Summary
Neseepitelet er det primære barrierestedet som alle respiratoriske patogener møter. Her skisserer vi metoder for å bruke primære nasale epitelceller dyrket som luft-væske-grensesnitt (ALI) kulturer for å karakterisere humane koronavirus-vert-interaksjoner i et fysiologisk relevant system.
Abstract
Tre høypatogene humane koronavirus (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) og SARS-CoV-2 (2019) - har dukket opp og forårsaket betydelige folkehelsekriser de siste 20 årene. Fire ekstra HCoV-er forårsaker en betydelig del av forkjølelsestilfeller hvert år (HCoV-NL63, -229E, -OC43 og -HKU1), noe som understreker viktigheten av å studere disse virusene i fysiologisk relevante systemer. HCoVs går inn i luftveiene og etablerer infeksjon i neseepitelet, det primære stedet som oppstår av alle respiratoriske patogener. Vi bruker et primært nasal epitelkultursystem der pasientavledede neseprøver dyrkes ved et luft-væskegrensesnitt (ALI) for å studere vertspatogen-interaksjoner på dette viktige vaktpoststedet. Disse kulturene rekapitulerer mange funksjoner i in vivo luftveiene, inkludert celletyper tilstede, ciliær funksjon og slimproduksjon. Vi beskriver metoder for å karakterisere virusreplikasjon, vertscelletropisme, virusindusert cytotoksisitet og medfødt immuninduksjon i nasale ALI-kulturer etter HCoV-infeksjon, ved å bruke nylig arbeid som sammenligner dødelige og sesongmessige HCoVs som et eksempel1. En økt forståelse av vertspatogeninteraksjoner i nesen har potensial til å gi nye mål for antivirale terapier mot HCoVs og andre respiratoriske virus som sannsynligvis vil dukke opp i fremtiden.
Introduction
Syv humane koronavirus (HCoVs) har blitt identifisert til dags dato og forårsaker en rekke luftveissykdommer2. De vanlige eller sesongmessige HCoVs (HCoV-NL63, -229E, -OC43 og -HKU1) er vanligvis forbundet med øvre luftveispatologi og forårsaker anslagsvis 10% -30% av forkjølelsestilfeller årlig. Selv om dette er den typiske kliniske fenotypen assosiert med de vanlige HCoVs, kan disse virusene forårsake mer signifikant nedre luftveissykdom hos risikopopulasjoner, inkludert barn, eldre voksne og immunkompromitterte individer 3,4. Tre patogene HCoV-er har dukket opp og forårsaket betydelige folkehelsekriser de siste 20 årene, inkludert alvorlig akutt respiratorisk syndrom (SARS)-CoV, Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS)-CoV og SARS-CoV-2. Dødelige HCoVs er assosiert med mer alvorlig luftveispatologi, noe som tydelig illustreres av >34% letalitet assosiert med MERS-CoV-tilfeller (894 dødsfall fra over 2,500 tilfeller siden fremveksten i 2012) 5,6. Det er viktig å merke seg at de dødelige HCoV-ene også forårsaker en rekke luftveissykdommer, fra asymptomatiske infeksjoner til dødelig lungebetennelse, som sett med den pågående COVID-19-pandemien7.
HCoVs, som andre respiratoriske patogener, går inn i luftveiene og etablerer en produktiv infeksjon i neseepitelet8. Spredning til nedre luftveier antas å være assosiert med aspirasjon fra munn-/nesehulen til lungen, der HCoVs forårsaker mer signifikant patologi i nedre luftveier 9,10,11. Dermed fungerer nesen som den første portalen for viral oppføring og er den primære barrieren mot infeksjon med sitt robuste mucociliary clearance-maskineri og unike medfødte immunmekanismer som tar sikte på å forhindre ytterligere viral spredning til nedre luftvei12,13. For eksempel har nasale epitelceller blitt rapportert å uttrykke høyere enn gjennomsnittlige basale nivåer av antivirale interferoner og interferonstimulerte gener, noe som indikerer at neseceller kan primes for tidlig respons på respiratoriske virus14,15,16.
Vi har tidligere benyttet pasientavledede primære nasale epitelceller dyrket ved et luft-væskegrensesnitt (ALI) for å modellere HCoV-vertsinteraksjoner i nesen, hvor HCoV-infeksjoner begynner. Nasale ALI-kulturer er ettergivende for både patogene (SARS-CoV-2 og MERS-CoV) og vanlige HCoVs (HCoV-NL63 og HCoV-229E) og gir forskjellige fordeler i forhold til tradisjonelle luftveisepitelcellelinjer som A549 (en lungeadenokarsinomcellelinje)16,17. Etter differensiering inneholder nasale ALI-kulturer en heterogen cellulær populasjon og viser mange av funksjonene som forventes av in vivo nasalepitel, slik som mukociliær clearance maskineri18. Neseceller gir også fordeler i forhold til lavere luftveiskultursystemer (som humane bronkiale epitelceller, HBECs), da oppkjøpet av neseepitelceller via cytologisk børsting er betydelig mindre invasiv sammenlignet med bruk av teknikker som bronkoskopi for å oppnå HBEC 19,20,21.
Dette papiret beskriver metoder for å utnytte dette nasale ALI-kultursystemet for å karakterisere HCoV-vertsinteraksjoner i neseepitelet. Vi har brukt disse metodene i nylig publiserte arbeider for å sammenligne SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 og HCoV-229E 1,16,17. Selv om disse metodene og representative resultatene legger vekt på studiet av HCoVs i denne nesecellemodellen, er systemet svært tilpasningsdyktig til andre HCoVs, så vel som andre respiratoriske patogener. Videre kan disse metodene anvendes bredere på andre ALI-dyrkningssystemer for å undersøke virusreplikasjon og cellulær tropisme, samt cytotoksisitet og medfødt immuninduksjon etter infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av neseprøver ble godkjent av University of Pennsylvania Institutional Review Board (protokoll # 800614) og Philadelphia VA Institutional Review Board (protokoll # 00781).
1. Infeksjon av nasale ALI-kulturer
MERK: Oppkjøp av kliniske prøver, samt vekst og differensiering av nasale ALI-kulturer, er utenfor omfanget av denne artikkelen. Spesifikke metoder for dyrking av primære nasale epitelceller finnes i nylig publiserte arbeider som bruker disse kulturene 18,22,23. Protokollene nedenfor kan i tillegg brukes på kommersielt tilgjengelige nasale epitelial ALI-kulturer hvis ønskelig. Protokoller og volumer beskrevet nedenfor gjelder for 24-brønns platetransbrønninnsatser (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 membranoverflate). Hvis du bruker ALI-kulturer dyrket på større transbrønner (dvs. 12-brønnsplater, 12 mm diameter, 1,12 cm2 overflateareal), juster volumene proporsjonalt for å gjenspeile transbrønnstørrelsen.
- Dag før smitte:
- Vask ALI-kulturer 3x med fosfatbufret saltvann (PBS) apikalt (tilsett ~ 200 μL oppvarmet PBS, sett i 37 ° C inkubator i 5 minutter, aspirer PBS og gjenta).
- Bytt ut basalmedium (500 μL).
- La kulturer balansere ved temperaturen der infeksjoner vil bli utført over natten (dvs. hvis infisering ved 33 ° C, plasser kulturer i en 33 ° C inkubator etter PBS vasker).
MERK: HCoVs assosiert med forkjølelse som HCoV-229E og HCoV-NL63 er rapportert å replikere mer effektivt ved 33 ° C. I tillegg er temperaturen på in vivo neseepitel 33 °C (dette skiller seg fra temperaturen i lungene, som er 37 °C).
- Fortynn virus etter behov i serumfritt Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) for å oppnå ønsket infeksjonsmangfold (MOI) i et totalt inokulumvolum på 50 μL.
MERK: Infeksjoner har vanligvis blitt utført ved MOI = 5 (høy MOI); Imidlertid har infeksjoner ved MOI = 0,5 (lav MOI) også blitt brukt for SARS-CoV-2 og forkjølelsesassosierte HCoVs, og disse resulterer i sammenlignbare maksimale virale titer, men med variabel kinetikk (enten MOI er akseptabelt). - Legg inokulum apisk, og plasser kulturer tilbake i inkubatoren i 1 time.
- Steinplater forsiktig hvert 15. minutt under infeksjon (hold platen fast i begge hender, gyng fremover og bakover og side til side for å sikre jevn adsorpsjon av viral inokulum).
- Etter 1 time inkubasjon, aspirer viral inokulum, og vask hver infisert kultur 3x med PBS for å sikre fjerning av viral inokulum (for hver vask, tilsett 200 μL PBS, inkuber i 5 minutter og aspirer eller fjern med en pipette).
- Hvis ønskelig, samle den tredje PBS-vasken for å bekrefte tilstrekkelig fjerning av inngangsvirus.
- Bytt ut basalmediet med friskt medium på infiserte ALIs hver 72. time under infeksjon.
2. Oppsamling av apikal overflatevæske (ASL) og titrering av skurvirus
- Ved forhåndsbestemte tidspunkter etter infeksjon, tilsett 200 μL PBS til apikal kammer for hver infisert transbrønn.
MERK: Relevante tidspunkter varierer avhengig av HCoV av interesse og varierer fra 24 timer til 192 timer etter infeksjon (se avsnittet om representative resultater for virale replikasjonsdata for ulike HCoV-er). - Pipette PBS opp og ned 5x for å sikre maksimal oppsamling av apikalt virus, og samle hele volumet i et mikrosentrifugerør (dette er ASL-prøven).
MERK: ASL inkluderer skurvirale partikler i tillegg til slim og andre produkter som utskilles apikalt fra ALI-kulturer. - Kvantifisere infeksiøst virus i ASL via standard viral plakkanalyse (serielt fortynnede virusholdige prøver for å kvantifisere konsentrasjonen av virale partikler).
MERK: Celletyper og inkubasjonsperiode som brukes til plakkanalyse vil avhenge av viruset som brukes: SARS-CoV-2 (VeroE6-celler); MERS-CoV (VeroCCL81 celler); HCoV-NL63 (LLC-MK2 celler); HCoV-229E (Huh7 celler). Detaljer om hvordan man utfører virale plakkanalyser er utenfor omfanget av dette manuskriptet, men har blitt beskrevet tidligere i en publikasjon fra Journal of Visualized Experiments (JoVE)24. - Hvis ønskelig, samle basalmediet på forskjellige tidspunkter etter infeksjon for å bekrefte fraværet av basalt frigjort virus. HCoV frigjøres vanligvis apikalt fra nasale epitelceller, men bekrefter dette via plakkanalyse av ufortynnet basalmedium.
- Oppbevar ASL-prøver ved -80 °C hvis kvantifisering ved plakkanalyse ikke vil forekomme på innsamlingsdagen.
3. Kvantifisering av intracellulært virus
- Etter å ha samlet ASL-prøve, flytt hver transwell inn i en ren 24-brønnsplate forhåndslastet med 500 μL DMEM som inneholder 2% føtalt bovint serum (FBS) i utgangspunktet.
MERK: DMEM med 2% FBS brukes til å stabilisere viruset under påfølgende fryse-tine sykluser. - Vask hver transwell 3x apikalt med PBS for å sikre fullstendig fjerning av apikalt virus.
- Etter å ha aspirert for å fjerne den endelige PBS-vasken, tilsett 100 μL DMEM med 2% FBS i det apikale rommet.
- Flytt platen som inneholder transbrønner med både apikale og basale medier til en fryser på -80 °C, og fullfør tre påfølgende fryse-tine-sykluser for å lyse cellene.
- Etter den siste fryse-tine-syklusen får apikale (100 μL) og basale (500 μL) medier i et rent rør.
- Sentrifuge ved 500 × g i 10 minutter ved 4 °C for å pelletere eventuelt cellulært rusk.
- Samle supernatanten. Dette er den intracellulære virusprøven for titrering via standard plakkanalyse.
MERK: Tre ganger fortynning skjer under innsamlingsprosessen i forhold til ASL-samling; ASL-prøver samles i 200 μL PBS, mens intracellulær virusprøve samles inn i et totalt volum på 600 μL.
4. Måling av transepitelial elektrisk motstand (TEER)
MERK: For TEER-måling bør PBS supplert med kalsium og magnesium (PBS + Ca 2+/Mg2+) brukes. Et epithelial volt / ohmmeter satt til å lese i ohm brukes (se materialfortegnelsen).
- Rengjør, balanserer og tøm EVOM-instrumentet i henhold til produsentens instruksjoner; Bruk en "tom" transwell uten neseceller tilsatt for blanking. Registrer tomt TEER-mål.
MERK: Hvis du bruker flere virus, må EVOM-instrumentet rengjøres strengt mellom forholdene for å unngå krysskontaminering (vask med 70% etanol etterfulgt av avionisert vann er tilstrekkelig). - Flytt hver infiserte transwell inn i en forhåndsmerket, ren 24-brønnsplate med 500 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ basalt for å vaske gjenværende basalmedium fra transbrønnene.
- Tilsett 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ til det apikale rommet i hver transbrønn.
- Tilsett 1 ml PBS + Ca 2+/mg2+ til Endohm-6 målekammeret.
- Flytt hver transwell inn i Endohm-6 målekammeret, og bytt lokket på kammeret slik at den apikale elektroden hviler i 200 μL PBS i det apikale rommet; basalelektroden er bygget inn i bunnen av Endohm-6-kammeret.
- La EVOM-avlesningen stabilisere seg, og registrer rå TEER-måling.
- Samle ASL-prøve som beskrevet ovenfor etter å ha tatt TEER-måling hvis titrering er ønsket (samle inn 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ som ble tilsatt for TEER-måling).
MERK: ASL-prøveinnsamling kan indusere mikrotårer i epitelbarrieren som kan forvirre TEER-avlesninger, så ASL må samles inn etter TEER-måling. Videre må basalmedium ikke endres umiddelbart før TEER-avlesninger, da dette også kan påvirke TEER-verdier. - For å konvertere rå TEER-avlesninger til endelige målinger i ohm / cm2, trekker du fra tom TEER-verdi og multipliserer denne verdien med overflaten av transbrønnmembranen ved hjelp av ligning (1):
TEER = [TEER-lesing - tom TEER-verdi] × (overflateareal av transwell) (1) - For HCoVs, vurder TEER hver 24. eller 48. time etter infeksjon; kinetikken til TEER-endringer varierer ofte mellom virus og nødvendiggjør feilsøking på ulike tidspunkter.
- Når du måler TEER, inkluder alltid mock-infiserte kulturer og evaluer ved hvert tidspunkt (negativ kontroll).
MERK: For mock-kulturer bør TEER-målinger forbli stabile eller kan øke litt fra baseline etter at differensiering av kulturene er fullført. Overflateareal av membranstøtter vil variere avhengig av størrelse og produsent av transwells; 24-brønns transbrønner har vanligvis et overflateareal på 0,33 cm2.
5. Måling av cytotoksisitet under infeksjon via analyse av laktatdehydrogenase (LDH)
MERK: I dette arbeidet ble LDH-innhold i ASL-prøver kvantifisert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig cytotoksisitetsdeteksjonssett. LDH-signalet i basalmedium var ofte under deteksjonsgrensen og ofte mindre reproduserbart enn LDH kvantifisert i ASL-prøver fra HCoV-infiserte kulturer.
- Forbered ytterligere kontroller som er nødvendige for LDH-analysen.
- Bakgrunnskontroll: bruk PBS (bruk PBS som inneholder kalsium og magnesium hvis ASL-prøver ble samlet inn på denne måten).
- Positiv kontroll (takverdi): behandle ALIs apikalt med Triton X-100. Samle Triton kontrollbrønner (bruk vanligvis tre ALI-kulturer for dette på hvert tidspunkt).
- Tilsett 200 μL 2% Triton X-100 i PBS direkte til det apikale rommet i transbrønnen.
- Inkuber i 10-15 minutter for å tillate celler å lyse helt.
- Samle hele volumet som en Triton takprøve.
- Negativ kontroll (lav kontroll / baseline LDH-frigivelse): samle ASL fra mock-infiserte ALI-kulturer avledet fra samme donor som infiserte kulturer.
- Samle negativ kontroll mock ASL etter ASL innsamling prosedyren ovenfor.
MERK: De samme transbrønnene kan brukes for denne negative kontrollen for alle tidspunkter, mens friske transbrønner vil være nødvendige for hvert tidspunkt for Triton-kontrollen.
- Samle negativ kontroll mock ASL etter ASL innsamling prosedyren ovenfor.
- For å tillate kvantifisering av skurvirus i tillegg til LDH-avlesninger fra hver ASL-prøve, last en optisk klar flatbunns svart 96-brønnplate som følger:
- Fortynn alle prøver i PBS, bruk 45 μL prøve og 55 μL PBS (100 μL totalt volum).
- Behandle Triton positiv kontroll og hån bakgrunnskontrollprøver på samme måte.
MERK: Denne fortynningen tillater triplikat belastning av hver eksperimentelle prøve (45 μL x 3) og nok gjenværende ASL-volum for titrering via plakkanalyse. - Last LDH-platen i tre eksemplarer: Triton tak, mock bakgrunnskontroll, PBS-kontroll og eksperimentelle prøver.
- Forbered reaksjonsblandingen som angitt av produsenten (fargestoffoppløsning + katalysator).
- Tilsett 100 μL reaksjonsblanding til hver brønn, og inkuber platen ved romtemperatur i 20 minutter beskyttet mot lys.
- Etter 20 min måles absorbansen ved 492 nm.
- Beregn prosentvis cytotoksisitet i forhold til Tritontakets verdi ved hjelp av ligning (2).
Cytotoksisitet (%)
(2)
(2)6. Fremstilling av nasale ALI-kulturer for immunfluorescens (IF) avbildning
- Flytt transwell inn i en frisk 24-brønns plate, og vask 3x apikalt med PBS (samle den første PBS-vasken som ASL hvis du titerer, utfør deretter to ekstra PBS-vasker for å fjerne overflødig skurvirus som kan hindre IF-kvaliteten)
- Etter den siste PBS-vasken, dekk transbrønnen apikalt og basalt i 4% PFA.
- Inkuber i 30 min for å fikse i 4% PFA, og fjern og vask deretter 3x med PBS.
- Excise transwell-støtten som inneholder cellene ved hjelp av et skjerpet barberblad eller saks.
- For å øke antall IF-mål for hver transbrønn, kutt hver membran i to og flekk hver halvdel med forskjellige antistoffkombinasjoner.
- Permeabiliser med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min.
- Blokk med 10% normalt eselserum og 1% BSA i PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) i 60 min ved romtemperatur.
MERK: Beskytt prøver mot lyseksponering fra dette trinnet fremover. - Inkuber i primær antistoffoppløsning over natten ved 4 °C. Fortynn alle antistoffer 1:1,000 i blokkerende buffer.
MERK: Representative antistoffer for HCoV-nukleokapsidfarging, samt epitelcelletypemarkører og cytoskjelettflekker, er oppført nedenfor (se materialfortegnelsen for produsentinformasjon og katalognumre).- For HCoV-antigenfarging, bruk antistoffer rettet mot SARS-CoV-2 nukleokapsid, MERS-CoV nukleokapsid og HCoV-NL63 nukleokapsid.
- For å identifisere epitelcelletyper, bruk antistoffer rettet mot begercellemarkør MUC5AC og ciliert cellemarkør type IV β-tubulin.
- For cytoskjelettmarkører, bruk antistoffer rettet mot falloidin (binder F-aktin) og epitelcelleadhesjonsmarkør: EpCAM (CD326).
- Inkubere i sekundær antistoffoppløsning i 60 minutter ved romtemperatur; Bruk sekundære antistofffargestoffer fortynnet 1:1,000 i blokkeringsbuffer.
- Etter at fargingen er fullført, overfør membranen til et lysbilde med en slikkepott, orienter transbrønnen med den apikale siden mot lysbildet og legg til monteringsløsning. La det roe seg i 15-30 min før du påfører klar neglelakk rundt kantene.
- Ta bilder ved hjelp av et konfokalmikroskop (Z-aksetrinn: 0,5 μm; sekvensiell skanning)1,16,17.
MERK: Etter fiksering av kulturer i 4% PFA og vask med PBS, kan faste kulturer lagres ved 4 °C i uker til måneder før farging og klargjøring for avbildning. Etter farging og montering av membraner kan prøvene lagres langvarige (>2 år) ved 4 °C i mørket.
7. Innsamling av intracellulært protein for vestlig immunoblotting eller RNA for RT-qPCR-analyse
- Samle ASL som beskrevet ovenfor hvis kvantifisering av virale titere (protokoll avsnitt 2).
- Flytt transbrønnen til en ren 24-brønnsplate, da skraping av membranen kan føre til brudd på innsatsen.
- For western blot-analyse, samle totalt proteinlysat i 125 μL RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS, 1% NP40) supplert med proteasehemmere og fosfatasehemmere.
- Tilsett 125 μL RIPA-buffer til det apikale rommet, og inkuber i 5-10 minutter.
- Skrap membranen med en P200-pipettespiss for å fjerne eventuelle gjenværende festede celler, og samle hele volumet (skrap kraftig over hele overflaten av membranen, og pipetter deretter opp og ned flere ganger for å samle hele prøven).
- Inkuber proteinlysatprøver på is i 10 minutter, og sentrifuger deretter med maksimal hastighet (20 000 × g) i 10 minutter ved 4 °C.
- Bland supernatanten med 4x Laemmli prøvebuffer med β-merkaptoetanol (reduksjonsmiddel) i henhold til produsentens protokoller.
- Kok proteinprøver ved 95 °C i 5 min, og kjør deretter med tradisjonelle vestlige blottingsprotokoller 1,16,17.
- For innsamling av totalt RNA, bruk et kommersielt tilgjengelig RNA-ekstraksjonssett med valg.
MERK: Det apikale rommet med 24-brønns transbrønninnsatser har et maksimalt volum på ~ 200 μL; Dermed utfører vi to sekvensielle vasker på hver kultur for å nå totalt anbefalt volum. Detaljer nedenfor tilsvarer anbefalt innsamling av RNA-prøver i et totalt volum på 350 μL. - Legg til 200 μL lysisbuffer til det apikale rommet av den infiserte transbrønnen.
- La stå i 5-10 minutter, skrap eventuelle gjenværende celler fra membranen ved hjelp av en pipettespiss, og samle hele volumet i et merket mikrosentrifugerør.
- Tilsett 150 mikroliter ekstra lysisbuffer til det apikale rommet i transbrønnen, og pipett opp og ned før det samles opp i samme mikrosentrifugerør.
- Pakk ut RNA i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative tallene er delvis tilpasset fra data som finnes i manuskriptet Otter et al.1. Nasale ALI-kulturer avledet fra fire eller seks donorer ble infisert med en av fire HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 og HCoV-229E) i henhold til protokollene beskrevet ovenfor, og de gjennomsnittlige apikale virale titere for hvert virus er vist i figur 1A. Mens alle disse fire HCoV-ene replikerer produktivt i nasale ALI-kulturer, replikerer SARS-CoV-2 og HCoV-229E den mest effektive. Merk at dette er gjennomsnittlige virale titer, og at titere for hver HCoV hos individuelle donorer nylig ble publisert1. Etter vask av nasale ALI-kulturer som beskrevet i protokollavsnitt 3, sammenlignes MERS-CoV-titere i apikal overflatevæske (ASL) med intracellulære virale titere i figur 1B. MERS-CoV intracellulære og apikalt virale titere er omtrent de samme ved 48 timer etter infeksjon (hpi).
Immunfluorescensavbildning av infiserte nasale ALI-kulturer er et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke cellulær tropisme og andre infeksjonsparametere, for eksempel syncytidannelse, celle-til-celle-fusjon og skade på epitelbarriereintegritet. Samfarging av infiserte kulturer med antistoffer som er spesifikke for virale antigener (som nukleokapsid eller HCoV ikke-strukturelle proteiner) og markører for cilierte eller begerceller (henholdsvis type IV β-tubulin og MUC5AC) kan bestemme cellulær tropisme for en HCoV i nasale ALIs25,26. Figur 2A viser representative bilder av nesekulturer infisert med SARS-CoV-2, MERS-CoV og HCoV-NL63.
SARS-CoV-2 og HCoV-NL63 infiserer primært cilierte celler (påvist ved samlokalisering av viral nukleokapsidfarging med ciliamarkør type IV β-tubulin og mangel på kolokalisering av viralt antigen med begercellemarkør MUC5AC). MERS-CoV infiserer hovedsakelig ikke-cilierte begerceller i nasale ALI-kulturer, da MERS-CoV viser motsatt mønster, med kolokalisering av viral antigenfarging med MUC5AC og minimal kolokalisering av viral nukleokapsidfarging med type IV β-tubulin. Markører som falloidin, som binder seg til aktinfilamenter, eller EpCAM, epitelcelleadhesjonsmolekyl, kan brukes til å visualisere epitelcelleskjelettet og oppdage tap av epitelbarriereintegritet27. Figur 2B viser falloidinfarging i nasal ALI-dyrkning; panel 1 viser intakt cytoskjelett F-aktin ultrastruktur i en mock-infisert kultur, og panel 2 viser tap av falloidinintegritet og antyder potensiell skade på epitelbarrierefunksjon i en HCoV-NL63-infisert kultur. Epitelmarkører som disse kan brukes på HCoV-infeksjoner for å karakterisere epitelbarrieredynamikk under infeksjon.
Etter infeksjon av nasal ALI-kultur med hver av de fire HCoV-ene ble transepitelial elektrisk motstand (TEER) overvåket. Baseline TEER-målinger ble registrert før infeksjon, 0 hpi, og TEER ble igjen evaluert for hver transwell ved 96 hpi og 192 hpi. Figur 3 viser TEER-forandringer for hver av HCoV-ene. Figur 3A,B viser ΔTEER-verdier (forskjeller i TEER beregnet for hver transwell ved å trekke baseline TEER ved 0 hpi fra TEER målt på et gitt punkt). For SARS-CoV-2, MERS-CoV og HCoV-NL63 skjer store endringer i TEER sent i infeksjonen (192 hpi), og figur 3A illustrerer at SARS-CoV-2- og HCoV-NL63-infeksjoner gir negative ΔTEER-verdier (192 hpi - 0 hpi), mens MERS-CoV-infeksjon ikke gjør det. Mock ΔTEER-verdier er inkludert for sammenligning og illustrerer at endringer i TEER etter MERS-CoV-infeksjon ikke er signifikant forskjellige fra de som er sett under mockinfeksjon. Negative ΔTEER-verdier indikerer reduksjon i epitelbarriereintegritet og kompromittert epitelbarrierefunksjon. Figur 3B viser ΔTEER-verdier for HCoV-229E (beregnet ut fra 96 hpi og 192 hpi). HCoV-229E forårsaker epitelbarrieredysfunksjon ved det tidligere tidspunktet (96 hpi), men gjenoppretting til mock-nivåer skjer på det senere tidspunktet (192 hpi). Disse dataene fremhever hvordan TEER-kinetikk kan variere mellom virus. Figur 3C,D viser TEER-spor, som viser rå TEER-data for hver infiserte transwell over tid, og dermed muliggjør visualisering av TEER-trender i løpet av infeksjonen. Om ønskelig kan behandling med cytokinet IL-13 inkluderes som en positiv kontroll under TEER-eksperimenter, da dette svekker stramme kryss, kompromitterer epitelbarrierefunksjonen og dermed øker membranpermeabiliteten i luftveisepitelet; Derfor forventes cytokin IL-13 å resultere i reduksjoner i TEER28,29,30.
For å komplementere TEER-målinger i nasale kulturer, kan cytotoksisitet kvantifiseres via kvantifisering av laktatdehydrogenase (LDH) frigjort apikalt under infeksjon. Figur 4 viser gjennomsnittlige cytotoksisitetsdata ved 96 hpi og 192 hpi fra kulturer avledet fra 10 donorer infisert med hver av HCoVs analyserte. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 og HCoV-229E forårsaker signifikant cytotoksisitet i nasale kulturer, mens MERS-CoV ikke gjør det.
Totalt protein eller RNA samlet fra infiserte nesekulturer kan brukes til å undersøke ulike HCoV-vertsinteraksjoner. Vi behandlet nesekulturer med type 2 cytokin IL-13 for å indusere begercellehyperplasi og modellere vevslandskapet i en astmatisk luftvei. Figur 5A viser qPCR-data som kvantifiserer mRNA-overflod av to store HCoV-reseptorer etter IL-13-behandling. DPP4 er den cellulære reseptoren for MERS-CoV, og ACE2 er den cellulære reseptoren for både SARS-CoV-2 og HCoV-NL63. IL-13-behandling resulterer i dramatisk økt DPP4-uttrykk, men ingen signifikante endringer i ACE2-uttrykk. Figur 5B viser vestlige data for å evaluere proteinmengde etter IL-13-behandling i ikke-infiserte og SARS-CoV-2-infiserte kulturer. IL-13-behandling resulterer i signifikant økt MUC5AC (en begercellemarkør) og redusert type IV β-tubulin (en ciliert cellemarkør), noe som gjenspeiler den forventede begercellehyperplasien forårsaket av denne cytokinbehandlingen. Proteinnivåanalyse viser at IL-13-behandling øker DPP4-uttrykk, men reduserer ACE2-ekspresjon. Vestlig blotting for SARS-CoV-2 nukleokapsidprotein avslører at IL-13-behandling resulterer i en liten reduksjon i viralt antigen sammenlignet med skambehandlede kulturer. Lignende analyser kan utføres for ethvert mRNA eller protein av interesse etter manipulering av nasale ALI-kulturer og / eller infeksjon med HCoVs.
Figur 1: HCoV-replikasjon i nasale ALI-kulturer. Nasale kulturer fra seks eller fire donorer ble infisert i triplikat med sars-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) eller HCoV-229E (4) ved MOI = 5. Apikal overflatevæske ble samlet opp ved 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi og 144 hpi, og infeksiøst virus ble kvantifisert ved plakkanalyse. (A) Gjennomsnittlige virale titere fra alle givere infisert med hver HCoV er avbildet. (B) Nasale kulturer avledet fra en enkelt donor ble infisert i triplikat ved MOI = 5, og ASL ble samlet ved 48 hpi. Etter ASL-oppsamling ble transbrønnene vasket 3x med PBS og deretter lysert via fryse-tining for å kvantifisere intracellulært virus. Infeksiøst virus i det apikale skurrommet versus i det intracellulære rommet ble kvantifisert ved plakkanalyse. Data vises som gjennomsnitt ± SD. Forkortelser: ALI = luft-væske-grensesnitt; MOI = mangfold av infeksjon; ASL = apikal overflatevæske; HPI = timer etter infeksjon; PBS = fosfatbufret saltvann. Denne figuren ble konstruert ved hjelp av data publisert i Otter et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunfluorescensavbildning av nasale ALI-kulturer for å karakterisere cellulær tropisme og epitelintegritet. (A) Nasale ALI-kulturer ble infisert med sars-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63 ved MOI = 5 og fiksert i 4 % paraformaldehyd ved 96 hpi. Kulturer ble forberedt for immunfluorescensavbildning, som beskrevet ovenfor i protokoll avsnitt 6, ved bruk av primære antistoffer mot hvert virus nukleokapsidprotein (vist i rødt), ciliert cellemarkør type IV β-tubulin (grønn) eller begercellemarkør MUC5AC (grønn). Merk at et antistoff mot MERS-CoV ikke-strukturelt protein 8 (nsp8) ble brukt i stedet for et antistoff mot nukleokapsidprotein på grunn av artsinkompatibilitet med MUC5AC-antistoffet. Kolokalisering mellom viralt antigen og hver av epitelcellemarkørene visualiseres som oransje / gul farge i sammenslåtte bilder for hvert virus. (B) Nasale ALI-kulturer ble farget med falloidin (som flekker aktincytoskjelettfilamenter) for å visualisere cytoskjelettintegritet, som vist i rosa. Hoescht-farging er vist i blått. Panel 2B.1 viser skarp, intakt falloidinfarging, noe som indikerer intakt cytoskjelettarkitektur, mens panel 2B.2 viser tap av epitelintegritet og uskarphet av falloidinflekken. Skalastenger = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Forkortelser: ALI = luft-væske-grensesnitt; MOI = mangfold av infeksjon; HPI = timer etter infeksjon. Denne figuren ble konstruert ved hjelp av data publisert i Otter et al. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Måling av transepitelial elektrisk motstand i ALI-kulturer under infeksjon. (A) Nasale ALI-kulturer avledet fra 10 donorer ble enten mock-infisert eller infisert ved MOI = 5 med SARS-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63. ΔTEER ble beregnet for hver transwell som TEER ved 192 hpi minus TEER ved 0 hpi (baseline TEER). Hver stolpe illustrerer gjennomsnittlig ΔTEER-verdi for hvert virus blant triplikate kulturer fra hver donor. (B) Nasale ALI-kulturer avledet fra 8 donorer ble mock-infisert eller infisert med HCoV-229E ved MOI = 5. ΔTEER fra baseline TEER ble beregnet som i (A) ved bruk av TEER ved enten 96 hpi eller 192 hpi. (C,D) TEER-sporingsdata er avbildet for mock-infiserte eller HCoV-infiserte kulturer avledet fra hver av fire givere. Hver linje representerer TEER-data fra en enkelt transwell over tid (triplikate transbrønner fra hver donor ble analysert). Donornumrene er fargekodet og vises i nøkkelen til høyre for hver graf. Data vises som gjennomsnitt ± SD i panel A og panel B. Forkortelser: ALI = luft-væske-grensesnitt; MOI = mangfold av infeksjon; HPI = timer etter infeksjon; TEER = transepitelial elektrisk motstand. Denne figuren ble konstruert ved hjelp av data publisert i Otter et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cytotoksisitetskvantifisering under HCoV-infeksjon i nasale ALI-kulturer. Nasale kulturer avledet fra 10 donorer infisert med hver HCoV i triplikat ved MOI = 5 gjennomgikk LDH-kvantifisering i ASL-prøver, som beskrevet ovenfor. Gjennomsnittlig cytotoksisitet blant alle testede donorer er vist for hver HCoV ved 96 hki og 192 hpi. Data vises som gjennomsnitt ± SD. Forkortelser: ALI = luft-væske-grensesnitt; MOI = mangfold av infeksjon; HPI = timer etter infeksjon; TEER = transepitelial elektrisk motstand; ASL = apikal overflatevæske; LDH = laktatdehydrogenase. Denne figuren ble konstruert ved hjelp av data publisert i Otter et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: mRNA/proteinanalyse etter infeksjon i nesekulturer. Nasale kulturer behandlet med type 2 cytokin IL-13 eller sham-behandlet ble brukt til å evaluere endringer i ekspresjon av HCoV-reseptorer, samt i ciliated og begercellemarkører. (A) mRNA-ekspresjon av DPP4 og ACE2 ble kvantifisert via RT-qPCR. Data for kulturer fra tre donorer behandlet med IL-13 er vist som foldeendringer over narrebehandlede kulturer avledet fra de samme donorene. Data vises som gjennomsnitt ± SD, der hvert punkt representerer gjennomsnittlig induksjon av foldeendring for en enkelt donor. (B) Totalt protein ble høstet fra nesekulturer som enten var skam- eller IL-13-behandlet og enten mock- eller SARS-CoV-2-infisert. Proteiner ble separert via SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer mot epitelcellemarkører (type IV β-tubulin, MUC5AC), HCoV-reseptorer (ACE2, DPP4), SARS-CoV-2 nukleokapsidprotein og GAPDH. Forkortelser: RT-qPCR = revers-transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese. Denne figuren ble konstruert ved hjelp av data publisert i Otter et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som er beskrevet her, beskriver et primært epitelkultursystem der pasientavledede nasale epitelceller dyrkes ved et luft-væskegrensesnitt og brukes til studiet av HCoV-vertsinteraksjoner. Når de er differensiert, rekapitulerer disse nasale ALI-kulturene mange funksjoner i in vivo nasalepitelet, inkludert en heterogen cellulær populasjon med cilierte, beger og basale celler representert, samt intakt mucociliary funksjon med robust slående cilia og slimutskillelse. Denne heterogene cellepopulasjonen er en viktig fordel for dette kultursystemet over tradisjonelle respiratoriske epitelcellelinjer, da det muliggjør karakterisering av vertscelletropisme under virusinfeksjon (som vist i figur 2). Tradisjonelle luftveisepitelcellelinjer mangler også funksjonelle mukociliære clearancemekanismer, som spiller nøkkelroller i primærforsvaret mot respiratoriske virus sammen med medfødte immunveier som interferonproduksjon.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer den første infeksjonsprosedyren; For eksempel må kulturene likevektes ved ønsket temperatur før infeksjon, og en konsistent metodikk bør brukes for å starte hver infeksjon. Disse trinnene er avgjørende for å standardisere metoden og sikre reproduserbarhet i nedstrømsfunn.
Kanskje den viktigste delen av disse metodene er kvantifiseringen av apikalt utgitt virus, da forståelse av den unike replikasjonssyklusen til hver HCoV bidrar til å bestemme tidspunktene som kan være best for videre analyse. Immunfluorescensteknikkene beskrevet ovenfor er også kritiske, da evnen til å visualisere virusinfeksjoner i et in vitro nasalepitel med en representativ heterogen cellulær populasjon muliggjør nøyaktig vurdering av viral tropisme og gir muligheten til ytterligere spørring av virus-vert-interaksjoner i en fysiologisk setting.
Neseepitelet er det primære barrierestedet som oppstår av alle respiratoriske virus, og det er derfor sannsynlig at HCoV-infeksjoner begynner med primær infeksjon i neseepitelet, med potensial til å spre seg til nedre luftvei via en oral-lunge aspirasjonsakse. Dette spiller sannsynligvis en rolle i utviklingen av alvorlig lungebetennelse og luftveissykdom under patogen HCoV-infeksjon (MERS-CoV, SARS-CoV-2), mens sesongmessige HCoVs har en tendens til å forårsake sykdom bare i de øvre luftveiene. Det er viktig å forstå HCoV-vertsinteraksjoner i dette viktige immunsentinelstedet, og dette nasale ALI-systemet muliggjør karakterisering av viral replikasjon, vertscelletropisme, samt cytotoksisitet og medfødt immuninduksjon under HCoV-infeksjon.
Dette nasale ALI-kultursystemet er også svært tilpasningsdyktig og kan brukes til å speile mange kliniske sykdomstilstander. Neseprøver ervervet fra pasienter med genetiske lungesykdommer som cystisk fibrose (forårsaket av en kloridkanaldefekt) eller primære ciliære dyskinesier (hvor ciliære slagmekanismer er dysfunksjonelle) kan brukes til å dyrke nasale ALI-kulturer som er representative for disse patologiene for å forstå hvordan disse pasientene kan bli differensielt påvirket av HCoV-infeksjon31,32. I tillegg kan ulike cytokinbehandlinger brukes under differensiering av nasale ALI-kulturer for å gjenskape trekk ved andre sykdomstilstander. For eksempel induserer IL-13-behandling under differensiering begercellehyperplasi og kan brukes som surrogat for å studere astmatisk eller allergisk luftvei33,34. Dermed er dette nasale ALI-systemet et kraftig verktøy for å undersøke HCoV-vert, så vel som andre virusvertsinteraksjoner både i sunne og syke neseluftveier.
Selv om dette systemet gir mange fordeler, oppstår det også noen begrensninger ved bruk av nasale ALI-kulturer. Selv om neseceller krever langt mindre invasive teknikker for oppkjøp enn bronkial- eller lungeceller, krever dyrking og differensiering av ALI-kulturer betydelig mer tid og ressurser enn bruk av tradisjonelle immortaliserte cellelinjer. I tillegg kan donor-til-donor-variabilitet når det gjelder permissivitet for infeksjon, samt vertsrespons på HCoV-infeksjon, gjøre det vanskeligere å reprodusere og tolke data (derfor utføres eksperimenter ofte med kulturer avledet fra 5-10 givere for å redusere disse problemene).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Susan Weiss sitter i Ocugens vitenskapelige rådgivende styre. Noam A. Cohen konsulterer for GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi / Regeron og Oyster Point Pharmaceuticals og har et amerikansk patent, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10,881,698 B2, WO20913112865), og en lisensavtale med GeneOne Life Sciences.
Acknowledgments
Denne studien har følgende finansieringskilder: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. og N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. og N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. og N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
- MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
