Article de méthode

Mise en œuvre d’une résection mini-invasive de tumeurs cérébrales chez les rongeurs pour une collecte de tissus à haute viabilité

DOI :

10.3791/64048

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9 mai 2022

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit une résection standardisée des tumeurs cérébrales chez les rongeurs grâce à une approche mini-invasive avec un système intégré de préservation des tissus. Cette technique a des implications pour refléter avec précision la norme de soins chez les rongeurs et d’autres modèles animaux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit un paradigme normalisé pour la résection des tumeurs cérébrales chez les rongeurs et la préservation des tissus. Dans la pratique clinique, la résection tumorale maximale est le traitement standard pour la plupart des tumeurs cérébrales. Cependant, la plupart des modèles précliniques de tumeurs cérébrales actuellement disponibles n’incluent pas la résection ou utilisent des modèles de résection chirurgicale qui prennent beaucoup de temps et entraînent une morbidité, une mortalité ou une variabilité expérimentale postopératoires importantes. En outre, la résection chez les rongeurs peut être décourageante pour plusieurs raisons, notamment le manque d’outils ou de protocoles chirurgicaux cliniquement comparables et l’absence d’une plate-forme établie pour la collecte de tissus standardisée. Ce protocole met en évidence l’utilisation d’un dispositif de résection multifonctionnel et non ablatif et d’un système intégré de préservation tissulaire adapté de la version clinique du dispositif. Le dispositif appliqué dans la présente étude combine une aspiration accordable et une lame cylindrique à l’ouverture pour sonder, couper et aspirer avec précision les tissus. Le dispositif de résection mini-invasif remplit ses fonctions via le même trou de bavure utilisé pour l’implantation initiale de la tumeur. Cette approche minimise les altérations de l’anatomie régionale lors des chirurgies de biopsie ou de résection et réduit le risque de perte de sang importante. Ces facteurs ont considérablement réduit le temps opératoire (<2 min/animal), amélioré la survie postopératoire des animaux, réduit la variabilité dans les groupes expérimentaux et entraîné une viabilité élevée des tissus et cellules réséqués pour les analyses futures. Ce processus est facilité par une vitesse de lame de ~1 400 cycles/min, ce qui permet la récolte de tissus dans un système fermé stérile qui peut être rempli avec une solution physiologique de choix. Compte tenu de l’importance émergente de l’étude et de la modélisation précise de l’impact de la chirurgie, de la préservation et de l’analyse comparative rigoureuse des échantillons de résection tumorale régionalisés et des thérapies administrées dans la cavité, ce protocole unique élargira les possibilités d’explorer des questions sans réponse sur la prise en charge périopératoire et la découverte thérapeutique pour les patients atteints de tumeurs cérébrales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus courante et la plus agressive chez l’adulte. Malgré les progrès récents de la neurochirurgie, du développement de médicaments ciblés et de la radiothérapie, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de GBM est inférieur à 5%, une statistique qui ne s’est pas améliorée de manière significative depuis plus de trois décennies1. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point des stratégies de traitement plus efficaces.

Pour développer de nouvelles thérapies, il devient de plus en plus évident que les protocoles expérimentaux doivent (1) utiliser des modèles précliniques traduisibles qui récapitulent avec précision l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement, (2) refléter le schéma thérapeutique standard utilisé chez les patients atteints de GBM, qui comprend actuellement la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, et (3) tenir compte de la différence entre le noyau réséqué et le résidu, tissus tumoraux invasifs 2,3,4,5. Cependant, la plupart des modèles précliniques de tumeurs cérébrales actuellement disponibles ne mettent pas en œuvre la résection chirurgicale ou utilisent des modèles de résection chirurgicale qui prennent relativement de temps, ce qui entraîne une perte de sang importante ou manque de normalisation. De plus, la résection des tumeurs cérébrales de rongeurs peut être difficile en raison d’un manque d’outils ou de protocoles chirurgicaux cliniquement comparables et de l’absence d’une plate-formeétablie 6 pour la collecte systématique de tissus (tableau 1).

Le présent protocole vise à décrire un paradigme standardisé pour la résection des tumeurs cérébrales chez les rongeurs et la préservation des tissus à l’aide d’un système de résection mini-invasive non ablatif multifonctionnel (MIRS) et d’un système intégré de préservation tissulaire (TPS) (Figure 1). On s’attend à ce que cette technique unique fournisse une plate-forme standardisée pouvant être utilisée dans diverses études de recherche préclinique sur le GBM et d’autres types de modèles de tumeurs cérébrales. Les chercheurs qui étudient les modalités thérapeutiques ou diagnostiques des tumeurs cérébrales peuvent mettre en œuvre ce protocole pour obtenir une résection standardisée dans leurs études.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par l’Université du Maryland et le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Johns Hopkins. Des souris femelles C57BL/6, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Tous les règlements de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ont été respectés, y compris l’utilisation de masques, de gants et de blouses.

1. Implantation initiale de la tumeur intracrânienne

  1. Lors de la phase initiale de l’étude, injecter par voie intracrânienne à chaque souris 100 000 cellules (lignée cellulaire de gliome murin GL261) en suspension dans 4 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) à une profondeur de 2,5 mm suivant le rapport publié précédemment7.
  2. Quantifier le signal tumoral chez chaque souris à l’aide du système d’imagerie in vivo 8 à 9 jours après l’implantation de la tumeur.
    REMARQUE: Si nécessaire, stratifier les souris en deux groupes en fonction de la charge tumorale. Dans la présente étude, les deux groupes étaient: (1) des souris avec une charge tumorale relativement faible (signal bioluminescent moyen = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 photons / s, n = 10) et (2) des souris avec une charge tumorale relativement importante (signal bioluminescent moyen = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 photons / s, n = 10), (p < 0,05, test de Mann-Whitney)9.
  3. Divisez chaque groupe en deux sous-groupes comparables.
    NOTE: Dans cette étude, les deux sous-groupes étaient: les souris non traitées (n = 5) et les souris avec des tumeurs subissant une résection chirurgicale en utilisant le MIRS (n = 5), (p > 0,05, test de Mann-Whitney)9.
  4. À partir du jour de la résection, suivez la progression tumorale à l’aide du système d’imagerie in vivo à une fréquence basée sur le modèle de croissance tumorale.
    REMARQUE: Pour la lignée cellulaire GL261, suivez la progression tumorale le jour de la résection, puis tous les 3-6 jours.

2. Résection tumorale à l’aide de MIRS

  1. Anesthésier la souris à l’aide d’un mélange gazeux isoflurane-O2 dans une chambre d’induction ou d’une injection intrapéritonéale de solution xylazine/kétamine.
    1. Si vous utilisez l’anesthésique gazeux, réglez le débit de gaz à 1,0 mL/min et le vaporisateur à 2,0 % pour l’induction de l’anesthésie, nécessitant généralement 3 à 5 minutes dans la chambre (voir le tableau des matériaux).
    2. Si vous utilisez l’anesthésique injectable, anesthésiez les souris en injectant 0,2 mL de solution anesthésique (80-100 mg/kg de kétamine et 10-12,5 mg/kg de xylazine, voir le tableau des matières) par voie intrapéritonéale.
  2. Évaluez la sédation adéquate de l’animal en pinçant l’orteil. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse de la cornée. Administrer un analgésique (0,03-0,06 mg / kg de buprénorphine par voie sous-cutanée) avant la procédure.
  3. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique (voir le tableau des matériaux) une fois que la sédation complète a été confirmée.
    REMARQUE: Si vous utilisez l’anesthésique gazeux, placez le nez de la souris dans un cône nasal où elle continuera à recevoir le mélange isoflurane-O2 pendant la procédure (1,5%).
  4. Enlevez l’agrafe précédente, puis retirez les poils soit avec une crème dépilatoire, soit en vous rasant. Désinfectez la peau avec des cycles alternés d’un gommage à base de chlorhexidine/bétadine et d’alcool. Ensuite, à l’aide d’un scalpel stérile, créez une incision longitudinale médiane de 1 cm le long de la cicatrice chirurgicale précédente.
  5. Fixez la pièce à main MIRS au bras stéréotaxique à travers l’adaptateur de scène/support de pièce à main pour une stabilité et une précision accrues.
  6. Configurez la machine MIRS (voir Tableau des matériaux) en utilisant les paramètres suivants (Figure 1).
    1. Insérez le cordon d’alimentation situé sur le panneau arrière dans la prise du cordon d’alimentation. Allumez ou éteignez le système en activant (1 = ON, 0 = OFF).
    2. Insérez une extrémité du tuyau d’azote (fourni avec la console) dans le raccord mâle sur le panneau arrière de la console. Faites pivoter l’écrou de connexion dans le sens des aiguilles d’une montre pour serrer la connexion.
      REMARQUE: L’extrémité opposée du tuyau doit être connectée à l’alimentation en azote.
    3. Avant de fixer le tuyau à l’alimentation en azote, vérifiez que la pression d’alimentation ne dépasse pas 100 psig, qui est la pression d’alimentation d’entrée recommandée pour la console.
      REMARQUE: La console génère sa propre aspiration lorsqu’elle est activée par la pédale une fois que l’azote a été fourni à la console.
    4. Fixez le couvercle de l’orifice de vide et scellez-le pour éviter toute fuite dans le système de vide. Toute fuite dans le système d’aspiration affectera les performances de la console MIRS.
    5. Si l’aspiration est inférieure à 17 pendant la configuration ou l’amorçage, vérifiez que le bouton d’aspiration situé à l’avant de la console est réglé au niveau maximal (100), assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite dans le système d’aspiration et confirmez que la pression d’alimentation en azote est correcte.
    6. Pour connecter la pédale à la console, insérez le connecteur de pédale gris dans sa prise grise jusqu’à ce qu’il s’enclenche et s’insère en position.
      REMARQUE: Le connecteur de pédale se connecte à la console dans une orientation et il est verrouillé.
    7. Pour connecter la pièce à main à la console, insérez le connecteur bleu de la pièce à main dans sa prise bleue jusqu’à ce qu’il s’enclenche et se mette en position.
      REMARQUE: Le connecteur de pièce à main se connecte à la console dans une orientation et il est verrouillé.
    8. Amorcez chaque pièce à main avant d’utiliser le système en aspirant le liquide stérile d’un petit bol dans l’ouverture, à travers le tube et la pièce à main, puis dans la cartouche pour s’assurer que l’intérieur du tube et de la pièce à main est lubrifié pour réduire les occlusions tissulaires.
    9. Préparez-vous à l’aspiration seule ou à l’aspiration avec coupe en sélectionnant le mode approprié sur le panneau avant de la console. Initiez à l’aide de la pédale.
  7. Insérez la canule MIRS de 23 G dans le trou de bavure jusqu’à une profondeur de 2,5 mm.
  8. Lancez le processus de résection en appuyant sur la pédale reliée à la canule. Effectuez un cycle complet (360°) ou plus de résection à l’aide du bouton de commande de la pièce à main.
    REMARQUE: Plus il y a de cycles effectués, plus le volume de tissu tumoral réséqué est important.
  9. Une fois le processus de résection terminé, retirez la canule MIRS de 23 G du trou de bavure et utilisez 5 mL de 1x PBS pour rincer le tube et déloger tout débris résiduel.
  10. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez la plaie avec une agrafeuse ou un matériau de suture 4-0 (voir le tableau des matériaux).
  11. Placez la souris sur un coussin chauffant ou sous une lumière chauffante pendant la récupération de l’anesthésie avant de la remettre dans sa cage.
  12. Une fois l’expérience terminée, purgez la canule par rinçage. Alternez avec des fluides réfrigérés et de l’air pour « repousser » tout le tissu réséqué vers la boîte de collecte. Retirez la boîte de collecte du système et refermez le bouchon avec le bouchon fourni.
  13. Après avoir terminé l’étape 2.12, placer l’extrémité distale de la canule dans 3 % H 2 O2et appliquer une aspiration à 24-25 dans Hg pour remplir la conduite d’aspiration jusqu’à la cartouche de collecte d’aspiration et laisser reposer pendant 60-90 s. Rincer avec un milieu stérile en pulsant de l’air et du média par intermittence.
  14. Surveillez les souris pour tout signe neurologique (mouvements erratiques anormaux ou convulsions) après la procédure.
  15. Euthanasier les souris présentant de graves troubles neurologiques (devenir léthargiques, avoir une apparence maigre, se pencher en arrière ou avoir des mouvements erratiques).
    REMARQUE : Pour la présente étude, 200 mg/kg d’une solution d’euthanasie disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) ont été utilisés pour euthanasier chaque souris.

3. Collecte de tissus via TPS

  1. Immerger l’échantillon tumoral dans une boîte de culture tissulaire contenant un milieu de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux) pendant 5 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Les tissus prélevés à partir du MIRS dans le TPS seront principalement sous forme de cellules individuelles avec de petits morceaux de tissu.
  2. Placez un filtre de 70 μm (voir le tableau des matériaux) sur un tube conique de 50 ml et utilisez un piston d’une seringue de 5 ml pour faire passer l’échantillon tumoral à travers le filtre.
  3. Avec une pipette de transfert, utilisez le média RPMI-1640 pour faciliter le passage des cellules et de toute masse tissulaire à travers le filtre.
  4. Centrifuger à 428 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  5. Remettez chaque échantillon en suspension dans 5 mL de milieu RPMI-1640 préparé.
  6. Pour augmenter la viabilité des tissus, en particulier si de gros morceaux de tissu sont visualisés lors de l’impression initiale, ajoutez les volumes requis du cocktail enzymatique (contenant la DNAse I, la collagénase IV, la dispase, la papaïne et l’EDTA, voir le tableau des matériaux) à chaque échantillon. Utilisez le vortex pour mélanger les solutions.
    Remarque : L’étape 3.6 est facultative. La composition du cocktail enzymatique (pour un volume total de 5 mL/échantillon) : 300 μL d’ADN I de grade II, 150 μL de collagénase/dispase (clive fibronectine, collagénase IV, I et acides aminés non polaires), 250 μL de papaïne (protéase non spécifique) et 6 μL de 0,5 M EDTA.
  7. Placer les échantillons dans un incubateur à agitateur réglé à 200 tr/min, 37 °C pendant 20 min.
  8. Après 20 min, faire tourner les échantillons à 428 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  9. Filtrer les cellules individuelles à travers une crépine de 70 μm et faire tourner vers le bas à 274 x g pendant 3 min à 4 °C. Effectuer une analyse de viabilité cellulaire10 avec du bleu de trypan et de l’hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: La viabilité du jour 0 varie de 30% à 70% et augmente considérablement en 2-3 jours.
  10. Passez aux étapes 4, 5 ou 6, selon le test de viabilité requis.

4. Croissance de cellules en culture adhérente

  1. Dans une hotte à flux laminaire certifiée, remettre en suspension la pastille dans un milieu adhérent contenant du sérum (tel que le DMEM, le sérum bovin fœtal à 10 % (FBS) et la solution de pénicilline/streptomycine (P/S)) et des cellules en plaques dans une fiole de cellules adhérentes.
  2. Maintenir les cellules dans un environnement incubé contrôlé (37 °C, 5% CO2).

5. Croissance de cellules en culture en suspension (neurosphères)

  1. Dans une hotte à flux laminaire certifiée, remettre en suspension la pastille dans un milieu complet de cellules souches11 sans sérum et la plaque dans une fiole de suspension.
  2. Maintenir les cellules dans un environnement incubé contrôlé (37 °C, 5% CO 2) pendant2-3 jours pour permettre la formation de la neurosphère.
  3. Après visualisation des neurosphères dans le milieu de culture, utiliser la trypsine-EDTA ou l’Accutase (voir le tableau des matériaux) pour obtenir des suspensions unicellulaires pour le passage.
    REMARQUE : Tant que des précautions particulières sont prises pendant la récolte et que des milieux appropriés soutenant les cellules souches neurales sont utilisés, les cellules souches dans le tissu prélevé doivent former des neurosphères en quelques jours.

6. Préparation des cellules pour la réimplantation

  1. Remettez la pastille en suspension à une concentration de 100 000 cellules vivantes par 4 μL de 1x PBS.
  2. Injecter immédiatement à des souris naïves en utilisant la méthode d’implantation tumorale intracrânienne (étape 1).

7. Analyse histologique

  1. Immédiatement après la résection, extraire et fixer la cervelle dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant 24 h12.
  2. Transférer les cerveaux dans une solution de saccharose à 30% jusqu’à ce qu’ils soient saturés de saccharose (enfoncé au fond du récipient).
  3. Transférer le cerveau dans une solution d’éthanol à 70%.
  4. Effectuer l’enrobage et la sectionnement des blocs de paraffine et la coloration standard de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) à la suite du rapport13 publié précédemment.
    NOTE: L’épaisseur de chaque section prise pour la coloration était de 10 μm.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résection chirurgicale à l’aide du MIRS entraîne une diminution significative de la charge tumorale
Dans le groupe avec une charge tumorale plus faible, le signal bioluminescent moyen de base était de 5,5e + 006 photons / s ± 0,2e + 006 dans le sous-groupe qui a subi une résection. Après résection, le signal bioluminescent moyen a diminué à 3,09e+006 photons/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, test de Mann-Whitney)9 (Figure 2).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résection tumorale est une pierre angulaire des plans de traitement neurochirurgical oncologique pour les tumeurs cérébrales de bas et de haut grade. La cytoréduction et la réduction tumorale sont en corrélation avec l’amélioration de la fonction neurologique et de la survie globale chez les patients atteints de tumeurs cérébrales 1,2,5,6. Bien que les protocoles de résection chirurgicale ai...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BT bénéficie d’un financement de recherche des NIH et est copropriétaire d’Accelerating Combination Therapies*, et Ashvattha Therapeutics Inc. a concédé sous licence l’un de ses brevets. GW bénéficie d’un financement des NIH (R01NS107813). HB est consultant rémunéré pour Insightec et président du conseil consultatif médical de la société. Cet arrangement a été examiné et approuvé par l’Université Johns Hopkins à la suite de ses politiques sur les conflits d’intérêts. HB bénéficie de fonds de recherche des NIH, de l’Université Johns Hopkins et de philanthropie et est consultant pour CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* et Nurami Medical *. (*Comprend les actions ou les options).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringues de 1 mLTubes coniques BD309628
15 mLCorning430052
Pipettes à 200 mL d’éthanolPharmCo111000200
de 5 mLFiltre CoStar4487
Filtre de 70 micronsFisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased (Xylazine injectable, 100 mg/mL)Covetrus33198
Système d’anesthésiePatterson Scientific78935903
Conteneur à déchets de gaz anesthésiquePatterson Scientific78909457
Bench protector underpadCovidien10328
C57Bl/6, souris âgées de 6 à 8 semainesCharles River LaboratoriesCode de souche 027
ChroMini ProMoserType 1591-Q
Collagénase-DispaseRoche#10269638001
Compteur de cellules automatisé Countess IIThermo Fisher
Countess II FL HemacytometerThermo FisherA25750
Solution d’élimination des débrisMiltenyi Biotech#130-109-398
D-LuciferinGoldbioLUCK-1G
DMEM F12 médiaCorning10-090-CV
média DMEMCorning10-013-CV
DNAse ISigma Aldrich#10104159001
Eppendorf tubesPosi-Click1149K01
Solution d’euthanasieHenry Schein71073
FBSMillipore SigmaF4135
Sérum de veau fœtalThermo Fisher10437-028
FormalinInvitrogenINV-28906
GauzeHenry Schein101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
HéparineSigmaH-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
Chambre à inductionPatterson Scientific78933388
IsofluraneCovetrus11695-6777-2
Vaporisateur d’isofluranePatterson Scientific78916954
KétamineCovetrus11695-0703-1
Kopf Cadre stéréotaxiqueKopf Instruments5001
Microscope à champ lumineuxBioTekCytation 5
Unité de micro-injectionKopf5001
Perceuse à micromoteurForedomF210418
système IRMBruker7T Biospec Avance III Scanner
NICO Myriad System NICOCorporation
Pommade ophtalmiquePuralube vetur
PapainSigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
PenStrepMillipore SigmaN1638
Percoll solutionSigma Aldrich#P4937
Contrôleur de pipetteFalconA07260
Povidone iode solutionAplicare52380-1905-08
ProgestéroneSigmaP-8783
PutrescineSigmaP-5780
RPMI MediaInvitrogenINV-72400120
Lame de scalpelCovetrus7319
Manche de scalpelFine Science Tools91003-12
Marqueur de peauTime OutD538,851
Agrafe décapantMikRonACR9MM
AgrafeuseMikRonACA9MM
AgrafesClay Adams427631
Cadre stéréotaxiqueKopf Instruments5000
SucroseSigma AldrichS9378
Suture, vicryl 4-0EthiconJ494H
T-75 flaconde cultureSarstedt83-3911-002
Tampon de lyse TheraPEAKTM ACK (1x)LonzaBP10-548E
Trypsine-EDTACorningMDT-25-053-CI

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Chirurgie minimalement invasiveMod le tumoral chez le rongeurPr servation tissulaireChirurgie st r otaxiqueViabilit des cellules tumoralesCollecte automatis e de tissusFormation de neurosph resAnalyse de la viabilit cellulaireTumeur c r brale pr clinique

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