Microdissection de l’œil de rongeur

La dissection oculaire est une technique importante dans la recherche ophtalmique et a permis aux chercheurs d’accéder aux segments de l’œil pour des études ciblées. Auparavant, les chercheurs oculaires s’appuyaient sur le tissu oculaire d’individus malades pour leurs études. Cependant, le nombre croissant de souches de modèles ophtalmiques de rongeurs¹ au fil des ans a diminué le besoin de tissu oculaire humain. Ces souches de souris ont permis une meilleure compréhension des maladies oculaires et des interventions. Pourtant, ils ont également généré un besoin de techniques innovantes de micro-dissection oculaire. La petite taille et la zone d’exploitation limitée limitent considérablement l’accès effectif aux sous-parties oculaires. De plus, en raison de l’assemblage cellulaire homogène des oculaires postérieur et antérieur, il est difficile de mener des interventions ciblées après la dissection. Les techniques actuelles de microdissection du laser² et de la microdissection chirurgicale ^3,4 sont insuffisantes pour répondre à ces exigences de la recherche oculaire. La micro-dissection au laser est très efficace dans l’analyse unicellulaire, mais le tissu spécifique doit être micro-disséqué avant la procédure au laser². La technique permet d’isoler de petites régions d’intérêt à partir d’un tissu pré-disséqué pour une analyse moléculaire. Ainsi, la technique n’est pas adaptée à la préparation de montages entiers ou à l’isolement de couches oculaires emballées axialement pour une visualisation optimale.

La méthode chirurgicale est la technique la plus utilisée; Cette méthode consiste à immobiliser l’œil via le nerf optique⁵ puis à effectuer la dissection. Cette pratique est ardue et peut endommager tout tissu fragile, car l’œil sphérique continue de bouger pendant la dissection. Bien qu’elle soit bénéfique pour isoler les différentes sections des couches rétiniennes, la technique ne peut pas délimiter l’orientation spatiale du tissu lors de la dissection.

Lors de la dissection, le maintien de la présence de la membrane nictitante attachée ou de la troisième paupière (Figure 1) présente des avantages uniques et significatifs. Dans cette méthode, d’abord, le globe oculaire est énucléé avec la troisième paupière. Ensuite, la troisième paupière sert à immobiliser l’œil⁶ (Figure 2A). Ceci est suivi en perçant le globe oculaire à travers le limbe cornéen et en utilisant l’incision comme point d’entrée (Figure 2B, C). Ensuite, les œillets sont séparés en coupant le long de la circonférence antérieurement et postérieurement (Figure 2D-G). En disséquant davantage l’œilleton postérieur, la couche translucide de la rétine neurale peut être identifiée et délicatement décollée. Trois ou quatre coupes équidistantes sont ensuite réalisées dans les coupes hémisphériques antérieures et postérieures obtenues, ce qui permet à ces coupes en forme de fleurs de tomber à plat sur une lame (Figure 2H).

La troisième paupière facilite la manipulation facile et efficace pendant la dissection, assurant ainsi des dommages minimes au tissu lors de l’accès aux différentes couches oculaires et lors de la production de montures entières. De plus, la présence de la troisième paupière aide à localiser et à examiner les interventions localisées pendant la visualisation.

La procédure, dans notre laboratoire, a été effectuée sur une souche de souris CBA / J ou rd1 à P28 de n’importe quel sexe. La procédure peut être effectuée sur n’importe quelle souche, âge ou sexe de l’animal et n’a aucun biais en fonction de ces caractéristiques.

Les animaux ont été achetés auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et conservés à l’installation pour petits animaux (SAF) de l’Institut national d’immunologie (NII). Ils ont été gardés dans des cages ventilées individuelles (IVC) et ont reçu un accès ad libitum à de l’eau autoclavée acidifiée et à de la nourriture. Ils ont été maintenus à 21-23 °C et avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h.

Vous trouverez ci-dessous une méthode chirurgicale modifiée pour la micro-dissection d’un œil de souris.

Cette procédure a été approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut national d’immunologie de New Delhi. Le numéro de référence de série de l’homologation est IAEC#480/18. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives réglementaires du Comité pour le contrôle et la supervision des expériences sur les animaux, Ministère de la pêche, de l’élevage et de la production laitière, Gouvernement indien, sous la supervision d’un vétérinaire professionnel de la SAF, NII.

1. Préparation

1. Dilatez les yeux des rongeurs en utilisant une goutte de solutions ophtalmiques de tropicamide à 0,8% et de phényléphrine à 5% dans chaque œil. Placez l’animal dans un endroit sombre pendant 30 minutes avant la procédure.
   REMARQUE : Un analgésique n’est pas nécessaire puisque l’animal est euthanasié immédiatement après avoir terminé les 30 minutes. L’adaptation à l’obscurité et la dilatation des yeux de l’animal permettent à l’observateur de vérifier les déchirures oculaires et les dommages avant la procédure. De plus, la dilatation est avantageuse lorsque vous travaillez avec le tissu pigmenté du globe oculaire.
2. Euthanasier l’animal en administrant par voie intrapéritonéale une dose 5x d’anesthésie. Une dose typique est de 200 μL de PBS contenant 10 mg de kétamine et 1 mg de xylazine.
   REMARQUE : La dose pour l’euthanasie de l’animal est de la kétamine à raison de 400 à 500 mg/kg de poids corporel et de la xylazine à 50 mg/kg de poids corporel administrée par voie intrapéritonéale. Pour une souris typique pesant 20 g, la dose serait de 200 μL de PBS contenant 10 mg de kétamine (100 μL d’une solution mère de 100 mg/mL de kétamine) et 1 mg de xylazine (100 μL d’une solution mère de 10 mg/mL de xylazine).
3. Confirmez l’absence totale de réponse à un stimulus en examinant le réflexe de pédale. L’absence de battements de cœur et de respiration sont également des indicateurs importants.
4. Placez la souris en position couchée latérale pour permettre un accès complet à l’œil.
5. Préparez des pinces de suture Colibri, des pinces incurvées, une micro-lame (15°, 3 mm), des micro-ciseaux à ressort et des micro-ciseaux à ressort inclinés prêts pour la procédure.

2. Énucléation de l’œil de souris avec la troisième paupière

1. Placez la souris en position couchée latérale pour permettre un accès complet à l’œil. Ouvrez les paupières externes avec la pince pour visualiser de manière optimale la troisième paupière.
   REMARQUE : La troisième paupière, aussi appelée membrane nictitante, est située vers le coin supérieur de la tangente nasale (figure 1A).
2. Identifier la troisième paupière comme une protubérance translucide mineure avec une limite pigmentée (Figure 1B).
3. Placez des pinces incurvées autour du globe oculaire et pincez pour libérer l’œil des attaches étrangères. Cela minimisera les saignements dans l’œil à partir des tissus environnants.
4. Remplacez les pinces incurvées par des micro-ciseaux à ressort et coupez autour du globe oculaire avec la troisième paupière qui y est attachée. Utilisez de petites coupures continues pour libérer le globe oculaire des attaches tissulaires environnantes.
5. Placez des micro-ciseaux à ressort incurvés sous le globe oculaire pour libérer l’œil en coupant le nerf optique. Assurez-vous que le globe oculaire est complètement libéré de l’orbite.

3. Élimination du tissu étranger

1. Placer l’œil énucléé de la souris euthanasiée dans une boîte de Petri avec un tampon de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4, avec la boîte de Petri remplie de manière à ce que le globe oculaire soit immergé dans le PBS.
2. Immobiliser le globe oculaire énucléé de la souris avec la troisième paupière attachée d’une main à l’aide d’une pince.
3. Suspendre le globe oculaire dans un milieu liquide pour permettre une manipulation plus efficace. Certains muscles ou tissus extraoculaires commenceront à flotter loin du globe oculaire. Retirez-les en les coupant du globe oculaire à l’aide de micro-ciseaux à ressort.
4. Coupez et retirez le nerf optique de la base du globe oculaire à l’aide de micro-ciseaux pour permettre une meilleure séparation de la rétine pour les préparations de montage entier.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’enlever le nerf optique pour la section des tissus.
5. Lavez le globe oculaire avec du PBS et transférez-le dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant au moins 2 h à 4 °C pour la fixation des tissus.
   REMARQUE: La procédure peut être interrompue à cette étape en laissant le tissu dans le PFA jusqu’à 12 heures à 4 ° C. Cependant, pour l’isolement des cellules vivantes, les étapes de fixation ne doivent pas être effectuées et toute la procédure doit être effectuée sans pause.

4. Dissection de l’œil énucléé pour obtenir les œillets antérieur et postérieur

1. Après la fixation de PFA (si vous collectez des cellules vivantes, procédez sans la fixation du globe oculaire), transférez le globe oculaire dans une boîte de Petri contenant du PBS et placez-le sous un microscope à dissection pour effectuer la procédure suivante.
2. Immobiliser le globe oculaire en maintenant fermement la troisième paupière enfoncée avec la pince à suture Colibri.
3. Faites une petite incision au niveau du limbe en le perçant à l’aide d’une micro-lame. Le limbe est la jonction cornéenne-sclérale. Faites l’incision de préférence opposée à la troisième paupière, faisant ainsi un point d’accès pour les micro-ciseaux à ressort.
   REMARQUE: L’utilisation d’une microlame de 15° et 3 mm peut permettre un meilleur contrôle de la profondeur de cette incision.
4. Ensuite, en utilisant cette incision comme point de départ, avec une paire de micro-ciseaux, faites de petites coupes continues le long de la circonférence du limbe cornéen-scléral. Tout d’abord, complétez un demi-cercle de coupures à partir du point d’incision jusqu’à la troisième paupière. Ensuite, complétez le demi-cercle de coupes restant de l’autre côté. Enfin, faites une coupe autour de la troisième paupière pour séparer la coupe postérieure et la coupe antérieure.
   REMARQUE: Selon l’œilleton d’intérêt, la membrane nictitante peut être laissée attachée à l’œilleton antérieur ou postérieur.
5. Retirez le cristallin de la coupe postérieure à l’aide d’une pince pour obtenir la coupe postérieure comprenant les couches de la rétine neurale et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Le cristallin, la coupe postérieure et la cupule antérieure de l’œil sont donc séparés.
   REMARQUE: Si vous travaillez avec des tissus non fixés, les cupules antérieure et postérieure peuvent maintenant être digérées enzymatiquement pour obtenir une suspension unicellulaire cornéenne ou rétinienne.
6. Pour fixer les tissus, transférer ces gobelets dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PFA à 4 % pendant 12 h à 4 °C.
   REMARQUE: Après la fixation, le tissu peut être incorporé dans un milieu approprié, et une cryo-section ou une section de paraffine peut être effectuée pour obtenir des sections cornéennes ou rétiniennes.

5. Isolement de la rétine neurale et des couches d’EPR

1. Réintroduisez la coupe postérieure dans la boîte de Petri contenant un tampon PBS pour submerger le tissu.
2. Vérifiez la présence de la rétine neurale. Cela peut être visualisé comme une couche opaque sur la couche pigmentée RPE, qui est fixée à la circonférence périphérique de la tasse.
3. Tenez la troisième paupière avec une pince pour immobiliser la cupule postérieure et décollez la rétine neurale à partir de la périphérie à l’aide d’une deuxième paire de forceps.
   REMARQUE: Des mouvements très doux et légers de la main sont fortement recommandés afin de ne pas endommager les tissus. À la sortie du nerf optique, les ciseaux à ressort incurvés peuvent être insérés sous la rétine neurale, et une coupe peut être faite pour libérer complètement les couches si la rétine neurale reste attachée comme illustré à la figure 3. En option, libérez ou détachez la rétine avec des mouvements doux à l’aide d’une brosse douce. Cependant, il ne serait pas approprié de le faire si la rétine est collectée pour l’histologie.
   REMARQUE: La rétine neurale et la couche pigmentée d’EPR avec la troisième paupière sont ainsi obtenues.

6. Segmentation des couches rétiniennes et RPE pour les montages entiers

1. Réintroduisez les coupes antérieure et postérieure dans la boîte de Petri contenant le tampon PBS et placez la boîte sous le microscope à dissection.
2. Immobiliser la cupule antérieure en maintenant la troisième paupière enfoncée.
3. Utilisez des micro-ciseaux à ressort inclinés pour faire une coupe d’environ 3/4 du diamètre de l’œilleton à côté de la troisième paupière, en coupant de la périphérie perpendiculairement vers le centre optique.
4. Maintenez une prise sur la troisième paupière et faites une coupe à côté de la première coupe.
5. Faites une coupe similaire entre la deuxième coupe et la troisième paupière.
   NOTE: Trois ou quatre coupes équidistantes ouvrent les coupes hémisphériques en une forme de fleur, qui tombe à plat et peut être facilement montée.
6. Immobiliser la coupe postérieure en maintenant la troisième paupière enfoncée.
7. Suivez les mêmes étapes que celles données pour faire les coupes (étapes 6.3-6.5) sur la coupe antérieure pour faire trois ou quatre coupes équidistantes sur la coupe postérieure.
   REMARQUE: Pour l’histologie de la rétine neurale isolée à l’étape 5, faites des coupes similaires pour vous assurer qu’elle tombe à plat sur une surface. Ne faites pas de coupes très profondes au centre de la tasse, car cela pourrait faire en sorte que les sections de feuilles se désagrègent ou se séparent facilement.
8. Effectuer la coloration et monter les tissus entiers pour une visualisation efficace ^7,8.
   REMARQUE: La présence de la membrane nictitante agit comme un indicateur physique constant de la face nasale de l’œilleton dans les montures entières. Il aide à délimiter le côté dorsal/ventral de l’œilleton, car la troisième paupière de l’œilleton indique l’orientation nasale/ventrale.

Une monture entière d’œil/tissu cornéen de souris rd1 a été préparée pour étudier la lympho-angiogenèse potentielle dans le tissu antérieur/cornéen à l’état malade. Le tissu conjonctival attaché de la troisième paupière a agi comme un contrôle positif, car la cornée manque de vaisseaux lymphatiques. Pour l’étude, le tissu cornéen a été disséqué avec la conjonctive et a été fixé avec 4% PFA, suivi d’une perméabilisation et d’un blocage. Le tissu a ensuite été coloré avec un anticorps primaire contre le marqueur endothélial lymphatique (LYVE1)9. Cela a été suivi par une incubation avec un anticorps secondaire marqué avec Alexa Fluor 488 (vert). Des images représentatives (figure 4) ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence à 4x et 10x.

Une partie entière de la rétine neurale à partir de l’œilleton postérieur a été préparée pour visualiser le système vasculaire rétinien pour des études morphologiques, structurelles et fonctionnelles de la rétine7. La rétine neurale a été soigneusement décollée de la couche choroïde-EPR, et des coupes ont été faites pour la poser à plat dans une structure de fleuron. Pour visualiser la structure vasculaire rétinienne, la notice a été colorée avec l’isolectine IB4-Alexa Fluor 488 pendant 1 h à température ambiante et visualisée à un grossissement de 2x et 20x (Figure 5).

Figure 1 : La troisième paupière ou membrane nictitante de la souris. (A) La troisième paupière est située vers le coin supérieur de la tangente nasale et (B) a souvent une limite pigmentée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Étapes de l’isolement des œillets antérieur et postérieur d’un globe oculaire énucléé. (A) La troisième paupière est utilisée pour immobiliser l’œil, et (B) une incision est faite à travers le limbe cornéen. (C) Une entrée est faite après la formation de l’incision et la coupe le long de la circonférence, comme indiqué en (D-F). (G) Les œilletons antérieur et postérieur sont donc séparés. Une couche translucide de la rétine neurale est présente sur la cupule postérieure, qui est décollée. (H) Trois coupes équidistantes sont ensuite faites dans les cupules pour les faire tomber à plat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Schéma de principe montrant comment des ciseaux à ressort incurvés peuvent être insérés sous la rétine neurale pour libérer les couches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Montage entier de la cupule antérieure. Le tissu cornéen a été microdisséqué comme décrit pour révéler les vaisseaux lymphatiques. Le tissu a été coloré avec le marqueur endothélial lymphatique (LYVE1) et un anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 488 (vert). (A) Images à 4x et (B) à grossissement 10x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: La monture entière de la rétine neurale. L’isolectine IB4 colore le système vasculaire rétinien, qui peut être facilement visualisé en vert. (A) La monture plate rétinienne obtenue à partir de l’œilleton postérieur a été colorée avec de l’isolectine IB4 marquée avec Alexa Fluor 488 (2x). (B) Un grossissement 20x du système vasculaire rétinien montrant le plexus vasculaire intermédiaire dans la rétine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.