Denne protokollen beskriver en intervensjonsradiologisk prosedyre etablert for intratymisk injeksjon hos mus for å unngå risikoen for åpen kirurgi og forbedre nøyaktigheten av blinde perkutane injeksjoner.
Intratymisk injeksjon i musemodeller er en viktig teknikk for å studere tymisk og immunfunksjon, inkludert genetiske og ervervede T-celleforstyrrelser. Dette krever metoder for direkte avsetning av reagenser og/eller celler i thymus hos levende mus. Tradisjonelle metoder for intratymisk injeksjon inkluderer thoraxkirurgi eller minimalt invasive perkutane blinde injeksjoner, som begge har betydelige begrensninger. Ultrahøyfrekvente ultralydavbildningsenheter har gjort bildestyrte perkutane injeksjoner mulig hos mus, noe som forbedrer injeksjonsnøyaktigheten til perkutan injeksjonsmetode og muliggjør injeksjon av mindre mål. Bildestyrte injeksjoner er imidlertid avhengige av bruk av et integrert skinnesystem, noe som gjør dette til en stiv og tidkrevende prosedyre. En unik, sikker og effektiv metode for perkutan intratymisk injeksjon hos mus er presentert her, og eliminerer avhengigheten av skinnesystemet for injeksjoner. Teknikken er avhengig av å bruke en høyoppløselig mikro-ultralydsenhet for å avbilde musen thymus ikke-invasivt. Ved hjelp av en frihåndsteknikk kan en radiolog plassere en nålespiss direkte inn i musmusen under sonografisk veiledning. Mus rengjøres og bedøves før avbildning. For en erfaren radiolog som er flink til ultralydveiledede prosedyrer, er læringsperioden for den oppgitte teknikken ganske kort, vanligvis innen en økt. Metoden har lav sykelighet og dødelighet for musene og er mye raskere enn dagens mekanisk assisterte teknikker for perkutan injeksjon. Det gjør det mulig for etterforskeren å effektivt utføre presise og pålitelige perkutane injeksjoner av thymuser av hvilken som helst størrelse (inkludert svært små organer som thymus av eldre eller immundefekte mus) med minimal stress på dyret. Denne metoden muliggjør injeksjon av individuelle lober om ønskelig og letter store eksperimenter på grunn av prosedyrens tidsbesparende natur.
Thymus har en viktig rolle i T-celleutvikling og immunitet. T-cellemangel, som blant annet kan skyldes tymisk involusjon, genetiske lidelser, infeksjoner og kreftbehandlinger, fører til høy dødelighet og sykelighet 1,2. Musemodeller er uunnværlige i både grunnleggende og translasjonell immunologiforskning og har blitt brukt i flere tiår for å studere tymisk biologi og T-celleutvikling, samt å utvikle behandlinger for de som lider av tymisk dysfunksjon og T-cellemangel 3,4,5.
En sentral del av tymiske undersøkelser har vært intratymisk injeksjon av biologisk materiale som celler, gener eller proteiner i musemodellene 6,7,8,9,10,11,12. Konvensjonelle intratymiske injeksjonsmetoder bruker torakotomi etterfulgt av intratymisk injeksjon under direkte visualisering eller ved “blind” perkutan injeksjon i mediastinum. Den kirurgiske tilnærmingen øker blant annet pneumothorax-risikoen betydelig. Videre resulterer det forhøyede stresset under denne operasjonen i immunsuppresjon, og dermed potensielt kompromitterer immunologiske data13. Erfarne forskere, etter litt praksis, kan utføre blind injeksjonsteknikk, men denne tilnærmingen er mindre nøyaktig og begrenser derfor eksperimentelle til unge mus med stor tymus.
Bruken av ultralydveiledning er introdusert som et presist og minimalt invasivt alternativ til tradisjonelle intratymiske injeksjonsmetoder14. Denne prosedyren er imidlertid svært tidkrevende når du bruker det integrerte skinnesystemet i stedet for frihåndsteknikken. Å utføre injeksjoner med injeksjonsfestet krever nøye bildeoptimalisering og posisjonering av transduseren ved hjelp av de forskjellige vedleggene som transduserstativet og -monteringen, X-, Y- og Z-posisjoneringssystemet, samt dyktig drift av mikromanipuleringskontrollene og skinnesystemutvidelsene. En enkel alternativ teknikk, ultralydstyrt tymisk injeksjon, presenteres her av en radiolog ved hjelp av en frihånds tilnærming15, som både er et raskt og nøyaktig minimalt invasivt alternativ til de ovenfor beskrevne metodene. Det er viktig at den nåværende tilnærmingen kan utføres med et hvilket som helst høyoppløselig ultralydbildesystem uten å trenge et injeksjonsfeste og integrert skinnesystem. Det er spesielt nyttig for studier som krever injeksjon av et stort antall mus11, for eksperimenter som involverer injeksjon av begge tymiske lober, eller for nøyaktig injeksjon av små thymuser i alderen, bestrålt eller immunkompromitterte mus12.
En ultralydstyrt frihåndsinjeksjon er en svært nøyaktig teknikk for å levere studiemateriell til thymus på en effektiv og aseptisk måte. Etter den første steriliseringen av huden på injeksjonsstedet, opprettholdes steriliteten under prosedyren på grunn av bruk av sterile hansker, sterile ultralydsondedeksler og steril ultralydgel. I motsetning til den blinde perkutane tilnærmingen 10,17 eller stole på kirurgiske snitt for direkte visualisering av thymus18,19, som er de mest brukte metod…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Raymond H. Thornton for hans innsiktsfulle og omfattende tidlige arbeid med denne teknikken. Denne studien ble finansiert av tilskuddsstøtte fra National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children’s Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine og HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |