Summary
ここでは、心筋梗塞後(MI)マウスの心臓から十分な量の生存率の高い単一の非心筋細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。これは、その後のシングルセルシーケンシング、フローサイトメトリー解析、および初代細胞培養に使用できます。
Abstract
心筋梗塞(MI)は最も一般的な心血管疾患の1つであり、世界中で死亡率が増加しています。非心筋細胞は全心筋細胞集団の半分以上を占め、炎症反応、組織修復、瘢痕形成など、心筋損傷時の適応補償に寄与しています。MI後の心臓微小環境を研究するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、さまざまな心臓細胞タイプと細胞間コミュニケーションを同定するために広く使用されています。scRNA-seqサンプル調製の手順の中で、細胞生存率はscRNA-seq結果の品質に影響を与える可能性があるため、細胞懸濁液の調製は最も重要なステップの1つです。したがって、MI後のマウス心臓から非心筋細胞懸濁液を調製するための実験プロトコルを設計し、穏やかな消化酵素の選択、消化時間の制御、および蛍光活性化セルソーティング(FACS)の適用による細胞の生存率の向上に特に重点を置いています。最後に、このプロトコルで得られた非心筋細胞懸濁液からCD45+ 細胞を単離し、scRNA-seqを実行しました。
Introduction
心筋梗塞(MI)は最も一般的な心血管疾患の1つであり、その死亡率は世界中で増加しています1。MIは周囲の心筋への不十分な血液供給によって引き起こされ、これはアテローム硬化性プラーク破裂で起こる冠状動脈閉塞の結果である可能性があります。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は急性MI患者の死亡率を低下させましたが、MI後の心不全の高い有病率は依然として問題です2。MI後の心不全の根底にある重要な病態生理学は、心臓損傷に対する体の代償反応であり、これには、死んだ心筋を非収縮性線維性瘢痕に置き換えることが含まれます。これらの適応応答は、複数の細胞型と心臓組織細胞との間の相互作用によって媒介される局所炎症に大きく依存しており、この炎症は現在、線維性瘢痕形成を減少させ、したがってMI後の心不全から保護するための潜在的な治療標的と見なされています3,4。興味深いことに、梗塞部位の微小環境は、浸潤細胞の種類とMI 1,5のさまざまな段階で機能に時間依存的な遷移を経験します。多くの研究は、非心筋細胞(例えば、免疫細胞、線維芽細胞、および内皮細胞)が、MI後の炎症および組織修復において中心的な役割を果たすことを示している5,6。近年、シングルセルシーケンシングは、MI後の微小環境における非心筋細胞の関与と機能を解明するための強力なツールとして広く使用されています7,8。これは、MI後の損傷と修復の病態生理学、およびMI後の心不全に対する潜在的な治療法の開発への洞察を提供します。
ハイスループットRNAシーケンシング(RNA-Seq)は、次世代シーケンシング(NGS)7,8,9を使用してトランスクリプトーム全体を詳細に研究するために使用される技術です。最近、scRNA-Seqの開発は生物医学研究分野に革命をもたらしました。従来のバルクシーケンシングと比較して、scRNA-Seqは単一細胞レベルで遺伝子発現プロファイルと転写不均一性を分析します7,8。この技術は、MI後の微小環境における異なる循環細胞タイプを特定し、心筋細胞と非心筋細胞との間の相互作用を明らかにすることにより、MI 9,10の細胞病態生理学の研究を著しく促進する。これらの知見は、MI後心不全の新たな治療標的の解明にも貢献する。一般に、scRNA-seqベースのポストMI実験には、3つの主要なセクションが含まれます:(1)ポストMI動物モデルの確立;(2)細胞懸濁液の調製;(3)サンプルシーケンシングとデータ分析。注目すべきことに、細胞懸濁液の品質が結果の精度を決定するため、細胞懸濁液の調製はscRNA-Seq実験の調製において最も重要なステップです。
このプロトコルは、MI後の心臓組織から非心筋細胞懸濁液を抽出するように設計されています。重要なことに、細胞の生存率と分解能を維持するための特定の詳細が含まれています。一方、マウス用の外科キット、げっ歯類人工呼吸器、遠心分離機など、このプロトコルで使用される機器は、ほとんどの動物実験センターや生物医学研究所で見つけることができるため、このプロトコルの実験コストは比較的低くなっています。さらに、梗塞の時点と部位を変数として考慮する場合、このプロトコルは、特にMI後の合併症について、幅広い臨床シナリオをシミュレートするために適用できます。
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Protocol
すべての実験は、浙江大学の実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施され、浙江大学の動物諮問委員会によって承認されました。
1. 左前下行冠動脈結紮術(LAD結紮術)手術
注:8週齢の雄C57BL / 6Jマウスをモデルとして使用しました。心臓はMIの2週間後に採取された。 左前下行冠動脈結紮手術は前述のように実施し、実証した11。
- 手術前に手術器具を70%エタノールで消毒してください。
- マウスの体重を測定し、1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.つま先のつまみ反射を観察し、呼吸数を測定して、手順中の麻酔の深さを評価します。
- 37°Cの加熱パッドを備えた手術台にマウスを置きます。眼の脱水を防ぐために眼科用軟膏を使用してください。
- 左前胸部と首を脱毛クリームで脱毛し、綿棒を使用して毛を取り除きます。ヨードフォアで皮膚を消毒し、続いて70%アルコールで消毒してその領域を3回洗浄します。
- 顕微鏡下で正中線頸部切開(0.8〜1.0 cm)を行います。気管周囲の皮膚、筋肉、組織を分離し、20Gのカニューレを気管に挿入します。
注意: 顕微鏡下でカニューレを気管に挿入しながら観察し、チューブが食道に挿入されていないことを確認してください。 - マウスを、毎分150ストロークで0.2mLの一回換気量に設定されたげっ歯類人工呼吸器に接続します。
- マウスの胸部を鎖骨中央線に沿って斜めに滅菌ハサミで切開します。皮下組織を解剖して肋骨を露出させます。
- 滅菌ハサミを使用して、左鎖骨中央線(0.8〜1.0 cm)に沿って皮膚を斜めに切断します。左開胸術を行い、3番目と4番目の肋骨を分離して心臓を露出させます。リブリトラクターを使用すると、はっきりと見えるようになります。
- 湾曲した鉗子で心膜を開き、7-0絹縫合糸を使用して左前下行動脈(左心房付属器の下)を結紮します。左心室の淡い前壁は、心筋灌流が正常に中断されたことを示します。
- 肋骨リトラクターを解放し、胸部から空気を排出しながら、5-0シルク縫合糸で胸部切開部を層状に縫います。5-0縫合シルク縫合糸で首の切開を縫います。
- 自発呼吸が回復したら、マウスから気管チューブを取り外します。予め温めた滅菌生理食塩水0.5mLを腹腔内注射する。痛みを最小限に抑えるために、12時間ごとにブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を皮下注射します。.
- 最後に、マウスを加熱パッドに置いて蘇生を待ちます。マウスを監視して、目視 による 過度の呼吸困難や出血に悩まされていないことを確認します。
- ウェイクアップ後、マウスをケージに戻します。最初の1週間は、マウスを毎日監視して、マウスの可動性、身だしなみ、食生活が適切であることを確認します。実験のニーズに応じて、MI後のさまざまな時点で心臓を収穫します。
注:このプロトコルでは、単一細胞懸濁液はMIの2週間後に心臓で調製されました。
2.心臓単細胞懸濁液の調製
- 溶液と培地の調製
- 心臓組織解離バッファー:10 mgのコラゲナーゼIV(600 U / mL)、5 mgのディスパーゼII(0.5 U / mL)、および50 μLのDNase I(100 μg / mL)を5 mLのRPMI 1640に混合します。使用前に、この培地を水浴で37°Cに予熱してください。
- 細胞洗浄バッファー:リン酸緩衝生理食塩水(PBS、PH 7.4)で1%BSAまたは10%FBSを調製し、4°Cまたは氷上に保ちます。
- 灌流溶液:灌流溶液としてPBS(PH 7.4)を予冷します。
- 赤血球(RBC)溶解バッファー:製造元が述べているように、RBC溶解バッファーを使用してください。
注:この研究で使用される試薬と機器のリストについては、 材料表 を参照してください。
- 腹腔内ペントバルビタールナトリウム(150 mg / kg)注射でマウスを安楽死させます。.
- 心臓解剖
- マウスの後肢を粘着テープで所定の位置に固定して、マウスを仰臥位に置きます。
- 体に70%エタノールをスプレーし、肝臓を刺さないようにしながら腹部の皮膚と筋肉を垂直に切ります。心臓に穴を開けないようにしながら、胸部を慎重に開きます。
- 予冷したPBS(PH 7.4)を使用して、無色の灌流液が観察されるまで左心室に灌流します(約15 mLのPBS [pH 7.4]が必要です)。
- 鉗子で心臓を胸部からそっと持ち上げ、心臓の外側に付着した余分な組織を眼用ハサミで切り取ります。心臓を1.5 mLの微量遠心チューブ内の1 mLの予冷PBS(PH 7.4)に入れます。
- 心臓組織の酵素解離
- マウスの心臓を150 μLの心臓組織解離バッファーを氷上に置いた24ウェルプレートの1ウェルに移し、はさみで小片(~1 mm)に切断します。
- ミンチした心臓組織を、5 mLの組織解離バッファーを入れた15 mLの遠沈管に移します。
注:推奨される心臓組織解離バッファー容量は5mL /心臓です。 - 遠沈管を電気恒温槽レシプロシェーカーに125rpmで37°Cで1時間入れます。 組織懸濁液を20分ごとに10回上下にピペットします。
- 細胞懸濁液を70 μmのセルストレーナーでろ過し、未消化の組織や塊を取り除きます。25 mLの細胞洗浄バッファーを加えて元のチューブをすすぎ、次にそれを移して細胞ストレーナーをすすぎます。次に、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーでろ過し、細胞凝集塊をさらに除去します。
- ろ過した細胞懸濁液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、細胞サンプルを1x RBC溶解バッファーに室温(RT)で5分間再懸濁します。
- 4倍容量の細胞洗浄バッファーを加え、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を10 mLの細胞洗浄バッファーに再懸濁します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を1 mLの細胞洗浄バッファーに再懸濁します。
- 18 μLの細胞懸濁液を2 μLのアクリジンオレンジ(AO)/ヨウ化プロピジウム(PI)染色溶液(9:1)と混合し、10 μLの混合物を計数チャンバースライドに加えます。自動セルカウンターを使用して細胞数と生存率を評価します。
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Representative Results
このプロトコルのセクション2を実施することにより、活力の高い単一細胞懸濁液が得られました。しかし、細胞断片はまだ観察できました(図1A)。したがって、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を実施して、品質をさらに改善しました16。FACS後、平均細胞サイズは9.6 μmから9.1 μmに減少し (表1)、これはFACSによって細胞懸濁液中の細胞断片の割合を効果的に減少させることができることを示唆しています (図1B)。FACSに使用されるゲーティング戦略を 図1Cに示します。
図1の画像に加えて、細胞濃度、平均細胞サイズ、および細胞生存率をセルカウンターで測定しました(表1)。細胞濃度の違いは、細胞懸濁液の量によるものであった。注目すべきことに、平均細胞サイズはFACS後に減少し(表1)、これはFACSが効果的に細胞凝集を減らし、細胞断片を除去できることを示しています。
ScRNA-seqは、このプロトコルを通じて得られた細胞懸濁液の品質を検証しながら、心臓免疫学的微小環境を研究するために実施されました。シングルセル懸濁液を調製した後、まず、広範囲の免疫細胞に共通するマーカーである表面タンパク質CD45を発現する細胞を選別しました。次に、10X Genomicsプラットフォーム17を用いてCD45+細胞に対してscRNA-seqを実施した。このようにして、3つの健康な心臓サンプルからの14,217個の個々の細胞を、品質管理後にマージされたデータセットにプールしました(表2)。教師なしクラスタリングとt分布確率的隣接埋め込み(t-SNE)次元の減少は、7種類の免疫細胞の明らかな分離を示しました(図2)。さらに、各免疫細胞型は、古典的なマーカーの高い発現を示した。結論として、これらの結果は、このプロトコルによって調製されたシングルセル懸濁液がシングルセルシーケンシングに対して高い効力を有することを示している。
図1:心臓単一細胞懸濁液における細胞生存率。 (A)FACSなしの細胞生存率。黒い矢印は細胞断片(蛍光なし)を示す。(B)FACSによる細胞生存率。黄色の矢印は生細胞(緑色の蛍光)を示し、赤色の矢印は死んだ細胞(赤色の蛍光)を示します。(C)ゲーティング戦略。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3つのマウス心臓サンプルからの心臓CD45+ 細胞のシングルセルRNAシーケンシング。 (a)CD45+ 細胞のtSNEプロット、標準マーカー遺伝子に基づいて同定された免疫細胞集団を示す。(B)各亜集団における発現差のある上位5つの遺伝子のヒートマップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| FACS導入前 | FACS後 | |
| 総細胞濃度(細胞/mL) | 1.51×106 | 3.40×105 |
| 生細胞濃度(細胞/mL) | 1.40×106 | 3.15×105 |
| 死細胞濃度(細胞/mL) | 1.09×105 | 2.48×104 |
| 生存率(%) | 92.8 | 92.7 |
| 平均セルサイズ(μm) | 9.6 | 9.1 |
表1:FACS前後の心臓単一細胞懸濁液。 FACSの前後で得られた心臓単一細胞懸濁液の細胞密度を、自動セルカウンターを用いて比較する。
| 見積もり | |
| 推定セル数 | 14,217 |
| セルあたりの平均読み取り数 | 81,017 |
| 細胞あたりの遺伝子の中央値 | 1,374 |
| 検出された遺伝子の総数 | 18,424 |
| セルあたりの UMI カウントの中央値 | 4,021 |
| 有効なバーコード | 98.4% |
| ゲノムにマッピングされたリード | 95.1% |
表2:品質管理統計。 この表は、健康なマウス心臓の単一細胞データのさまざまな推定値をリストしています。
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Discussion
この記事は、MI後のマウス心臓から単一の非心筋細胞を分離するためのプロトコルを説明することを目的としています。このプロトコルは、免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞など、MI後の微小環境におけるさまざまな種類の細胞を高品質で分離するために適用できます。シングルセルシーケンシング用の高品質の細胞懸濁液を得るためには、3つの重要な要素が重要です。1つ目は酵素消化の設定です。消化時間と消化酵素の量と濃度を制御して、細胞の生存率と単離効率の両方を保証することが重要です。この場合、酵素の濃度を適宜高め、消化時間を延長しました。ここでは、45分から1時間の消化時間をお勧めします。持続時間が短いと、細胞の生存率は高まる可能性がありますが、心臓組織の消化が不十分になり、細胞凝集塊の量が増える可能性があります。さらに、溶解細胞は遊離DNAを放出して周囲の細胞を包み込み、細胞凝集塊を形成することができるため、DNase Iを使用して細胞凝集を防止しました13。2番目の重要な要素は、BSAまたはFBSを含む細胞洗浄液を使用することです。BSAまたはFBSは、酵素の活性を保護するだけでなく、細胞の生存率を向上させることもできます。最後の必須因子は、細胞断片と死細胞を排除するためのFACSを促進することです。細胞断片は、不正確な細胞数と生存率をもたらす可能性があります。これらの要因が相まって、細胞懸濁液の生存率と純度が向上し、シングルセルシーケンシングとの互換性が高まります。
このプロトコルは、最初に、シングルセルシーケンシングのための細胞懸濁液調製について説明し、比較的低コストで細胞懸濁液の品質を高めるための追加の手順も含みます。以前の研究で使用された他のプロトコルと比較して、トリプシン14などの遊離DNAによって誘導される細胞の凝集を引き起こす可能性のある消化酵素の使用を避けています。細胞破片の除去は、単一細胞研究の主要な課題の1つであり、一部の研究では、サンプルを実行する前に死細胞除去キットを使用して細胞生存率を改善しています14,15。ただし、ここでは、死んだ細胞や破片を減らすのに高い効果があるため、FACSを使用してサンプルの純度を高めることをお勧めします。
このプロトコルによって得られた単一細胞懸濁液は、フロー分析または初代細胞培養(標準的な無菌手順)によってさらに分析することができます18。消化酵素は比較的マイルドであるため、MIのさまざまな段階で採取された心臓組織や健康な心臓の組織を消化するのに適しています。ただし、このプロトコルには特定の制限があります。例えば、37°Cでの長時間の消化は、必然的にストレス遺伝子19,20の発現を促進する。この制限は、低温活性プロテアーゼを使用するか、FACSに続く消化時間を短縮することで解決できます。また、このプロトコルには心筋細胞の単離が含まれていないため、局所組織応答の研究には適していません。
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Disclosures
著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、浙江省自然科学基金(LQ22H020010)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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