Ex Vivo Analyse des transitoires Ca2+ activés mécaniquement dans les cellules urothéliales

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie pour évaluer la fonction des canaux ioniques activés mécaniquement dans les cellules urothéliales natives à l’aide du capteur fluorescent Ca²⁺ GCaMP5G.

Résumé

Les canaux ioniques activés mécaniquement sont des transducteurs biologiques qui convertissent des stimuli mécaniques tels que les forces d’étirement ou de cisaillement en signaux électriques et biochimiques. Chez les mammifères, les canaux activés mécaniquement sont essentiels pour la détection des stimuli externes et internes dans des processus aussi divers que la sensation de toucher, l’ouïe, la régulation du volume des globules rouges, la régulation de la pression artérielle basale et la sensation de plénitude de la vessie. Bien que la fonction des canaux ioniques activés mécaniquement ait été largement étudiée in vitro à l’aide de la technique de patch-clamp, l’évaluation de leur fonction dans leur environnement natif reste une tâche difficile, souvent en raison d’un accès limité aux sites d’expression de ces canaux (par exemple, les terminaisons afférentes, les cellules de Merkel, les barorécepteurs et les tubules rénaux) ou de difficultés à appliquer la technique de patch-clamp (par exemple, les surfaces apicales des cellules parapluies urothéliales). Ce protocole décrit une procédure pour évaluer les transitoires Ca 2+ évoqués mécaniquement à l’aide du capteur fluorescent GCaMP5G dans une préparation urothéliale ex vivo, une technique qui pourrait être facilement adaptée pour l’étude des événements Ca²⁺ évoqués mécaniquement dans d’autres préparations tissulaires natives.

Introduction

Les cellules épithéliales des voies urinaires sont soumises à des forces mécaniques lorsque le filtrat urinaire traverse les néphrons, et l’urine est pompée hors du bassinet du rein et traverse les uretères pour être stockée dans la vessie. Il est reconnu depuis longtemps que les forces mécaniques (p. ex., contrainte de cisaillement et étirement) exercées par les fluides sur les cellules épithéliales qui tapissent les voies urinaires régulent la réabsorption des protéines dans le tubule proximal et des solutés dans le néphron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^<....

Protocole

Les soins et la manipulation des animaux ont été effectués conformément au comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh. Des souris C57Bl/6J femelles âgées de 2 à 4 mois ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues commercialement (voir le tableau des matériaux).

1. Assemblage et configuration de l’équipement

1. Effectuez une imagerie Ca²⁺ avec un microscope droit équipé d’une caméra haute résolution et d’une source lumineuse stable (voir Tableau des matériaux).
   1. Acquérir les images avec un logiciel....

Résultats

Le présent protocole décrit une technique permettant d’évaluer les transitoires Ca 2+ évoqués mécaniquement dans les cellules parapluies à l’aide du capteur fluorescent Ca²⁺ GCaMP5G. La transduction adénovirale a été utilisée pour exprimer GCaMP5G dans les cellules urothéliales en raison de sa grande efficacité et parce qu’elle produit un niveau élevé d’expression. Des images fluorescentes de cryosections colorées provenant d’une vessie transduite sont présentées à la figure 2D<.......

Discussion

Tous les organismes, et apparemment la plupart des types cellulaires, expriment des canaux ioniques qui répondent à des stimuli mécaniques 20,33,34,35,36,37. La fonction de ces canaux activés mécaniquement a été principalement évaluée avec la technique du patch-clamp. Cependant, en raison de problèmes d’accessibilité, les étu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
20x Objectif	Olympus	UMPlanFL N
24 G ¾ ; ” cathéter	Medline  ;	Suresite IV slide  ;
4x Objectif	Olympus	UPlanFL N
Convertisseur analogique/numérique	Molecular Devices	Digidata 1440A
Anticorps anti-GFP	Abcam  ;	Ab6556
Séparateur	de faisceau Chroma	T495lpxr
Régulateur de température bipolaire	Warner Instruments	TC-344B
CaCl2	Fluka	21114-1L	1 M solution
logiciel cellSens Logiciel	Olympus		Imaging
caméra CMOS	Hamamatsu	ORCA fusion
Donkey anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 488  ;	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
Excel	Microsoft Corporation
Filtre  ;	Chrominance  ;	ET470/40X
Capillaires en verre Corning 8250 en verre	Warner Instruments  ;	G85150T-4
Glucose	Sigma	G8270
HEPES  ;	Sigma	H4034
Chauffage en ligne  ;	Warner Instruments	SH-27B
KCl	Sigma	793590
Source lumineuse	Sutter Instruments	Lambda XL  ;
Tube de pompe de collecteur	Fisherbrand	14-190-510	ID 1,52 mm
Tube de pompe de collecteur	Fisherbrand	14-190-533	ID 2,79 mm
MgCl2	Sigma	M9272
Souris  ;	Jackson Lab	664	2-4 mois femelle C57BL/6J
Microforge	Narishige  ;	MF-830
Micromanipulateur	Sutter Instruments	MP-285
Microscope	Olympus	BX51W
Supports de montage avec DAPI	Invitrogen	S36964  ;	Slowfade Diamond Antifade avec DAPI
NaCl  ;	Sigma	S7653
Logiciel pClamp	Molecular Devices	Version 10.4	Patch-clamp Logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie
Pompe péristaltique	Gilson	Minipuls 3
Actionneur piézoélectrique	Thorlabs	PAS005
Porte-pipette	World Precision Instruments
Extracteur de pipette	Narishige	PP-830
Base chauffante à remplacement rapide avec perfusion et kit de bague d’adaptation	Warner Instruments	QE-1	Plate-forme à échange rapide pour parabole de 35 mm  ;   ;
Rhodamine-phalloïdine  ;	Invitrogen	R415
Sigma-Plot	Systat Software Inc	Version 14.0	Logiciel scientifique de graphisme et d’analyse de données  ;   ;
Élastomère de silicone	Dow	Sylgard 184
Contrôleur piézoélectrique monocanal en boucle ouverte	Thorlabs	MDT694B
Coussin porte-grille carrée	Ted Pella	10520
Suture	AD Surgical	S-S618R13	6-0 Sylk
Tige de montage en téflon	Sur		Utilisation pour monter l’actionneur piézoélectrique dans le micromanipulateur
Tube	Fisher Scientific	14171129	Tygon S3 ID 1/16 PO, OD 1/8 IN
Périphérique d’E/S numériques USB  ;	USB-6501		National Instruments

mesure NI de