Summary
このプロトコルは、パルミチン酸誘発 インビトロ モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果を調査します。
Abstract
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の発生は、世界中で驚くべき速度で増加しています。 プラティコドングランディフロラム は、さまざまな病気の治療のための伝統的な民族医学として広く使用されており、毎日の食事に組み込むことができる典型的な機能性食品です。研究によると、プラ ティコドングランディフロラムの主要な有効成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、バイオアベイラビリティが高く、NAFLDの進行を大幅に緩和することが示唆されていますが、その根本的なメカニズムはまだ不明です。この研究は、 インビトロでのNAFLDに対するPDの治療効果を調査することを目的としています。AML-12細胞を300μMパルミチン酸(PA)で24時間前処理し、 in vitroでNAFLDをモデル化した。次いで、細胞をPDで処理するか、または24時間PD処理を受けなかった。活性酸素種(ROS)を2',7'-ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色を用いて分析し、ミトコンドリア膜電位をJC-1染色法により決定した。さらに、細胞ライセート中のLC3-II/LC3-Iおよびp62/SQSTM1のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。PDは、対照群と比較して、PA治療群におけるROSおよびミトコンドリア膜電位レベルを有意に低下させることがわかった。一方、PDは、対照群と比較して、PA治療群でLC3-II / LC3-Iレベルを上昇させ、p62 / SQSTM1レベルを低下させました。結果は、PDが酸化ストレスを軽減し、オートファジーを刺激することによってin vitro でNAFLDを改善することを示しました。この インビトロ モデルは、NAFLDにおけるPDの役割を研究するための有用なツールです。
Introduction
プラティコドングランディフロラス(PG)、プラティコドングランディフロラス(Jacq)の乾燥根です。A.DC.は、伝統的な漢方薬(TCM)で使用されています。主に中国の北東部、北部、東部、中部、南西部で生産されています1。PG成分としては、トリテルペノイドサポニン、多糖類、フラボノイド、ポリフェノール、ポリエチレングリコール、揮発油、ミネラル2などが挙げられる。PGは、アジアで食品や漢方薬として使用されてきた長い歴史があります。伝統的に、このハーブは肺疾患に対する薬を作るために使用されていました。現代の薬理学はまた、他の疾患を治療するためのPGの有効性の証拠を提供する。研究によると、PGはさまざまな薬物誘発性肝障害モデルに治療効果があることが示されています。PGまたはプラチコジン抽出物の栄養補助食品は、高脂肪食誘発性肥満およびそれに関連する代謝性疾患を改善することができます3,4,5。PG由来の多糖類は、マウスのLPS/D-GalNによって引き起こされる急性肝障害の治療に使用できます6。さらに、PGの根からのサポニンは、高脂肪食誘発性非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を改善します7。さらに、PGの最も重要な治療成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、ヒト肝細胞癌(HepG2)細胞における低密度リポタンパク質受容体の発現および低密度リポタンパク質の取り込みを増強することができる8。さらに、PDはまた、アポトーシスを誘導し、HepG2細胞における接着、遊走、および浸潤を阻害することができる9,10。したがって、この研究では、マウス肝癌AML-12細胞を使用してin vitroモデルを構築し、このモデルにおけるPDの薬理学的効果と根底にあるメカニズムをさらに研究します。
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)という用語は、単純性脂肪症、NASH、肝硬変、および肝細胞癌を含む肝疾患のグループを指す11。NAFLDの病因は不完全に理解されていますが、古典的な「ツーヒット」理論から現在の「マルチヒット」理論まで、インスリン抵抗性はNAFLDの病因の中心であると考えられています12,13,14。研究によると、肝細胞のインスリン抵抗性は遊離脂肪酸の増加につながり、肝臓に沈着して肝臓を脂肪にするトリグリセリドを形成します15,16。脂肪の蓄積は、脂肪毒性、酸化ストレス誘発性ミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、および炎症性サイトカイン放出を引き起こし、NAFLDの病因と進行を引き起こす可能性があります17,18。さらに、オートファジーは、細胞のインスリン感受性、細胞脂質代謝、肝細胞損傷、および自然免疫の調節に関与しているため、NAFLDの病因にも役割を果たします19,20,21。
NAFLD22,23の病因および潜在的な治療標的を探索するための基礎を提供するために、様々な動物モデルおよび細胞モデルが確立されている。ただし、単一の動物モデルは、NAFLD24のすべての病理学的プロセスを完全に模倣することはできません。動物間の個人差は異なる病理学的特徴をもたらす。NAFLDのin vitro研究で肝細胞株または初代肝細胞を使用すると、実験条件で最大の一貫性が保証されます。肝脂質代謝調節不全は、NAFLD25における肝細胞脂質液滴蓄積のレベルを高める可能性があります。オレイン酸やパーム油などの遊離脂肪酸は、高脂肪食によって引き起こされるNAFLDを模倣するためにin vitroモデルで使用されています26,27。ヒト肝芽腫細胞株HepG2は、in vitroでのNAFLDモデルの構築によく使用されますが、腫瘍細胞株として、HepG2細胞の代謝は、通常の生理学的条件下での肝細胞の代謝とは大きく異なります28。したがって、初代肝細胞またはマウス初代肝細胞を使用して薬物スクリーニングのためのin vitro NAFLDモデルを構築することは、腫瘍細胞株を使用するよりも有利である。動物モデルとin vitro肝細胞モデルの両方での薬物効果と治療標的の相乗的検討を比較すると、マウス肝細胞を使用してin vitro NAFLDモデルを構築する方が、より良い応用の可能性を秘めているようです。
肝臓に入る遊離脂肪酸は酸化されてエネルギーを生成するか、トリグリセリドとして貯蔵されます。重要なことに、遊離脂肪酸は特定の脂肪毒性を有し、細胞機能障害およびアポトーシスを誘発し得る12。パルミチン酸(PA)は、ヒト血漿中に最も豊富に存在する飽和脂肪酸である29。非脂肪組織の細胞が高濃度のPAに長時間さらされると、これは活性酸素種(ROS)の産生を刺激し、酸化ストレス、脂質蓄積、さらにはアポトーシスを引き起こします30。したがって、多くの研究者は、肝細胞を刺激してROSを産生するための誘導因子としてPAを使用し、したがって、in vitro脂肪肝疾患モデルを構築し、細胞に対する特定の活性物質の保護効果を評価します31、32、33、34。この研究では、PAによって誘導されるNAFLDの細胞モデルに対するPDの保護効果を調査するためのプロトコルを紹介します。
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Protocol
AML-12細胞(正常マウス肝細胞株)は、細胞ベースの研究に使用されます。セルは市販の供給源から入手されます( 材料表を参照)。
1. AML-12細胞をin vitroでNAFLDをモデル化するための前処理
- 正常な細胞培養培地(DMEMとハムのF12 [1:1]0.005 mg/mLインスリン、5 ng/mLセレン、0.005 mg/mLトランスフェリン、40 ng/mLデキサメタゾン、および10%ウシ胎児血清[FBS]を含む、材料の 表を参照)で細胞を5%CO2の加湿雰囲気下で37°Cに維持します。
- 細胞を2.8 x 105 細胞/ウェルの密度の12ウェルプレート(1 mL/ウェル)に播種します。
注:すべての細胞消化および培地交換操作は、細胞の汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネット内で実行されます。 - 一晩インキュベーション(~10時間)した後に細胞の培養液を取り出し、1 mLの無血清培地(ウェルあたり)で細胞を2回洗浄します。
- 12ウェル細胞プレートを、(1)対照群、(2)PD治療群、(3)PA処理群、および(4)PA+PD治療群を含む4つの異なる処理群に左から右に分けます。
注:各実験的治療群の3つの反復は、同じ12ウェル細胞プレート上に上から下に配置されます。 - コントロール群とPD処理群に正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)を加え、PA処理群とPA+PD処理群に300 μMのPAを添加した正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)を加えます。
- 24時間のインキュベーション後に細胞の培養液を取り出し、次いで1 mLの無血清培地(1ウェルあたり)で細胞を2回洗浄します。
- ビヒクル(ジメチルスルホキシド、DMSO、0.1% v/v)を添加した正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)を対照群に加えます。PD処理群に1 μM PDを添加した正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)を追加します。300 μM PAを添加した正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)をPA処理群に加えます。300 μM PAおよび1 μM PDを添加した正常細胞培養培地(1 mL/ウェル)をPA + PD処理群に加えます。
- さらに24時間インキュベートした後、2′,7′-ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色(ステップ2)、JC-1染色(ステップ3)、およびウェスタンブロッティング(ステップ4)を使用して、細胞に対するPDの保護効果を調べます。
注:すべてのインキュベーション操作は、5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで行われます。
2. ROS産生の変化の測定
注:細胞内の細胞内ROSレベルは、DCFH-DA染色アッセイに基づいて評価されます。
- 処理期間の終了時(ステップ1.8)に、細胞をウェルあたり1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS、pH 7.4)で3回洗浄し、次にウェルあたり100 μLの10 μM DCFH-DAで細胞を染色します( 材料の表を参照)。細胞を暗所で30分間インキュベートします。
注:30分のインキュベーション後に明らかな緑色の蛍光が観察されない場合は、プローブと細胞のインキュベーション時間を適切に増やすことができます(30〜60分)。インキュベーションの30分後に緑色蛍光値の過剰露光が観察される場合、プローブおよび細胞のインキュベーション時間は適切に短縮することができる(15〜30分)。 - 細胞を1x PBS(1 mL /ウェル)で3回洗浄します。1 mLの1x PBSを各ウェルに加えます。
- 12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き( 材料表を参照)、20倍の対物レンズを使用して細胞の形態を観察します(倍率:200倍)。
- 励起波長480 nm、発光波長530 nmの緑色蛍光チャネルを用いて、各ウェルの代表的な蛍光画像3枚(倍率:200倍)を蛍光顕微鏡で撮影しました。
注:DCFH-DAの検出には、励起波長480nm、発光波長530nmの緑色蛍光チャネルをお勧めします。さらに、DCFH−DAは、蛍光顕微鏡35、36におけるGFPおよびFITCのパラメータ設定を用いて検出することができる。 - 最後に、画像取得ソフトウェア( 材料表を参照)で画像を処理し、ImageJソフトウェアを使用して、各グループの平均蛍光強度または異なるグループの比率を計算します。
注:イメージング作業に使用される蛍光顕微鏡およびImage Jソフトウェアの技術的詳細は、以前に説明されています37,38。
3. ミトコンドリア膜電位変化の測定
注:ミトコンドリア膜電位の変化は、JC-1染色アッセイによって監視されます。
- 処理期間の終了時(ステップ1.8)に、1ウェルあたり1 mLの1x PBSで細胞を3回洗浄し、次に100 μLの5 μg/mL JC-1作業溶液( 材料の表を参照)で37°Cの暗所で30分間細胞を染色します。
注:30分のインキュベーション後に明らかな緑色の蛍光が観察されない場合は、プローブと細胞のインキュベーション時間を適切に増やすことができます(30〜60分)。インキュベーションの30分後に緑色蛍光値の過剰露光が観察される場合、プローブおよび細胞のインキュベーション時間は適切に短縮することができる(15〜30分)。 - 細胞を1x PBS(1 mL /ウェル)で3回洗浄します。1 mLの1x PBSを各ウェルに加えます。
- 12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して細胞の形態を観察します(倍率:200倍)。
- 励起波長が485 nm、発光波長が535 nmの緑色蛍光チャネルと、励起波長が550 nmと発光波長が600 nmの赤色蛍光チャネルを用いて、各ウェルの代表的な蛍光画像3枚(倍率200倍)を蛍光顕微鏡で撮影しました。
注:励起波長485nm、発光波長535nmの緑色蛍光チャネルを使用して、脱分極ミトコンドリア39,40,41として扱われるJC-1モノマーを検出し、励起波長550nmおよび発光波長600nmの赤色蛍光チャネルを使用してJC-1二量体を検出し、 これは分極ミトコンドリア39,40,41として扱われます。 - 最後に、画像取得ソフトウェアで画像を処理し、Image Jソフトウェアを使用して、各グループの平均蛍光強度または異なるグループの比率を計算します。
注:イメージング作業に使用される蛍光顕微鏡およびImage Jソフトウェアの技術的詳細は、以前に説明されています37,38。
4. LC3-II/LC3-Iおよびp62/SQSTM1のタンパク質発現量の測定
- 処理後(ステップ1.8)、4°Cで予冷した1x PBS(1 mL/ウェル)で細胞を3回洗浄します。
- プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル(1x)を添加したRIPA溶解バッファー(100 μL/ウェル)( 材料の表を参照)を12ウェルプレートに加え、氷上で5分間溶解します。
- 細胞ライセートを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに回収し、12,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 標準手順42に従ったBCA法により上清のタンパク質濃度を求める。
- SDS-PAGEサンプルローディングバッファー(5x、 材料表を参照)を細胞ライセート上清(体積比= 1:4)に加えます。
- ボルテックス(高速で~15秒間)で混合し、混合サンプルを100°Cで5分間加熱してタンパク質を変性させます。
- 12ウェル調製した12%SDS-PAGEゲルを電気泳動槽に入れ、超純水で希釈したSDSアップサンプルバッファー(1x)を高さ限界位置まで加えます。
注意: SDS-PAGEゲルは、製造元の指示に従って、市販のキット( 材料表を参照)を使用して調製されます。 - タンパク質マーカー(5 μL/ウェル)とサンプル(20 μg/ウェル)をSDS-PAGEゲルの異なるウェルに追加します。
- 安定電圧モードを100Vに設定し、80分間電気泳動を行います。
- SDS-PAGE電気泳動後、以前に発表された報告43,44に従って、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(0.45 μM、材料表を参照)へのタンパク質の電気転写を実行します。
- タンパク質の電気転写後、室温のシェーカーで10 mLのTBST(1x TBS、0.1%トゥイーン20)でPVDFメンブレンを2回(5分/回)洗浄します。
- PVDFメンブレンを5 mLのウシ血清アルブミン(BSA、5%)で室温で1時間振とう機でブロックします。
- PVDFメンブレンを10 mLのTBSTで3回(10分/回)洗浄します。次に、LC3(マウスmAb、1:2,000)、p62/SQSTM1(以下、p62、マウスmAb、1:2,000)、およびβアクチン(マウスmAb、1:2,000)( 材料の表を参照)のブロッキングバッファーで希釈した5 mLの特異的一次抗体中でPVDFメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
- PVDFメンブレンを10 mLのTBSTで室温で3回(10分/時間)洗浄します。次に、ブロッキングバッファー(1:10,000)で希釈したウサギ抗マウスIgG(HRP)二次抗体( 材料の表を参照)とともにPVDFメンブレンを室温でインキュベートし、光から2時間保護します。
- PVDFメンブレンを10 mLのTBSTで室温で3回(10分/時間)洗浄します。次に、PVDFメンブレンをラップの上に置き、適量のECL作業溶液(200 μL/メンブレン)を加え( 材料の表を参照)、2分間インキュベートします。
- インキュベーション後、ECL作業溶液を取り出し、画像現像のためにイメージングシステムでPVDFメンブレンを露光します。最後に、Image Jソフトウェアを使用して、各バンドのグレー値を解析します。
注:イメージング作業に使用されるウェスタンブロッティングおよびImage Jソフトウェアの技術的な詳細は、以前に説明されています45,46。
5.統計分析
- 実験からのデータを平均±標準偏差(SD)として提示します。
- 前述の統計ソフトウェアツールを使用して有意性の分析を実行します47。
- t検定を使用して、2つのグループ間の統計的差を計算します。0.05未満のP値は統計的に有意であると見なされます:*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.005。
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Representative Results
細胞内の細胞内ROS
AML-12細胞を300 μM PAで24時間誘導し、NAFLD細胞モデルを確立しました。続いて、細胞をPDで24時間処理した。細胞をDCFH-DA蛍光プローブで標識し、ROS産生を蛍光顕微鏡下で観察した。細胞内の細胞内ROSのDCFH-DA染色の結果を 図1に示す。結果は、PDが300μMのPA(P < 0.01)でインキュベートされた細胞の細胞内ROSのレベルを大幅に低下させることができることを示し、PDが細胞の酸化ストレスを軽減できることを示しています。
細胞のミトコンドリア膜電位
ミトコンドリアは、内因性アポトーシス経路48,49,50によって支配される中心オルガネラである。そこで、PDとともに24時間インキュベートしたAML-12細胞のミトコンドリア膜電位(MMP)をJC-1染色後の蛍光顕微鏡で観察した。図2に示すように、緑色蛍光(JC-1モノマー、脱分極ミトコンドリア39、40、41として処理)は、PA処理細胞において、未処理細胞においてよりも高かった。一方、PA処理細胞における赤色蛍光(JC-1二量体、偏光ミトコンドリア39、40、41として処理)は、未処理細胞におけるよりも低く、細胞におけるPA誘導MMP脱分極を示す。また,PD治療群ではモデル群と比較してJC-1モノマー:二量体の比率が減少し(P < 0.01)、PDがPA誘発MMP脱分極を改善できることが示された。
LC3-II/LC3-Iおよびp62のタンパク質発現レベル
また、この研究では、細胞内のオートファジー関連タンパク質LC3およびp62のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングによって調べることにより、オートファジー経路に対するPDの潜在的な役割を調査しました。図3に示すように、LC3-II:LC3-Iの比率は有意に減少し(P < 0.005)、p62のタンパク質発現量はPAで48時間処理した後に増加しました(P < 0.01)。一方、PDはp62のタンパク質発現量を大幅に低下させ(P < 0.01)、LC3-II:LC3-Iの比率(P < 0.05)を増加させる可能性があり、PDがPAによって阻害されたオートファジーフラックスを回復させる可能性があることが示唆されています。
図1:DCFH-DA染色により評価した細胞内の細胞内ROSに対するPDの効果 。 (a)蛍光顕微鏡によりROS発生を200倍に検出した。スケールバー:20μm。 (B)異なるグループにおけるROSレベルの相対的な倍率の変化。各列は平均±SD(n = 3)を表す。**P < 0.01 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:JC-1染色によって評価された細胞内のMMP脱分極に対するPDの効果 。 (a)MMP脱分極は、蛍光顕微鏡、200倍によって検出した。スケールバー:20μm。 (B)異なるグループにおけるJC-1モノマー:ダイマー比の相対的な変化。各列は平均±SD(n = 3)を表す。**P < 0.01 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ウエスタンブロッティングで評価した細胞内のLC3-II/LC3-Iおよびp62のタンパク質発現レベルに対するPDの影響。 (A)LC3、p62、およびβ-アクチンのタンパク質レベルをウェスタンブロッティングで検出しました。(B)異なるグループにおけるLC3-II:LC3-I比の相対的な変化。(C)異なる群におけるp62の発現における相対的な倍率の変化。各列は平均±SD(n = 3)を表す。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
研究は、NAFLDが脂肪肝からNASHに至るまでの臨床病理学的症候群であり、肝硬変および肝臓癌に進行する可能性があるという事実を強調しています51。高脂肪食と非アクティブなライフスタイルは、NAFLDの典型的な危険因子です。NAFLD治療のための非薬物療法と薬物療法の両方が研究されています51,52,53。しかし、NAFLDの病因は完全には解明されていません。本明細書に記載される方法は、PA刺激AML−12細胞によって確立されたNAFLDのインビトロモデルを含む。このモデルでNAFLDに対するPDの保護効果を調べたところ、PDがPAによるROSの増加を減弱させることがわかりました。さらに、PDはPA誘発MMP脱分極も改善しました。さらに、PDはp62のタンパク質発現レベルを有意に低下させ、LC3-II:LC3-Iの比率を増加させる可能性があります。これらの実験結果は、NAFLD治療のための医薬品有効成分としてのPDの適用の基礎を提供する可能性があります。
主要な細胞内分解経路として、オートファジーは細胞内の過剰な成分を分解することによって栄養原料をリサイクルおよび再利用する生理学的プロセスを実現する19,54。オートファジーは、身体が「陰陽バランス」を維持するための重要な修復メカニズムでもあり、TCM55,56,57の「気変換」の微視的な具体化です。本プロトコールでは、ROS産生およびMMP脱分極の変化を検出することに加えて、オートファジー経路におけるPDの潜在的な役割を、ウェスタンブロッティングによってオートファジー関連タンパク質LC-3およびp62のタンパク質発現レベルを検出することによって調べた。PA誘導細胞をPDで処理した後、LC3-II:LC3-Iの比率は減少し、p62の蓄積は増加し、オートファジーのレベルが低下したことを示しています。実験結果は、他の文献報告20、34、58、59と一致している。このin vitro細胞モデルは、PDの生物学的機能の理解を改善し、NAFLDの治療のための他の活性TCM物質の使用を研究するのに役立つ可能性があります。
実験プロセスにはいくつかの重要なステップがあります。インビトロNAFLDモデルが首尾よく確立されるかどうかを決定するために、脂肪滴沈着物を、油Red O染色によって正常対照およびPA処理群細胞において比較することができる、60、61。DCFH-DA染色またはJC-1染色の後、細胞に入らない残りのプローブを洗い流す必要があります。そうしないと、蛍光画像を撮影するときに高いバックグラウンドが発生します。さらに、蛍光プローブ(DCFH-DAまたはJC-1)のローディングから測定までの時間(インキュベーション時間を除く)を短くして、実験誤差の可能性を減らす必要があります。さらに、蛍光プローブ(DCFH-DAまたはJC-1)の使用濃度は、陰性対照群の細胞の蛍光値が比較的高い場合に必要に応じて調整することができる。あるいは、JC−1作業液と細胞のインキュベーション時間は、実際の実験条件に応じて15〜60分の時間枠内で適宜調整することができる。
このin vitro細胞モデルにもいくつかの制限があります。肝実質細胞、肝星細胞、クッパー細胞、および血管内皮細胞などの細胞が肝臓組織62に存在する。したがって、肝実質細胞のみでの実験は、薬物の効果を説明するのに十分ではない可能性があります。他の細胞モデルも抗NAFLD創薬に使用する必要があります。さらに、3次元(3D)細胞培養系が肝臓モデルの構築および肝毒性試験に使用されている63,64。今後の研究では、潜在的な抗NAFLD薬スクリーニングのための共培養および3D細胞培養技術を使用したin vitroモデルの開発に焦点を当てます。
多系統疾患として、NAFLDの発症と進行には多くの要因が役割を果たしており、単一の動物モデルまたは細胞モデルでは、この疾患のすべての病理学的プロセスを完全に模倣することはできません65。動物モデルの使用に過度に依存すると、治療薬開発の負担が増大します。抗NAFLD薬開発の初期段階で in vitro 細胞モデルを使用することは、より実用的で費用効果が高いです。本研究では、正常マウス肝細胞株AML-12を用いてNAFLDの in vitro モデルを構築し、このモデルでPDの治療効果を検証しました。特に、この研究の結果は、マウス肝細胞および初代肝細胞モデルにおけるPDの抗NAFLD効果に関するさらなる研究の基礎を提供します。
結論として、NAFLDに対するPDの保護効果を研究するための インビトロ モデルがここに提示されます。これはまた、NAFLDの治療のためのTCMの他の活性物質の有効性を調査するための有用な インビトロ モデルであり得る。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、重慶科学技術委員会(cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013、およびjbky20210029)および中国ポスドク科学基金会(No.2021MD703919)からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
| AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
| Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
| Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
| cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
| Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
| Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
| DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
| Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
| Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
| MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
| Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
| Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
| Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
| Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
| Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
| Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
| Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
| Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
| SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
| SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
| Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
| SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
| WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
| β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |
References
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