Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

Summary

Les modèles murins peuvent être des outils utiles pour étudier la biologie de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR). Il a été établi que les souris peuvent développer un éventail de pathologies RPE. Ici, nous décrivons un protocole de phénotypage pour élucider et quantifier les pathologies RPE chez la souris en utilisant la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale.

Abstract

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est un trouble rétinien débilitant chez les populations vieillissantes. Il est largement admis que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique clé dans la DMLA. Pour comprendre les mécanismes qui conduisent au dysfonctionnement de l’EPR, les chercheurs peuvent utiliser des modèles murins. Il a été établi par des études antérieures que les souris peuvent développer des pathologies RPE, dont certaines sont observées dans les yeux des personnes diagnostiquées avec la DMLA. Nous décrivons ici un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies de l’EPR chez la souris. Ce protocole comprend la préparation et l’évaluation de coupes transversales rétiniennes par microscopie optique et microscopie électronique à transmission, ainsi que celle de montures plates RPE par microscopie confocale. Nous détaillons les types courants de pathologies de l’EPR murin observés par ces techniques et les moyens de les quantifier grâce à des méthodes non biaisées pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons ce protocole de phénotypage RPE pour quantifier les pathologies RPE observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135 (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage C57BL/6J. L’objectif principal de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins de DMLA.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie cécitante courante qui touche les populations de plus de 55 ans¹. De nombreux chercheurs pensent que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique précoce et crucial dans la DMLA². L’EPR est une monocouche de cellules polarisées chargée de maintenir l’homéostasie des photorécepteurs voisins et des vaisseaux sanguins choroïdiens³. Il existe divers modèles pour étudier les mécanismes associés à la maladie au sein de l’EPR, y compris les modèles de culture cellulaire....

Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison et sont conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie optique

1. Fabriquez un tampon fixateur qui a une concentration finale de 2% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldéhyde à température ambiante (RT) dans une bouteille en verre.
   REMARQUE: Ce protocole nécessite, au maximu....

Results

L’achèvement du protocole de phénotypage RPE décrit dans cet article fournit une analyse quantitative des anomalies structurelles de l’EPR couramment observées dans les modèles murins de DMLA. Pour confirmer l’efficacité de ce protocole, nous l’avons utilisé chez des souris connues pour présenter des pathologies de l’EPR, y compris des souris transgéniques qui surexpriment WT Tmem135 entraînées par le promoteur de la bêta-actine de poulet (Tmem135 TG)30 et des souris C57BL/6J âgées^31,32

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies structurelles de l’EPR de modèles murins. Nous avons décrit les étapes nécessaires au traitement des yeux pour diverses techniques d’imagerie telles que la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale, ainsi que la quantification des pathologies typiques observées via ces méthodes d’imagerie. Nous avons prouvé l’efficacité de notre protocole de phénotypage RPE en examinant des souris Tmem135.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 M Tampon cacodylate pH7.2	PolyScientiifc R& D Company	S1619
Boîte de diapositives			Deux sont nécessaires pour ce protocole (un pour H& Diapositives teintées E et une pour les supports plats RPE.)
100 % éthanol	L’entrepôt MDS	2292-CASE	peut être utilisé pour fabriquer des solutions d’éthanol dilué dans ce protocole.
Robinet d’arrêt à 1 voie, 2 Luer Locks femelles	Qosina	11069
1x solution tampon de phosphate (PBS)			1x PBS préfabriqué peut être utilisé dans ce protocole.  ;
Microtubes de 2,0 mL	Genesee Scientific  ;	24-283-LR
24 Enveloppe de capsule d’intégration de cavité Moule de substitution	de moule Microscopie électronique Sciences	70165
Tube en PVC de 24 pouces avec extrémités Luer Fisher	Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Squares Mesh Grids	Microscopie électronique Sciences	T400-Cu
95 % Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Sous-couches absorbantes avec barrière imperméable contre l’humidité (23 pouces sur 24 pouces)	VWR	56616-031
Réglable 237 ml  ; Flacon pulvérisateur	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Âne conjugué anti-Lapin IgG  ;	Thermo Fisher Scientific	A-21206
			d’aluminium
BD Precision glide Calibre 19 Seringue Aiguille	Sigma-Aldrich  ;
pinces à fougères ; Courbé; dentelures croisées fines ; Longueur de 4 po, largeur de pointe de 1 mm Instrument	chirurgical Roboz	RS-5211	Connu sous le nom de pince incurvée dans ce protocole.
Brosse en poil de chameau	Microscopie électronique Sciences	65575-02
Dioxyde de carbone Chambre
Débitmètre
Réservoir
Pinces d’extension de broches Castaloy	Scientific  ;	05-769-7Q
Support de base en L en fonte	Fisher Scientific  ;	11-474-207
Programme			Disponible en téléchargement : https://cellprofiler.org/releases
Vernis à ongles transparent	Microscopie électronique Sciences	72180
Lames de microscope Colorfrost Lavande	VWR	10118-956
Ordinateur
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
distillée H20			du système de purification Milli-Q a été utilisée dans ce protocole.
Pince à épiler à pointe mince Dumont ; Modèle #55	Instrument chirurgical Roboz	RS-4984	Connu sous le nom de pince à pointe fine dans ce protocole, et 3 sont nécessaires pour ce protocole (deux pour les dissections et un pour le traitement au microscope électronique).
Support de grille de microscopie électronique	Microscopie électronique Sciences	71147-01
EPON 815 Résine	Microscopie électronique Sciences	14910
Epredia Mark-It Marquage tissulaire Colorant jaune	Fisher Scientific  ;	22050460	Veuillez suivre le protocole du fabricant lorsque vous utilisez ce colorant de marquage tissulaire.
Epredia Support de montage	Fisher Scientific	22-110-610	Utilisation pour le montage H& E diapositives.  ;
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series, 150 w Source lumineuse halogène	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Source lumineuse pour microscope de dissection.
Fiji ImageJ Program			Disponible en téléchargement : https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific  ;   ;	14-666-18Q
Hotte
Glutaraldéhyde 2,5 % dans un tampon phosphate, pH 7,4, 32 %	Microscopie électronique Sciences	16537-05
JEM-1400 Microscope électronique à transmission (JEOL) avec une caméra
Agitateur			de paillasse de laboratoireDeux sont nécessaires pour ces expériences. L’un doit être à température ambiante tandis que l’autre doit être dans une pièce froide à 4 degrés Celsius.
Laser Cryo Tag Étiquettes	Microscopie Electronique Sciences	77564-05
Citrate de plomb	Microscopie électronique Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Utilisez ces lamelles pour les supports plats RPE car elles ont des bords surélevés et s’adaptent à l’épaisseur du RPE.
Mayer’s Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissection Ciseaux à ressort	Roboz Instrument chirurgical	RS-5600	Connu sous le nom de micro-dissection ciseaux dans le protocole.  ;
Méthanol	Fisher Scientific  ;	Souris A412-4
N’importe			souris AMD et ses commandes respectives peuvent fonctionner pour ce protocole.
Micro ciseaux de dissection ; Version standard ; Courbé; Pointes acérées ; Longueur de lame de 24 mm ;	Instrument chirurgical Roboz	RS-5913	Connu sous le nom de ciseaux incurvés dans ce protocole.
Microsoft Excel
Racks à
Nikon A1RS Microscope
Sérum d’âne normal	SouthernBiotech	0030-01
Numéro 11 Lames de scalpel jetables stériles	VWR	21909-380
Tétroxyde d’osmium  ;	Microscopie électronique Sciences	19150
Paraformaldéhyde, 32 %	Microscopie électronique Sciences	15714-S
Crayon
Boîte de Pétri	VWR  ;	21909-380
Pointes
de pipette Pipettes  ;
Anticorps polyclonal anti-ZO-1	Thermo Fisher Scientific	402200
Microscopie	oxyde de propylène	20412
Lame de rasoir	VWR	10040-386
Plateau peu profond pour perfusions de
Shandon Eosin Y Alcoolique	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Noir Marqueur Permanent	Agrafes	642736
Porte-Lames pour Coloration	Grainger	49WF31
Couverture Carrée Lames de Verre	Fisher Scientific  ;	12-541B
Plat de coloration avec couvercle	Grainger	49WF30	Besoin de 15 pour H& E.
Seringue Luer-Slip jetable de 50 mL tout en plastique Target  ;	Thermo Scientific  ;	S7510-50	N’utilisez que le corps de la seringue.
Minuterie	Fisher	1464917
Acétate d’uranyle	Microscopie électronique Sciences	22400
Four à
Vectashield Montage Medium	Vector Laboratories	H-1000	Utilisation pour le montage de supports plats RPE.  ;
Xylene	Fisher Scientific  ;
Microscope			Ce microscope a la capacité de générer des images 20x assemblées. Si un microscope optique n’a pas cette capacité, prenez des images de l’ensemble de la rétine qui se chevauchent légèrement. Utilisez Adobe Photoshop pour assembler ces images. Veuillez vous référer aux manuels du programme Adobe Photoshop pour l’assemblage d’images.  ;
Zeiss Stemi 2000 Microscope de dissection	Microscopie électronique Sciences	65575-02