Mise en œuvre d’une résection mini-invasive de tumeurs cérébrales chez les rongeurs pour une collecte de tissus à haute viabilité

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus courante et la plus agressive chez l’adulte. Malgré les progrès récents de la neurochirurgie, du développement de médicaments ciblés et de la radiothérapie, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de GBM est inférieur à 5%, une statistique qui ne s’est pas améliorée de manière significative depuis plus de trois décennies¹. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point des stratégies de traitement plus efficaces.

Pour développer de nouvelles thérapies, il devient de plus en plus évident que les protocoles expérimentaux doivent (1) utiliser des modèles précliniques traduisibles qui récapitulent avec précision l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement, (2) refléter le schéma thérapeutique standard utilisé chez les patients atteints de GBM, qui comprend actuellement la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, et (3) tenir compte de la différence entre le noyau réséqué et le résidu, tissus tumoraux invasifs 2,3,4,5. Cependant, la plupart des modèles précliniques de tumeurs cérébrales actuellement disponibles ne mettent pas en œuvre la résection chirurgicale ou utilisent des modèles de résection chirurgicale qui prennent relativement de temps, ce qui entraîne une perte de sang importante ou manque de normalisation. De plus, la résection des tumeurs cérébrales de rongeurs peut être difficile en raison d’un manque d’outils ou de protocoles chirurgicaux cliniquement comparables et de l’absence d’une plate-forme^{établie 6} pour la collecte systématique de tissus (tableau 1).

Le présent protocole vise à décrire un paradigme standardisé pour la résection des tumeurs cérébrales chez les rongeurs et la préservation des tissus à l’aide d’un système de résection mini-invasive non ablatif multifonctionnel (MIRS) et d’un système intégré de préservation tissulaire (TPS) (Figure 1). On s’attend à ce que cette technique unique fournisse une plate-forme standardisée pouvant être utilisée dans diverses études de recherche préclinique sur le GBM et d’autres types de modèles de tumeurs cérébrales. Les chercheurs qui étudient les modalités thérapeutiques ou diagnostiques des tumeurs cérébrales peuvent mettre en œuvre ce protocole pour obtenir une résection standardisée dans leurs études.

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par l’Université du Maryland et le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Johns Hopkins. Des souris femelles C57BL/6, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). Tous les règlements de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ont été respectés, y compris l’utilisation de masques, de gants et de blouses.

1. Implantation initiale de la tumeur intracrânienne

1. Lors de la phase initiale de l’étude, injecter par voie intracrânienne à chaque souris 100 000 cellules (lignée cellulaire de gliome murin GL261) en suspension dans 4 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) à une profondeur de 2,5 mm suivant le rapport publié précédemment⁷.
2. Quantifier le signal tumoral chez chaque souris à l’aide du système d’imagerie in vivo ⁸ à 9 jours après l’implantation de la tumeur.
   REMARQUE: Si nécessaire, stratifier les souris en deux groupes en fonction de la charge tumorale. Dans la présente étude, les deux groupes étaient: (1) des souris avec une charge tumorale relativement faible (signal bioluminescent moyen = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 photons / s, n = 10) et (2) des souris avec une charge tumorale relativement importante (signal bioluminescent moyen = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 photons / s, n = 10), (p < 0,05, test de Mann-Whitney)⁹.
3. Divisez chaque groupe en deux sous-groupes comparables.
   NOTE: Dans cette étude, les deux sous-groupes étaient: les souris non traitées (n = 5) et les souris avec des tumeurs subissant une résection chirurgicale en utilisant le MIRS (n = 5), (p > 0,05, test de Mann-Whitney)⁹.
4. À partir du jour de la résection, suivez la progression tumorale à l’aide du système d’imagerie in vivo à une fréquence basée sur le modèle de croissance tumorale.
   REMARQUE: Pour la lignée cellulaire GL261, suivez la progression tumorale le jour de la résection, puis tous les 3-6 jours.

2. Résection tumorale à l’aide de MIRS

1. Anesthésier la souris à l’aide d’un mélange gazeux isoflurane-O2 dans une chambre d’induction ou d’une injection intrapéritonéale de solution xylazine/kétamine.
   1. Si vous utilisez l’anesthésique gazeux, réglez le débit de gaz à 1,0 mL/min et le vaporisateur à 2,0 % pour l’induction de l’anesthésie, nécessitant généralement 3 à 5 minutes dans la chambre (voir le tableau des matériaux).
   2. Si vous utilisez l’anesthésique injectable, anesthésiez les souris en injectant 0,2 mL de solution anesthésique (80-100 mg/kg de kétamine et 10-12,5 mg/kg de xylazine, voir le tableau des matières) par voie intrapéritonéale.
2. Évaluez la sédation adéquate de l’animal en pinçant l’orteil. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse de la cornée. Administrer un analgésique (0,03-0,06 mg / kg de buprénorphine par voie sous-cutanée) avant la procédure.
3. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique (voir le tableau des matériaux) une fois que la sédation complète a été confirmée.
   REMARQUE: Si vous utilisez l’anesthésique gazeux, placez le nez de la souris dans un cône nasal où elle continuera à recevoir le mélange isoflurane-O₂ pendant la procédure (1,5%).
4. Enlevez l’agrafe précédente, puis retirez les poils soit avec une crème dépilatoire, soit en vous rasant. Désinfectez la peau avec des cycles alternés d’un gommage à base de chlorhexidine/bétadine et d’alcool. Ensuite, à l’aide d’un scalpel stérile, créez une incision longitudinale médiane de 1 cm le long de la cicatrice chirurgicale précédente.
5. Fixez la pièce à main MIRS au bras stéréotaxique à travers l’adaptateur de scène/support de pièce à main pour une stabilité et une précision accrues.
6. Configurez la machine MIRS (voir Tableau des matériaux) en utilisant les paramètres suivants (Figure 1).
   1. Insérez le cordon d’alimentation situé sur le panneau arrière dans la prise du cordon d’alimentation. Allumez ou éteignez le système en activant (1 = ON, 0 = OFF).
   2. Insérez une extrémité du tuyau d’azote (fourni avec la console) dans le raccord mâle sur le panneau arrière de la console. Faites pivoter l’écrou de connexion dans le sens des aiguilles d’une montre pour serrer la connexion.
      REMARQUE: L’extrémité opposée du tuyau doit être connectée à l’alimentation en azote.
   3. Avant de fixer le tuyau à l’alimentation en azote, vérifiez que la pression d’alimentation ne dépasse pas 100 psig, qui est la pression d’alimentation d’entrée recommandée pour la console.
      REMARQUE: La console génère sa propre aspiration lorsqu’elle est activée par la pédale une fois que l’azote a été fourni à la console.
   4. Fixez le couvercle de l’orifice de vide et scellez-le pour éviter toute fuite dans le système de vide. Toute fuite dans le système d’aspiration affectera les performances de la console MIRS.
   5. Si l’aspiration est inférieure à 17 pendant la configuration ou l’amorçage, vérifiez que le bouton d’aspiration situé à l’avant de la console est réglé au niveau maximal (100), assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite dans le système d’aspiration et confirmez que la pression d’alimentation en azote est correcte.
   6. Pour connecter la pédale à la console, insérez le connecteur de pédale gris dans sa prise grise jusqu’à ce qu’il s’enclenche et s’insère en position.
      REMARQUE: Le connecteur de pédale se connecte à la console dans une orientation et il est verrouillé.
   7. Pour connecter la pièce à main à la console, insérez le connecteur bleu de la pièce à main dans sa prise bleue jusqu’à ce qu’il s’enclenche et se mette en position.
      REMARQUE: Le connecteur de pièce à main se connecte à la console dans une orientation et il est verrouillé.
   8. Amorcez chaque pièce à main avant d’utiliser le système en aspirant le liquide stérile d’un petit bol dans l’ouverture, à travers le tube et la pièce à main, puis dans la cartouche pour s’assurer que l’intérieur du tube et de la pièce à main est lubrifié pour réduire les occlusions tissulaires.
   9. Préparez-vous à l’aspiration seule ou à l’aspiration avec coupe en sélectionnant le mode approprié sur le panneau avant de la console. Initiez à l’aide de la pédale.
7. Insérez la canule MIRS de 23 G dans le trou de bavure jusqu’à une profondeur de 2,5 mm.
8. Lancez le processus de résection en appuyant sur la pédale reliée à la canule. Effectuez un cycle complet (360°) ou plus de résection à l’aide du bouton de commande de la pièce à main.
   REMARQUE: Plus il y a de cycles effectués, plus le volume de tissu tumoral réséqué est important.
9. Une fois le processus de résection terminé, retirez la canule MIRS de 23 G du trou de bavure et utilisez 5 mL de 1x PBS pour rincer le tube et déloger tout débris résiduel.
10. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez la plaie avec une agrafeuse ou un matériau de suture 4-0 (voir le tableau des matériaux).
11. Placez la souris sur un coussin chauffant ou sous une lumière chauffante pendant la récupération de l’anesthésie avant de la remettre dans sa cage.
12. Une fois l’expérience terminée, purgez la canule par rinçage. Alternez avec des fluides réfrigérés et de l’air pour « repousser » tout le tissu réséqué vers la boîte de collecte. Retirez la boîte de collecte du système et refermez le bouchon avec le bouchon fourni.
13. Après avoir terminé l’étape 2.12, placer l’extrémité distale de la canule dans 3 % H 2 O₂et appliquer une aspiration à 24-25 dans Hg pour remplir la conduite d’aspiration jusqu’à la cartouche de collecte d’aspiration et laisser reposer pendant 60-90 s. Rincer avec un milieu stérile en pulsant de l’air et du média par intermittence.
14. Surveillez les souris pour tout signe neurologique (mouvements erratiques anormaux ou convulsions) après la procédure.
15. Euthanasier les souris présentant de graves troubles neurologiques (devenir léthargiques, avoir une apparence maigre, se pencher en arrière ou avoir des mouvements erratiques).
    REMARQUE : Pour la présente étude, 200 mg/kg d’une solution d’euthanasie disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) ont été utilisés pour euthanasier chaque souris.

3. Collecte de tissus via TPS

1. Immerger l’échantillon tumoral dans une boîte de culture tissulaire contenant un milieu de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux) pendant 5 minutes à température ambiante.
   REMARQUE: Les tissus prélevés à partir du MIRS dans le TPS seront principalement sous forme de cellules individuelles avec de petits morceaux de tissu.
2. Placez un filtre de 70 μm (voir le tableau des matériaux) sur un tube conique de 50 ml et utilisez un piston d’une seringue de 5 ml pour faire passer l’échantillon tumoral à travers le filtre.
3. Avec une pipette de transfert, utilisez le média RPMI-1640 pour faciliter le passage des cellules et de toute masse tissulaire à travers le filtre.
4. Centrifuger à 428 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
5. Remettez chaque échantillon en suspension dans 5 mL de milieu RPMI-1640 préparé.
6. Pour augmenter la viabilité des tissus, en particulier si de gros morceaux de tissu sont visualisés lors de l’impression initiale, ajoutez les volumes requis du cocktail enzymatique (contenant la DNAse I, la collagénase IV, la dispase, la papaïne et l’EDTA, voir le tableau des matériaux) à chaque échantillon. Utilisez le vortex pour mélanger les solutions.
   Remarque : L’étape 3.6 est facultative. La composition du cocktail enzymatique (pour un volume total de 5 mL/échantillon) : 300 μL d’ADN I de grade II, 150 μL de collagénase/dispase (clive fibronectine, collagénase IV, I et acides aminés non polaires), 250 μL de papaïne (protéase non spécifique) et 6 μL de 0,5 M EDTA.
7. Placer les échantillons dans un incubateur à agitateur réglé à 200 tr/min, 37 °C pendant 20 min.
8. Après 20 min, faire tourner les échantillons à 428 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
9. Filtrer les cellules individuelles à travers une crépine de 70 μm et faire tourner vers le bas à 274 x g pendant 3 min à 4 °C. Effectuer une analyse de viabilité cellulaire¹⁰ avec du bleu de trypan et de l’hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: La viabilité du jour 0 varie de 30% à 70% et augmente considérablement en 2-3 jours.
10. Passez aux étapes 4, 5 ou 6, selon le test de viabilité requis.

4. Croissance de cellules en culture adhérente

1. Dans une hotte à flux laminaire certifiée, remettre en suspension la pastille dans un milieu adhérent contenant du sérum (tel que le DMEM, le sérum bovin fœtal à 10 % (FBS) et la solution de pénicilline/streptomycine (P/S)) et des cellules en plaques dans une fiole de cellules adhérentes.
2. Maintenir les cellules dans un environnement incubé contrôlé (37 °C, 5% CO₂).

5. Croissance de cellules en culture en suspension (neurosphères)

1. Dans une hotte à flux laminaire certifiée, remettre en suspension la pastille dans un milieu complet de cellules souches¹¹ sans sérum et la plaque dans une fiole de suspension.
2. Maintenir les cellules dans un environnement incubé contrôlé (37 °C, 5% CO 2) pendant_2-3 jours pour permettre la formation de la neurosphère.
3. Après visualisation des neurosphères dans le milieu de culture, utiliser la trypsine-EDTA ou l’Accutase (voir le tableau des matériaux) pour obtenir des suspensions unicellulaires pour le passage.
   REMARQUE : Tant que des précautions particulières sont prises pendant la récolte et que des milieux appropriés soutenant les cellules souches neurales sont utilisés, les cellules souches dans le tissu prélevé doivent former des neurosphères en quelques jours.

6. Préparation des cellules pour la réimplantation

1. Remettez la pastille en suspension à une concentration de 100 000 cellules vivantes par 4 μL de 1x PBS.
2. Injecter immédiatement à des souris naïves en utilisant la méthode d’implantation tumorale intracrânienne (étape 1).

7. Analyse histologique

1. Immédiatement après la résection, extraire et fixer la cervelle dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant 24 h¹².
2. Transférer les cerveaux dans une solution de saccharose à 30% jusqu’à ce qu’ils soient saturés de saccharose (enfoncé au fond du récipient).
3. Transférer le cerveau dans une solution d’éthanol à 70%.
4. Effectuer l’enrobage et la sectionnement des blocs de paraffine et la coloration standard de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) à la suite du rapport¹³ publié précédemment.
   NOTE: L’épaisseur de chaque section prise pour la coloration était de 10 μm.

La résection chirurgicale à l’aide du MIRS entraîne une diminution significative de la charge tumorale
Dans le groupe avec une charge tumorale plus faible, le signal bioluminescent moyen de base était de 5,5e + 006 photons / s ± 0,2e + 006 dans le sous-groupe qui a subi une résection. Après résection, le signal bioluminescent moyen a diminué à 3,09e+006 photons/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, test de Mann-Whitney)9 (Figure 2). Le signal bioluminescent a augmenté dans les jours suivants jusqu’à ce que les souris soient euthanasiées. De même, dans le groupe avec une charge tumorale plus importante, le signal bioluminescent moyen de base était de 1,68e + 007 photons / s ± 0,1e + 007 dans le sous-groupe qui a subi une résection. Après la résection, le signal bioluminescent moyen a diminué à 5,19e+006 photons/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, test de Mann-Whitney)9. Le signal bioluminescent a augmenté dans les jours suivants jusqu’à ce que les souris soient euthanasiées.

La résection à l’aide du MIRS peut être ajustée en fonction du volume de résection souhaité
Dans l’imagerie pré-résection des tumeurs syngéniques CT2A, la tumeur peut généralement être identifiée comme une masse hétérogène au site d’inoculation avec une architecture parenchymateuse perturbée et un œdème péritumoral et une hémorragie indiqués par des zones hétérogènes d’hypo- et hyper-intensité pondérées en T2 (T2w). La piste d’aiguille utilisée pour l’injection stéréotaxique de cellules tumorales peut être identifiée sur les IRM T2w14.

La cavité de résection peut être identifiée sur les IRM T2w post-résection comme une grande zone hypointense ronde au site d’inoculation de la tumeur (Figure 3). La procédure de résection n’a pas causé de perte de sang significative ou de perturbation de l’architecture cérébrale environnante. Dans certains cas, le liquide s’est accumulé dans la cavité de résection. Comme le montre la figure 4, le volume de résection a significativement augmenté, passant de 9,4 mm3 pour une rotation de l’ouverture de coupe à 23,2mm3 pour deux rotations (p = 0,0117), permettant d’ajuster la résection volumique pour optimiser une charge tumorale connue.

La résection tumorale à l’aide du MIRS entraîne un allongement de 7 jours de la survie médiane des souris porteuses de tumeurs sans induire de signes neurologiques
Comme le montre la figure 5, il y avait une prolongation de la survie des souris ayant subi une résection chirurgicale dans les deux groupes avec de petites (6 jours) et de grandes (7 jours) tumeurs. Dans le groupe avec une charge tumorale plus petite, la survie médiane du sous-groupe témoin était de 16 jours, tandis que la survie médiane du sous-groupe ayant subi une résection était de 22 jours (p = 0,0044). De même, dans le groupe avec une charge tumorale plus importante, la survie médiane du sous-groupe témoin était de 12 jours, tandis que la survie médiane du sous-groupe ayant subi une résection était de 19 jours (p = 0,0043). De plus, aucune des souris subissant une résection à l’aide du MIRS n’a montré de signe de lésion neurologique après la procédure. Cela indique que le MIRS peut obtenir une résection sûre.

Le tissu réséqué à l’aide du MIRS a une viabilité in vitro et in vivo élevée
Les cellules extraites du tissu réséqué ont été filtrées, quantifiées et remises en suspension dans le milieu approprié (Figure 6) avant de mener des expériences de viabilité in vitro ou in vivo . Pour examiner la viabilité in vitro des cellules et confirmer la résection de la tumeur et non du parenchyme cérébral normal, les cellules ont été cultivées en culture de suspension. La formation de neurosphères, un indicateur du potentiel d’initiation tumorale, s’est produite avec un traitement tissulaire minimal après la résection. Cela suggère que la plateforme MIRS a récolté des tissus bien dissociés et a eu un impact minimal sur la santé et la viabilité du tissu réséqué. Les échantillons prélevés directement du TPS à la microscopie optique semblaient être principalement sous la forme de cellules individuelles avec la présence de quelques petits morceaux de tissu. La viabilité au jour 0 variait de 30 % à 70 % (cela représente la viabilité après passage de l’échantillon dans un filtre de 70 μm et avant le placage). Le dispositif de résection a une ouverture de coupe qui peut tourner à 360° sur l’axe de la sonde de résection, permettant la résection des volumes de tissu concentrique. En moyenne, 2 à 3 millions de cellules peuvent être récoltées avec un tour de 360° de l’ouverture de coupe, environ 7 millions de cellules avec deux tours, et un total de 12-14 millions de cellules peut être obtenu avec trois tours de 360° de l’ouverture de coupe. Après placage dans des flacons en suspension contenant un milieu de cellules souches complet sans sérum, les neurosphères étaient visibles par microscopie optique le jour 2 et à l’œil nu au jour 7 (Figure 7).

Pour examiner la viabilité in vivo , les cellules extraites ont été implantées par voie intracrânienne chez des souris naïves C57BL/6 (n = 8 souris, 100 000 cellules vivantes/souris). La croissance tumorale a été confirmée à l’aide du système d’imagerie in vivo . Le signal tumoral a continué d’augmenter jusqu’à ce que tous les animaux soient euthanasiés au jour 14 après l’implantation tumorale (survie médiane de 11 jours).

La section représentative du tissu H & E (Figure 3B) contient une cavité de résection circulaire claire avec un bord de produits sanguins (rose foncé), d’inflammation et de cellules tumorales résiduelles (cellules violet foncé). Macroscopiquement, les cellules tumorales résiduelles sont de nature mésenchymateuse et infiltrantes, présentant une invasion et une prolifération périvasculaires étendues. Au microscope, des atypies nucléaires marquées et des figures mitotiques ont été identifiées. Des macrophages associés à des tumeurs ont également été identifiés autour des zones de tissu infarctus et de microhémorragies. L’architecture tissulaire du parenchyme cérébral environnant ne semblait pas perturbée.

Figure 1 : Configuration du système MIRS. (A) Système de résection mini-invasive (MIRS) pour les tumeurs cérébrales dans des modèles de rongeurs avec un système intégré de préservation des tissus. (B) Panneau avant de la console MIRS. 1 = puissance du système, 2 = pédale, 3 = bouton principal, 4 = aspiration, 5 = cadran de contrôle du niveau d’aspiration, 6 = indicateur de niveau d’aspiration, 7 = pièce à main, 8 = bouton d’activation de la découpe. (C) Panneau arrière de la console MIRS. 1 = prise de cordon d’alimentation, 2 = disjoncteur, 3 = entrée d’alimentation en azote. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Changements dans la charge tumorale moyenne chez les souris atteintes de tumeurs non traitées par rapport aux souris subissant une résection de tumeurs par MIRS. (A) Souris avec une faible charge tumorale de base et (B) souris avec une charge tumorale de base importante (p < 0,0001, ET ≤0,3e + 006 dans tous les groupes à chaque point temporel et trop petite pour être affichée sur le graphique). Les animaux ont succombé à la charge tumorale ou ont été euthanasiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : IRM et analyse H&E. (A) des images IRM cérébrales pondérées en T2 avant et après la résection et (B) une coupe cérébrale coronale colorée H & E représentative montrant une cavité de résection circulaire claire avec un bord de produits sanguins (rose foncé), d’inflammation et de cellules tumorales résiduelles (cellules violet foncé). Les images IRM et les coupes H & E ont été obtenues immédiatement après la résection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Détermination du volume de résection tumorale. Les volumes moyens calculés à partir d’images IRM des cavités de résection créées avec un vs. deux rotations de l’ouverture de coupe, n = 4 par groupe. p = 0,01, test T bilatéral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Courbes de Kaplan-Meier de souris atteintes de tumeurs non traitées versus souris subissant une résection de tumeurs par MIRS. (A) Souris avec une faible charge tumorale de base. (B) Souris avec une charge tumorale de base importante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Test de viabilité des cellules tumorales réséquées. (A) Images représentatives en microscopie optique de tissus prélevés avec MIRS le jour 0 à 20x. (B) Courbe de Kaplan-Meier décrivant la survie de souris après implantation intracrânienne de cellules prélevées sur des tissus réséqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Formation des neurosphères. Images représentatives de microscopie optique de neurosphères générées à partir de tissus réséqués le jour 2 post-résection à (A) 20x et (B) 10x, et le jour 7 après la résection à (C) 20x et (D) 10x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison entre le système de résection mini-invasive (MIRS) et les modèles historiques de résection chirurgicale.

BT bénéficie d’un financement de recherche des NIH et est copropriétaire d’Accelerating Combination Therapies*, et Ashvattha Therapeutics Inc. a concédé sous licence l’un de ses brevets. GW bénéficie d’un financement des NIH (R01NS107813). HB est consultant rémunéré pour Insightec et président du conseil consultatif médical de la société. Cet arrangement a été examiné et approuvé par l’Université Johns Hopkins à la suite de ses politiques sur les conflits d’intérêts. HB bénéficie de fonds de recherche des NIH, de l’Université Johns Hopkins et de philanthropie et est consultant pour CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* et Nurami Medical *. (*Comprend les actions ou les options).