrice, 2 μL de mélange d’ARN polymérase T7 et eau sans nucléase à 20 μL.
    3. Bien mélanger et pulser dans une microfuge. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
    4. Retirer l’ADN matrice en ajoutant 2 μL de DNase I, bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 15 min pour obtenir l’ARNm.
    5. Effectuer une injection intrapéritonéale de gonadotrophine sérique et de gonadotrophine chorionique humaine chez des souris femelles C57BL/6 pré-préparées à l’âge d’environ 4 semaines avec une seringue de 0,5 mL à une dose d’environ 5 U par souris avec un intervalle entre les deux injections de 48 h.
    6. Dix-huit heures après l’administration, sacrifiez des souris femelles C57BL/6 et une souris mâle C57BL/6 âgée de 8 à 12 semaines par luxation cervicale après injection d’hormones. Recueillir les ovules et le sperme séparément.
    7. Le sperme est capacité dans le liquide de capacité. Prenez et déposez le sperme au bord du liquide dans les ovules à courte durée de vie pour la fécondation in vitro pendant 3-4 h.
    8. Diluer l’ARNg et l’ARNm Cas9 transcrits avec succès in vitro avec de l’eau sans RNase à 25 ng / μL et 50 ng / μL. Introduire dans le cytoplasme des œufs fécondés chez la souris par microinjection. Repiquer des œufs fécondés en bon état dans l’oviducte élargi des souris femelles. Co-cage avec des souris mâles ligaturées.
  5. Génotyper les chiots par PCR. Utiliser les conditions de PCR suivantes : 94 °C pendant 3 min, 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 35 s et 72 °C pendant 35 s ; 72 °C pendant 5 min. Poursuivez avec l’analyse de séquence.
    1. Coupez la queue des souris de 4 mois avec des ciseaux et placez-les dans un tube EP de 1,5 mL. Ajouter 180 μL de Buffer GL, 20 μL de Protéinase K et 10 μL de RNase A par pièce de queue (2-5 mm) dans un tube microcentrifugé. Veillez à ne pas trop couper la queue.
    2. Incuber le tube à 56 °C pendant une nuit.
    3. Faire tourner dans un tube à microcentrifuger à 1 000 x g pendant 2 min pour éliminer les impuretés.
    4. Ajouter 200 μL de Buffer GB et 200 μL d’alcool éthylique absolu en mélangeant suffisamment.
    5. Placez la colonne d’essorage dans un tube de collecte. Appliquer l’échantillon sur l’essorage et centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu.
    6. Ajouter 500 μL de Buffer WA à la colonne de spin et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
    7. Ajouter 700 μL de Buffer WB à la colonne de spin et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
      REMARQUE: Assurez-vous que le Buffer WB a été prémélangé avec de l’éthanol 100%. Lors de l’ajout de Buffer WB, ajouter à la paroi du tube pour éliminer le sel résiduel.
    8. Répétez l’étape 5.5.7.
    9. Placer la colonne d’essorage dans un tube collecteur et centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min.
    10. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 50 à 200 μL d’eau stérilisée ou de tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne et laisser reposer la colonne pendant 5 minutes.
      NOTE: Le chauffage d’eau stérilisée ou d’un tampon d’élution jusqu’à 65 °C peut augmenter le rendement d’élution.
    11. Pour éluer l’ADN, centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 2 min. Pour augmenter le rendement de l’ADN, ajoutez l’écoulement continu et/ou 50-200 μL d’eau stérilisée ou de tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne de spin et laissez la colonne reposer pendant 5 minutes. Centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min.
    12. Quantifier l’ADN génomique élué par électrophorèse.

6. Évaluation de la morphologie et de la fonction cardiaques

REMARQUE: Appliquer l’échocardiographie en mode M pour évaluer la morphologie cardiaque et la fonction des souris knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E).

  1. Placez les souris knockin dans une boîte en acrylique fermée connectée à l’appareil d’anesthésie et ajustez l’interface à trois voies pour permettre à l’isoflurane (concentration: 3%) de s’écouler dans la boîte en acrylique. Une fois que les souris knockin cessent de se déplacer de manière autonome, retirez les souris knockin.
  2. Placez les souris knockin à plat sur la plate-forme de surveillance de la vie de l’appareil d’anesthésie pour petits animaux et l’anesthésie par inhalation continue mélangée à de l’oxygène (débit: 0,8 L / min) et de l’isoflurane (concentration: 3%). Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les souris anesthésiées pour éviter le dessèchement de la cornée.
  3. Fixez les souris knockin horizontalement sur la plate-forme. Inclinez la plate-forme de 30° caudale par rapport à la souris knockin. Enlevez les poils sur la paroi thoracique antérieure de la souris qui frappe à l’aide d’une crème dépilatoire.
  4. Positionnez la sonde verticalement avec la bosse face à la tête de l’animal. Ensuite, faites pivoter la sonde dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, environ 45°.
  5. Dans la vue parasternale à axe long, faites pivoter la sonde de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre pour observer la vue parasternale à axe court. Après avoir fait pivoter la sonde de 90°, réglez le déplacement de l’axe y pour obtenir la bonne tranche.
  6. Observez l’image du cœur sur grand axe (Figure 1C), puis sélectionnez Données de mesure en mode M.
  7. Acquérir des données échographiques à partir de vues parasternales à grand axe de souris (Figure 1). La fréquence cardiaque (FC), la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG), le débit cardiaque (CO), la dimension diastolique terminale ventriculaire gauche (LVDd), la dimension systolique terminale ventriculaire gauche (LVSd), le septum interventriculaire (IVS) et la paroi postérieure ventriculaire gauche (LVPW) sont mesurés.
  8. Après la mesure, fournissez de l’oxygène aux souris et replacez-les dans leurs cages respectives lorsqu’elles retrouveront une activité autonome.

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Résultats

Profil clinique des familles
Les pedigrees familiaux de HCM ont été obtenus et sont illustrés à la figure 2. Tous les membres de la famille documentés ont reçu un diagnostic de CMH lors de l’inscription.

Dans la famille (Figure 2A), le proband était le patient III-7, qui a reçu un diagnostic de CMH et d’obstruction des voies d’écoulement ventriculaire gauche (LVOTO) à l’âge de 46 ans et a subi une chirurgie cardiaque. Le patient II...

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Discussion

Dans cette étude, nous décrivons une famille chinoise Han atteinte de CMH. L’analyse génétique a révélé qu’une mutation hétérozygote MYH6 p.G823E co-ségrége avec la maladie chez les membres de la famille ayant une transmission autosomique dominante. Pour valider la pathogénicité de la mutation G823E et discuter des mécanismes sous-jacents, nous avons créé un modèle murin C57BL/6N avec G823E au locus Myh7 de souris par ingénierie génomique médiée par CRISPR/Cas9.

Les caractéristiques phénotypiq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet du Fonds de recherche médicale de la province du Guangdong (A2022363) et le projet majeur du Comité de la science et de la technologie du Guangdong, Chine (subvention n ° 2022).

Nous tenons à remercier Qingjian Chen de l’Université du Maryland, College Park, pour l’aide lors de la préparation de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5&fois ; TBEShanghai Sangon
2& fois ; Taq Master Mix (Dye Plus)Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
AgaroseRegu
Appareil d’anesthésie pour petits animauxReward Life Technology Co., Ltd.R500
BEDTools2.16.1
Cas9 méthode de digestion in vitro pour détecter l’efficacité cible de l’ARNg kitViewsolid Biotechnology Co., Ltd.VK007
Marqueur d’ADNThermo Fisher Scientific
Stabilisateur d’ADNShanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.DNAstable LDprévenir la dégradation de l’ADN
Microtome de paraffine électriqueShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene kit de sangSanta Clara
Diapositive en verre, lamelleJiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Solution de coloration à l’hématoxyline, solution de coloration à l’éosineShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.C0107-500ml, C0109
La plateforme HiSeq X-tenIlluminaeffectue le séquençage sur les banques capturées
Injection de gonadotrophine chorioniqueLivzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection de gonadotrophine sérique de jument gestanteLivzon Pharmaceutical Group Inc.
IsofluraneFournisseursinhalation anesthésie
Microinjection microscopeNikonECLIPSE Ts2
NanoDropThermo Fisher Scientific2000
Paraffine Embedding MachineShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
Protéinase KMerck KGaA
samtools1.3
SéquenceurApplied BiosystemsABI 3500
StéréomicroscopeNikonSMZ745T
SureSelect Human All Exon V6Agilent Technology Co., Ltd.sonde exome
T7 ARCA kit d’ARNmNew England BioLabs, Inc.NEB-E2065S
Boîte de températureBINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride SolutionSigma, Merck KGaANo. T2663
Échographevétérinaire Royal PhilipsCX50
locaux

Références

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