Étude de la pathogenèse de la mutation MYH7 Gly823Glu dans la cardiomyopathie hypertrophique familiale à l’aide d’un modèle murin

La cardiomyopathie hypertrophique (HCM, OMIM: 613690) est la cardiomyopathie la plus courante en Chine, avec une incidence estimée à 0,2%, affectant 150 000 personnes ^1,2.

La caractéristique anatomique pathologique qui caractérise la CMH est l’hypertrophie ventriculaire asymétrique, qui implique souvent le tractus d’écoulement ventriculaire et / ou le septum interventriculaire³. La manifestation clinique est une dyspnée à l’effort, de la fatigue et des douleurs thoraciques. Le phénotype individuel de la CMH présente une variabilité allant d’une insuffisance cardiaque cliniquement insidieuse à une insuffisance cardiaque sévère. Les patients atteints de CMH ont besoin d’un traitement médical, d’une transplantation cardiaque, d’un équipement de maintien des fonctions vitales et d’un suivi multidisciplinaire⁴.

Au cours du siècle dernier, la technologie PCR a changé la façon dont nous étudions l’ADN⁵. Une méthode de séquençage de l’ADN pour le diagnostic clinique a été découverte par Sanger et ses collègues⁶. La technique de Sanger a ensuite été appliquée au projet du génome humain, mais cette approche était coûteuse et prenait beaucoup^{de temps 7}. L’avènement du séquençage du génome entier (WGS) a porté les connaissances sur les maladies génétiques humaines à de nouveaux sommets, mais il est resté prohibitif en termes de coût. La technologie de séquençage de l’exome entier (WES) est utilisée depuis longtemps pour détecter les variantes de la lignée germinale⁸ et a réussi à identifier les mutations somatiques conductrices dans l’exome de divers cancers⁹. La détection d’exons d’ADN ou de régions codantes par WES peut être utilisée pour révéler des variantes pathogènes dans la plupart des maladies mendéliennes. Aujourd’hui, avec la diminution du coût du séquençage, le séquençage pangénomique devrait devenir un outil important dans la recherche en génomique et peut être largement utilisé dans la détection de variantes pathogènes dans le génome.

La technologie WES a également été utilisée dans la cardiomyopathie héréditaire pour identifier les variantes pathogènes afin d’élucider davantage l’étiologie. De nouvelles preuves ont impliqué que les gènes codant pour les mutations des gènes de la protéine structurelle du sarcomère, tels que MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3¹⁴, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 et^{TPM1 18} sont responsables de l’étiologie génétique de la CMH. La connaissance des variantes pathogènes dans les gènes pathogènes (p. ex. obscurine, calmoduline cytosquelettique et RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)¹⁹, alpha 2 agissant (ACTN2, OMIM: 102573)²⁰ et cystéine et protéine riche en glycine 3 (CSRP3, OMIM: 600824)²¹) a également été associée à la CMH. Les études génétiques actuelles ont identifié plusieurs variantes pathogènes distinctes dans le gène de la protéine sarcomérique chez environ 40% à 60% des patients atteints de CMH, et les tests génétiques chez les patients atteints de CMH ont révélé que la plupart des variantes pathogènes se produisent dans la chaîne lourde de myosine (MYH7) et la protéine C liant la myosine (MYBPC3). Cependant, la base génétique de la CMH reste insaisissable. Explorer la pathogénicité de ces variations qui sous-tendent les patients humains atteints de CMH reste un défi majeur²².

Dans cette étude, nous rapportons une variante pathogène de MYH7 dans une famille Han chinoise atteinte de CMH par WES. Afin de vérifier la pathogénicité de cette variante, nous avons établi une souris knockin C57BL / 6N-Myh7^{em1 (G823E)} en utilisant le système CRISPR / Cas9. Nous discutons également des mécanismes plausibles de cette variante.

Les histoires des familles ont été obtenues en interrogeant les membres de la famille. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong (n ° 2019074). Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les membres de la famille. Tous les animaux sont traités conformément aux directives éthiques de l’hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong (Guangzhou, Chine).

1. Sujets d’étude

REMARQUE: Le proband III-3 a demandé un avis médical au département de chirurgie cardiovasculaire de l’hôpital provincial de médecine chinoise du Guangdong en juillet 2019.

1. Obtenez les antécédents médicaux familiaux détaillés du proband. Informez et appelez tous les membres de la famille du proband. Tous les membres de la famille ont subi des examens physiques méticuleux.
   1. Effectuer un examen systématique de toutes les données cliniques, y compris les dossiers médicaux, les ECG, les échocardiogrammes et les rapports de cathétérisme cardiaque.
   2. Reconfirmer les phénotypes cardiaques chez tous les patients pendant l’intervention ou la chirurgie.
2. Sélectionnez un total de 174 témoins sains basés sur la population à partir de la base de données locale. Prélever environ 4,0 mL de sang veineux périphérique de chaque patient.

2. Extraction de l’ADN

REMARQUE: L’ADN est extrait avec une trousse de sang commerciale selon les instructions du fabricant.

1. Lyser les cellules sanguines avec un détergent anionique en présence d’un stabilisateur d’ADN suivant le protocole du fabricant.
2. Ajouter 10 μL de solution de RNase A au lysat cellulaire et mélanger en retournant le tube 25 fois. Incuber à 37 °C pendant 15 min à 1 h.
3. Éliminer les protéines par précipitation saline. Utilisez une solution de précipitation protéique (0,25 mg d’albumine sérique bovine dissoute dans 25 mL d’eau distillée) et 100 % d’isopropanol pour précipiter les protéines. Ensuite, utilisez 200 μL d’éthanol à 70 % et effectuez une centrifugation à 12 000 x g/min à 4 °C pendant 15 min pour laver la pastille d’ADN.
4. Récupérer l’ADN génomique par précipitation avec 500 μL d’éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Aspirer puis dissoudre la pastille dans une solution d’hydratation (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
5. Utilisez un spectrophotomètre (p. ex., NanoDrop 2000) pour déterminer la pureté. L’ADN purifié a généralement un rapport A260 / A280 compris entre 1,7 et 1,9 et peut atteindre 200 kb.
6. Conservez l’ADN à long terme à 2-8, -20 ou -80 °C.

3. Séquençage de l’exome entier et analyse des variantes

REMARQUE : Pour rechercher systématiquement des mutations génétiques causant la maladie, un séquençage de l’exome chez les personnes affectées (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 et IV-3) et les personnes non affectées (III-2, III-5, IV-4) a été effectué.

1. Utilisez la sonde exome selon les instructions du fabricant pour effectuer la capture d’exome.
2. Appliquez les bibliothèques qualifiées au séquençage d’extrémités appariées de 2 × 150 bp sur la plate-forme HiSeq X-ten. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
3. Aligner les fichiers FASTQ sur le génome de référence humain (hg19/GRCh37) avec BWA v0.7.1318,19. Triez les fichiers alignés (fichiers au format sam/bam) avec samtools, puis marquez les doublons à l’aide de Picard. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
4. Utilisez GATK, réalignez les lectures localement et recalibrez les qualités de base. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
5. Générez des statistiques de mappage qui incluent la couverture et la profondeur à partir de fichiers recalibrés par BEDTools et des scripts perl/python internes.
6. Variantes de génotype (SNV et indels) à partir de fichiers BAM recalibrés en utilisant le mode de traitement multi-échantillons de l’outil HaplotypeCaller de GATK.
7. Utilisez VQSR (variant quality score recalibration) pour réduire les faux positifs des appels de variantes.
8. Annoter les SNV et les indels à l’aide du logiciel ANNOVAR21 sur plusieurs bases de données, notamment l’Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), l’Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) et 1 000 G (http://www.1000genomes.org). Interpréter la pathogénicité des variantes de séquence conformément aux lignes directrices de l’ACMG.

4. Séquençage de Sanger

1. Effectuer le séquençage de Sanger pour confirmer les variantes causales potentielles et déterminer la ségrégation des variantes dans la famille à l’aide d’un séquenceur ABI 3500²³.
2. Concevoir les séquences d’amorce pour la variante du gène MYH7 (NM_000257) comme suit : 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' et 5'- CGGACTTCTAGCGCCTCTT -3'.
3. Confirmez une variante, examinez tous les membres de la famille disponibles pour déterminer la ségrégation des variantes au sein de la famille²³.

5. Génération de souris knockin C57BL/6N-MYH7^em1(G823E)

1. Utilisez le système CRISPR/Cas9 pour générer des souris knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E). Le gène Myh7 de la souris (numéro d’acquisition GenBank : NM_001361607.1 ; Ensembl: ENSMUSG00000053093) est situé sur le chromosome 14 de la souris et a 41 exons. Le codon de départ ATG dans l’exon 4 et le codon stop TAG dans l’exon 41, et le G823E est situé sur l’exon 23. Sélectionnez exon 23 comme site cible.
2. Concevoir la séquence du vecteur de ciblage de l’ARNg et de l’oligo donneur (avec séquence de ciblage, flanquée de séquences homologues de 134 pb combinées des deux côtés).
   1. Connectez-vous au site Web du NCBI et cliquez sur la fonction de conception d’amorce en ligne BLAST à droite.
   2. Cliquez sur la fonction Primer-BLAST au bas de la page pour concevoir des amorces.
   3. Collez le numéro de séquence de référence NCBI MYH7 NM_000257.4 dans la zone de modèle PCR.
   4. Amplifier le fragment cible (ADNc MYH7 exon 23 et ses exons adjacents) afin de concevoir l’amorce en amont sur l’exon 21 (2392-2528) et l’amorce en aval sur l’exon 25 (3205-3350). Entrez le numéro d’exon des amorces en amont et en aval dans la case de la plage de droite.
   5. Cliquez sur le bouton Obtenir les amorces en bas pour générer automatiquement plusieurs paires d’amorces .
3. Entrez le gène MYH7 dans la base de données ZFIN, introduisez le site de mutation p.g823e (GGG à GAG) dans l’oligonucléotide donneur et la mutation silencieuse p.r819 (AGG à CGA) dans l’exon 23. La mutation silencieuse empêche la liaison et le redécoupage de la séquence par l’ARNg après réparation dirigée par homologie.
   1. Concevoir l’ARNg selon la séquence générale, les séquences aux deux extrémités sont TAATACGACTCACTATA- et -GTTTTAGAGCTA. Le milieu de la séquence est le site cible mentionné ci-dessus.
4. Co-injecter l’ARNm Cas9, l’ARNg généré par transcription in vitro et l’oligo donneur dans des ovules fécondés pour la production de souris KI.
   1. Utilisez le kit de détection de l’efficacité de la cible Cas9 / gRNA pour transcrire la cible d’ARNg conçue en ARNg in vitro et détecter l’activité du transcrit (voir les instructions du kit VK007 pour des méthodes de détection spécifiques) conformément au protocole du fabricant.
   2. Décongeler les composants du kit d’ARNm ARCA T7, mélanger et pulser dans une microfuge pour recueillir les solutions au fond des tubes. Assembler la réaction à température ambiante dans l’ordre suivant : 2 mélanges ARCA/NTP à 10 μL, 1 μg d’ADN matrice, 2 μL de mélange d’ARN polymérase T7 et eau sans nucléase à 20 μL.
   3. Bien mélanger et pulser dans une microfuge. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
   4. Retirer l’ADN matrice en ajoutant 2 μL de DNase I, bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 15 min pour obtenir l’ARNm.
   5. Effectuer une injection intrapéritonéale de gonadotrophine sérique et de gonadotrophine chorionique humaine chez des souris femelles C57BL/6 pré-préparées à l’âge d’environ 4 semaines avec une seringue de 0,5 mL à une dose d’environ 5 U par souris avec un intervalle entre les deux injections de 48 h.
   6. Dix-huit heures après l’administration, sacrifiez des souris femelles C57BL/6 et une souris mâle C57BL/6 âgée de 8 à 12 semaines par luxation cervicale après injection d’hormones. Recueillir les ovules et le sperme séparément.
   7. Le sperme est capacité dans le liquide de capacité. Prenez et déposez le sperme au bord du liquide dans les ovules à courte durée de vie pour la fécondation in vitro pendant 3-4 h.
   8. Diluer l’ARNg et l’ARNm Cas9 transcrits avec succès in vitro avec de l’eau sans RNase à 25 ng / μL et 50 ng / μL. Introduire dans le cytoplasme des œufs fécondés chez la souris par microinjection. Repiquer des œufs fécondés en bon état dans l’oviducte élargi des souris femelles. Co-cage avec des souris mâles ligaturées.
5. Génotyper les chiots par PCR. Utiliser les conditions de PCR suivantes : 94 °C pendant 3 min, 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 35 s et 72 °C pendant 35 s ; 72 °C pendant 5 min. Poursuivez avec l’analyse de séquence.
   1. Coupez la queue des souris de 4 mois avec des ciseaux et placez-les dans un tube EP de 1,5 mL. Ajouter 180 μL de Buffer GL, 20 μL de Protéinase K et 10 μL de RNase A par pièce de queue (2-5 mm) dans un tube microcentrifugé. Veillez à ne pas trop couper la queue.
   2. Incuber le tube à 56 °C pendant une nuit.
   3. Faire tourner dans un tube à microcentrifuger à 1 000 x g pendant 2 min pour éliminer les impuretés.
   4. Ajouter 200 μL de Buffer GB et 200 μL d’alcool éthylique absolu en mélangeant suffisamment.
   5. Placez la colonne d’essorage dans un tube de collecte. Appliquer l’échantillon sur l’essorage et centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu.
   6. Ajouter 500 μL de Buffer WA à la colonne de spin et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
   7. Ajouter 700 μL de Buffer WB à la colonne de spin et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
      REMARQUE: Assurez-vous que le Buffer WB a été prémélangé avec de l’éthanol 100%. Lors de l’ajout de Buffer WB, ajouter à la paroi du tube pour éliminer le sel résiduel.
   8. Répétez l’étape 5.5.7.
   9. Placer la colonne d’essorage dans un tube collecteur et centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min.
   10. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 50 à 200 μL d’eau stérilisée ou de tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne et laisser reposer la colonne pendant 5 minutes.
       NOTE: Le chauffage d’eau stérilisée ou d’un tampon d’élution jusqu’à 65 °C peut augmenter le rendement d’élution.
   11. Pour éluer l’ADN, centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 2 min. Pour augmenter le rendement de l’ADN, ajoutez l’écoulement continu et/ou 50-200 μL d’eau stérilisée ou de tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne de spin et laissez la colonne reposer pendant 5 minutes. Centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min.
   12. Quantifier l’ADN génomique élué par électrophorèse.

6. Évaluation de la morphologie et de la fonction cardiaques

REMARQUE: Appliquer l’échocardiographie en mode M pour évaluer la morphologie cardiaque et la fonction des souris knockin C57BL / 6N-Myh7^{em1 (G823E).}

1. Placez les souris knockin dans une boîte en acrylique fermée connectée à l’appareil d’anesthésie et ajustez l’interface à trois voies pour permettre à l’isoflurane (concentration: 3%) de s’écouler dans la boîte en acrylique. Une fois que les souris knockin cessent de se déplacer de manière autonome, retirez les souris knockin.
2. Placez les souris knockin à plat sur la plate-forme de surveillance de la vie de l’appareil d’anesthésie pour petits animaux et l’anesthésie par inhalation continue mélangée à de l’oxygène (débit: 0,8 L / min) et de l’isoflurane (concentration: 3%). Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les souris anesthésiées pour éviter le dessèchement de la cornée.
3. Fixez les souris knockin horizontalement sur la plate-forme. Inclinez la plate-forme de 30° caudale par rapport à la souris knockin. Enlevez les poils sur la paroi thoracique antérieure de la souris qui frappe à l’aide d’une crème dépilatoire.
4. Positionnez la sonde verticalement avec la bosse face à la tête de l’animal. Ensuite, faites pivoter la sonde dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, environ 45°.
5. Dans la vue parasternale à axe long, faites pivoter la sonde de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre pour observer la vue parasternale à axe court. Après avoir fait pivoter la sonde de 90°, réglez le déplacement de l’axe y pour obtenir la bonne tranche.
6. Observez l’image du cœur sur grand axe (Figure 1C), puis sélectionnez Données de mesure en mode M.
7. Acquérir des données échographiques à partir de vues parasternales à grand axe de souris (Figure 1). La fréquence cardiaque (FC), la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG), le débit cardiaque (CO), la dimension diastolique terminale ventriculaire gauche (LVDd), la dimension systolique terminale ventriculaire gauche (LVSd), le septum interventriculaire (IVS) et la paroi postérieure ventriculaire gauche (LVPW) sont mesurés.
8. Après la mesure, fournissez de l’oxygène aux souris et replacez-les dans leurs cages respectives lorsqu’elles retrouveront une activité autonome.

Profil clinique des familles
Les pedigrees familiaux de HCM ont été obtenus et sont illustrés à la figure 2. Tous les membres de la famille documentés ont reçu un diagnostic de CMH lors de l’inscription.

Dans la famille (Figure 2A), le proband était le patient III-7, qui a reçu un diagnostic de CMH et d’obstruction des voies d’écoulement ventriculaire gauche (LVOTO) à l’âge de 46 ans et a subi une chirurgie cardiaque. Le patient III-3 avait une CMH mineure qui ne nécessitait pas de traitement chirurgical. Le patient IV-3 avait également une CMH mineure, qui était similaire à celle de son père, le patient III-3. Le patient II-5 avait une CMH et a subi une intervention chirurgicale pour réparer le défaut à l’âge de 51 ans en raison de LVOTO. Le patient I-1 et le patient II-2 sont décédés des suites d’accidents cardiaques à l’âge de 57 et 46 ans, respectivement. Les antécédents médicaux du patient I-1 n’étaient pas disponibles. Le patient II-7 et le patient III-9 présentaient un essoufflement et ont reçu un diagnostic de CMH.

Analyse de séquence d’exome et ségrégation des variantes
Dans cette famille, le séquençage de l’exome des cinq individus a généré une moyenne de 19 978 731 paires de lectures séquencées avec une longueur de lecture moyenne de 125 pb. Au total, 98,72 % des lectures séquencées ont réussi l’évaluation de la qualité et ont été cartographiées à 98,66 % du génome humain de référence. Même après filtrage, plus de 42 variantes (y compris les substitutions mononucléotidiques et les indels) ont été partagées par ces quatre patients. Parmi ceux-ci, 27 étaient des SNV faux-sens, 15 étaient prédits pour modifier l’épissage. Enfin, selon les directives de notation ACMG, un hétérozygote c.G2468A; p.G823E variant de MYH7 (NM_0002571) a été observé chez proband III-7 ainsi que chez les trois autres patients.

Identification d’une mutation pathogène
Le séquençage de Sanger a confirmé la même variante MYH7 p.G823E chez tous les patients, mais pas chez les individus en bonne santé des familles et 174 témoins (Figure 2B). L’hétérozygote MYH7 p.G823E complètement co-ségrégé dans cette famille. Dans cette famille, les patients IV-3 qui hébergeaient cette variante l’ont héritée du patient III-3. Les patients III-7 et III-8 portaient la même variante, héritée de leur père. L’information concernant le patient III-9 n’était pas disponible.

Cette variante, précédemment décrite dans HCM par un patient sporadique24, n’a pas été rapportée dans les bases de données 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar ou les sujets témoins. Le résidu de glycine au codon 823 dans la région du domaine du cou de MYH7 est hautement conservé dans toutes les séquences de myosine de vertébrés disponibles (Figure 2C). MYH7 est un gène causal connu de la CMH et joue un rôle important dans le développement ou la structure/fonction cardiaque. Sur la base des normes et directives ACMG, la variante MYH7 p.G823E a été prédite comme une variante pathogène (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Pris ensemble, ces résultats soutiennent que cette variante est préjudiciable et contribue à la pathogenèse de la CMH dans ces familles.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) souris knockin a développé une hypertrophie cardiaque sévère
Pour vérifier davantage la pathogenèse de MYH7 p.G823E, nous générons des souris knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). C57BL/6N-MYH7em1(G823E) souris knockin ont développé une hypertrophie cardiaque dépendante de l’âge après la naissance (Figure 2A,B). L’échocardiographie a révélé que l’IVS et la LVPW se sont développées avec une augmentation de la FC chez les souris knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) (tableau 1). Ces résultats ont également été validés par analyse histologique (Figure 3). Il n’y avait pas de différences évidentes dans les souris de type sauvage et hétérozygote chez les souris LVDd, LVD, EF ou CO (tableau 1).

Figure 1 : Acquisition des données échographiques. (A) La sonde est située sur l’axe long du sternum. (B) La sonde est située sur l’axe court du sternum. (C) Image échographique en mode M de la vue du sternum sur grand axe. La flèche jaune indique l’emplacement du septum interventriculaire. La flèche rouge indique la vanne flottante. (D) Image échographique en mode M de la vue du sternum sur axe court. La flèche jaune indique l’emplacement du muscle papillaire antérieur, et le renflement ci-dessous est le muscle papillaire postérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : La grande famille porteuse de la variante hétérozygote MYH7 G823E. (A) Le proband est marqué par une flèche. Les cercles et les carrés pleins et ouverts indiquent respectivement les individus affectés et normaux. (B) La variante G823E dans MYH7 confirmée par séquençage de Sanger. (C) Conservation du site MYH7 G823E chez différentes espèces. La flèche jaune représente le site de G823E dans la séquence d’acides aminés de différentes espèces, qui est hautement conservée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Changements pathologiques du tissu myocardique. (A) Les fibres myocardiques sont disposées de manière ordonnée et il n’y a pas de différence significative entre chaque partie. (B) L’hypertrophie des fibres musculaires ventriculaires, l’arrangement désordonné et les lésions sont principalement concentrées dans la paroi postérieure du ventricule gauche et du septum interventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Analyse de la morphologie et de la fonction pour p.G823E et le type sauvage. Les données ont été analysées à l’aide de SPSS. Les variables continues sont exprimées sous forme d’écart type moyen ± (ET). Les tests de somme de rang t ou Wilcoxon de Student pour les variables continues. Les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier à déclarer.